Рослина пшениці з підвищеною резистентністю до імідазолінонових гербіцидів

Реферат: Винахід належить до рослини пшениці з підвищеною резистентністю до імідазолінонового гербіциду. Даний винахід охоплює пшеничні культури, які містять ІMI нуклеїнову кислоту, яка являє собою В-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi2) нуклеїнову кислоту. Даний винахід також охоплює насіння, вироблене цими пшеничними культурами, та способи контролю над бур'янами в оточенні цих пшеничних культур. UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця заявка заявляє пріоритет попередньої заявки США №60/311,282, поданої 9 серпня 2001р. Даний винахід у цілому стосується рослин, які мають підвищену резистентність до імідазолінонових гербіцидів. Тобто даний винахід стосується пшеничних культур, одержаних шляхом мутагенезу та кросбридингу і перетворення, які мають підвищену резистентність до імідазолінонових гербіцидів. Синтаза ацетогідроксіоцтової кислоти (AHAS; EC 4.1.3.18) є першим ферментом, який каталізує біохімічний синтез амінокислот з розгалуженими ланцюгами валіну, лейцину та ізолейцину (Singh В.K., 1999 Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh В.K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, New York. Pg.227-247). AHAS є місцем дії чотирьох різних за структурою груп гербіцидів, включаючи сульфонілсечовини (LaRossa RA and Falco SC, 1984 Trends Biotechnol 2:158-161), імідазолінони (Shaner et al., 1984 Plant Physiol 76:545-546), триазолопіримідини (Subramanian and Gerwick, 1989 Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines in (ed) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, D.C. Pg.277-288) та піримідилоксибензоати (Subramanian et al., 1990 Plant Physiol 94: 239-244.). Імідазолінонові та сульфонілсечовинні гербіциди широко застосовують у сучасному сільському господарстві завдяки їхній ефективності при дуже низьких нормах внесення та відносній нетоксичності для тварин. Шляхом інгібування активності AHAS ці групи гербіцидів перешкоджають ростові та розвиткові чутливих до них рослин, включаючи багато видів бур'янів. Прикладами імідазолінонових гербіцидів серійного виробництва є PURSUIT® (імазетапір), SCEPTER® (імазахін) та ARSENAL® (імазапір). Приклади сульфонілсечовинних гербіцидів є хлорсульфурон, метсульфурон-метил, сульфометурон-метил, хлоримурон-етил, трифенсульфурон-метил, трибенурон-метил, бенсульфурон-метил, нікосульфурон, етаметсульфурон-метил, римсульфурон, трифлусульфурон-метил, триасульфурон, примісульфурон-метил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон-етил та галосульфурон. Завдяки їх високій ефективності та низькій токсичності, імідазоліноновим гербіцидам віддають перевагу, коли йдеться про нанесення шляхом розпилення над широкими площами рослинних культур. Можливість розпилення гербіциду над великими площами рослинних культур знижує витрати, пов'язані зі створенням плантацій та доглядом за ними і зменшує потребу в підготуванні місця до застосування таких хімікатів. Розпилення над потрібними толерантними видами в результаті також забезпечує можливість досягнення максимального врожаю потрібних культур завдяки відсутності конкуруючих видів. Однак, можливість застосування таких способів розпилення залежить від наявності резистентних до імідазолінону видів потрібних рослин на площі розпилення. Серед основних сільськогосподарських культур деякі види зернобобових, такі як соя, мають природну резистентність до імідазолінонових гербіцидів завдяки їх здатності до швидкого засвоєння гербіцидних сполук (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33:469-471). Інші культури, такі як кукурудза (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882-886) та рис (Barrette et al., 1989 Crop Safeners for Herbicides, Academic Press New York, pp.195-220), певною мірою є чутливими до імідазолінонових гербіцидів. Розбіжності в чутливості до імідазолінонових гербіцидів залежать від хімічної природи конкретного гербіциду та характеру метаболізму сполуки від токсичної до нетоксичної форми в кожній рослині (Shaner et al., 1984 Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al., 1987 Pestic. Biochm. Physiol. 27:24-29). Інші фізіологічні розбіжності рослин, такі як абсорбція та транслокація, також відіграють важливу роль у чутливості (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33:469-471). Культурні сорти, резистентні до імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазолопіримідинів, успішно виводилися з застосуванням насіння, мікроспор, пилку та мутагенезу калюсу в Zea mays, Arahidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, and Nicotiana tabacum (Sebastian et al., 1989 Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al., 1991 Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al., 1991 Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al., 1993 J. Heredity 84: 91-96). В усіх випадках резистентність забезпечував єдиний, частково домінантний ядерний ген. Раніше також були виведені чотири резистентні до імідазолінону пшеничні культури після мутагенезу насіння Triticum aestivum L. cv Fidel (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882-886). Дослідження успадкування підтвердили, що єдиний, частково домінантний ген забезпечував резистентність. На основі алельних досліджень автори дійшли висновку, що мутації в чотирьох ідентифікованих лініях містилися в одному місці. Один з генів резистентності культури Fidel було позначено як FS-4 (Newhouse et al., 1992 Plant Physiol. 100:882-886). 1 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Комп'ютерне моделювання тривимірної конформації комплексу AHAS-інгібітора передбачає кілька амінокислот у запропонованій кишені зв'язування інгібітора як місця, де викликані мутації можуть забезпечувати вибіркову резистентність до імідазолінонів (Ott et al., 1996 J. Моl. Biol. 263:359-368) Пшеничні культури, одержані за допомогою деяких із цих раціонально спланованих мутацій у запропонованих місцях зв'язування ферменту AHAS, фактично інгібували специфічну резистентність до єдиного класу гербіцидів (Ott et al., 1996 J. Моl. Biol. 263:359-368). Про резистентність рослин до імідазолінонових гербіцидів також повідомлялося в багатьох патентах. У патентах США №№4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 та 6,222,100 у загальних рисах описано застосування зміненого гена AHAS для викликання резистентності до гербіцидів у рослинах і докладно описано деякі резистентні до імідазолінону лінії кукурудзи. У патенті США №5,013,659 описано рослини, які виявляють резистентність до гербіцидів і мають мутації у принаймні одній амінокислоті в одній або кількох збережених ділянках. Описані в ньому мутації кодують або перехресну резистентність до імідазолінонів та сульфонілсечовин або специфічну до сульфонілсечовини резистентність, але специфічна до імідазолінону резистентність не описується. Крім того, в патенті США №5,731,180 та патенті США №5,767,361 обговорюється виділений ген, який має єдине амінокислотне заміщення в амінокислотній послідовності AHAS однодольних дикого типу, яка в результаті забезпечує специфічну до імідазолінону резистентність. До цього часу в роботах існуючого рівня техніки не було описано резистентних до імідазолінону пшеничних культур, які містять більше одного зміненого гена AHAS. Так само в роботах існуючого рівня техніки не було описано резистентних до імідазолінону пшеничних культур, які містять мутації в геномах, крім геному, від якого походить ген FS-4. Таким чином, дана галузь потребує ідентифікації генів резистентності до імідазолінону з додаткових геномів. Дана галузь також потребує пшеничних культур, які мають підвищену резистентність до гербіцидів, таких як імідазолінон, і містять більше одного зміненого гена AHAS. Потрібні також способи контролю над ростом бур'янів поблизу від таких пшеничних культур. Ці композиції та способи дозволяють застосовувати технології розпилення при нанесенні гербіцидів на площі з пшеничними культурами. Даний винахід забезпечує пшеничні культури, які включають ІМІ нуклеїнові кислоти, причому пшенична культура має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу. Пшеничні культури можуть містити одну, дві, три або більше ІМІ нуклеїнових кислот. В одному варіанті втілення пшенична культура включає кілька ІМІ нуклеїнових кислот, які містяться в різних геномах. В оптимальному варіанті ІМІ нуклеїнові кислоти кодують білки, які включають мутацію в консервативній амінокислотній послідовності, вибраній з групи, яка складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е. У ще кращому варіанті мутація міститься в консервативному Домені Е або консервативному Домені С Забезпечуються також частини рослин та насіння рослин, отримані від описаних авторами пшеничних культур. В іншому варіанті втілення пшенична культура включає ІМІ нуклеїнову кислоту, яка не є Imi1 нуклеїновою кислотою. IMI нуклеїнова кислота може бути, наприклад, Imi2 або Imi3 нуклеїновою кислотою. ІМІ нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть включати нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з: полінуклеотиду SEQ ID NO:1; полінуклеотиду SEQ ID NO:3; полінуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:2; полінуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4, полінуклеотиду, який включає принаймні 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з вищезгаданих полінуклеотидів; та полінуклеотиду, комплементарного будь-якому з вищезгаданих полінуклеотидів. Рослини даного винаходу можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Прикладами нетрансгенних пшеничних культур з підвищеною резистентністю до імідазолінонових гербіцидів є пшенична культура, яка має Номер патентного депонування АТСС РТА-3953 або РТА-3955; або мутантна, рекомбінантна або піддана генній інженерії похідна рослини з номером патентного депонування АТСС РТА-3953 або РТА-3955; або будь-якого потомства рослини з номером патентного депонування АТСС РТА-3953 або РТА-3955; або рослина, яка є потомством будь-якої з цих рослин. Крім композицій даного винаходу, забезпечується кілька способів. Авторами описано способи зміни толерантності рослини до імідазолінонового гербіциду, які включають зміну експресії ІМІ нуклеїнової кислоти в рослині. Описано також способи одержання трансгенної рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, які включають перетворення рослинної клітини вектором експресії, що включає одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот, та вирощування рослини з рослинної клітини. Винахід також охоплює спосіб 2 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контролю над бур'янами в оточенні пшеничної культури, який включає нанесення імідазолінонового гербіциду на бур'яни та пшеничну культуру, причому пшенична культура має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з сортом пшеничної культури дикого типу, і рослина містить одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот. У деяких оптимальних варіантах втілення цих способів рослини включають множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, які містяться в різних геномах пшениці. Фігура 1 є таблицею, на якій показано результати оцінки резистентності однієї рослини до імазамоксу в популяціях батьківської рослини та покоління Fi, одержаного в результаті взаємного схрещування між резистентними лініями та CDC Teal. Цифри означають кількість рослин, занесених до кожного фенотипічного класу. Батьківські лінії позначено жирним шрифтом. Кількість батьківських ліній включає лінії, зараховані до популяцій F2. Фігура 2 є таблицею, на якій показано реакцію на імазамокс у популяціях F2 та BCFi, одержаних у результаті схрещування між резистентними лініями та CDC Teal., і результати тестів Chi-square однолокусних та дволокусних моделей (15А х Teal) для контролю резистентності. Символи, використані на Фігурі 2, означають: а - значення Р Chi-square (1 df) представляє ймовірність того, що відхилення від випробуваного співвідношення зумовлюються лише випадком. Значення Р Chi-squares, більші за 0,05, вказують на те, що значення, які спостерігалися, не мали значних відмінностей від очікуваних значень; b - значення Р Chi-square, яке представляє ймовірність того, що відхилення між популяціями F2, одержаними в результаті взаємного схрещування між CDC Teal та резистентними лініями, зумовлюються лише випадком. Значення Chi-square, більші за 0,05, вказують на те, що взаємні популяції F2 були гомогенними, і дані між двома взаємними популяціями були об'єднані; с - CDC Teal використовували як повторну батьківську рослину; d - випробувані співвідношення ґрунтувалися на результатах покоління F2; і є – значення Р Chi-square (I df) для співвідношення BCF1. Фігура 3 є таблицею, на якій показано результати оцінки резистентності до імазамоксу в групах F2:3 У результаті схрещування між резистентними лініями та CDC Teal., і результати тестів Chi-square однолокусних та дволокусних моделей (15А х Teal) для контролю резистентності. Символи, використані на Фігурі 3, означають: а - випробувані співвідношення сегрегації в групі ґрунтувалися на результатах популяцій F2 та BCF1; b - значення Р Chi-square (2 df), яке представляє ймовірність того, що відхилення від випробуваного співвідношення зумовлюються лише випадком. Значення Р Chi-squares, більші за 0,05, вказують на те, що значення, які спостерігалися, не мали значних відмінностей від очікуваних значень. Фігура 4 є таблицею, на якій показано результати оцінки резистентності однієї рослини до імазамоксу в популяціях F2 у результаті взаємного схрещування між резистентними лініями. Співвідношення згідно з тестом Chi-square ґрунтувалися на результатах у групах F2 та F2:3, одержаних від схрещування між резистентними лініями та CDC Teal. Випробуване співвідношення 15:1 стосується дволокусної моделі, а випробуване співвідношення 63:1 стосується трилокусної моделі. Символ "а", використаний на Фігурі 4, означає: значення Р Chisquare (1 df), яке представляє ймовірність того, що відхилення від випробуваного співвідношення зумовлюються лише випадком. Значення Р Chi-squares, більші за 0,05, вказують на те, що значення, які спостерігалися, не мали значних відмінностей від очікуваних значень. Фігура 5 є таблицею, на якій показано результати оцінки імазамоксу резистентність у групах F2:3 у результаті сегрегуючого взаємного схрещування між резистентними лініями. Символи, використані на Фігурі 5, означають: а - випробувані співвідношення сегрегації в групі ґрунтувалися на результатах досліджених популяцій F2; b - значення Р Chi-square (2 df), яке представляє ймовірність того, що відхилення від випробуваного співвідношення зумовлюються лише випадком. Значення Р Chi-squares, більші за 0,05, вказують на те, що значення, які спостерігалися, не мали значних відмінностей від очікуваних значень. Фігура 6 є таблицею з порівнянням відсотка неінгібованої in vitro активності AHAS у чотирьох лініях пшениці у присутності зростаючих концентрацій імідазолінонового гербіциду імазамокс. Teal є лінією дикого типу без толерантності до імідазолінонових гербіцидів, тоді як BW755 містить FS4 мутантний ген. Фігура 7 є таблицею з порівнянням витримування ураження трьома генотипами пшениці, обробленими імазамоксом у кількості 10Х або 30Х. Норма 1Х становить 20 г/га. BW755 містить FS4 мутантний ген. 15А/11А є основною кількістю змішаного потомства від схрещування Teal 11А та Teal 15А. Популяція ще не була гомозиготною в усіх трьох неалельних локусах. Фігура 8 показує лінійне розташування послідовності ДНК часткових генів пшениці Als1 та Imi1, ампліфікованих із геномної ДНК: CDC Teal (рядок 2; SEQ ID NO:15 і SEQ ID NO:16), BW755 (рядок 3; SEQ ID NO:17 і SEQ ID NO:18), Teal IMI 10A (рядок 4; SEQ ID NO:19 і SEQ ID NO:20), 3 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Teal IMI 11A (рядок 5; SEQ ID NO:21 і SEQ ID NO:22) і Teal IMI 15A (рядок 6; SEQ ID NO:23 і SEQ ID NO:24). Часткові послідовності суміщали з повною послідовністю гена рису ALS (рядок 1; SEQ ID NO:13 і SEQ ID NO:14), отриманого з банку генів (інвентарний номер АВО49822) і переносили на білкові послідовності (представлені над послідовностями ДНК). П'ять висококонсервативних амінокислотних доменів, що містять мутації, які забезпечують резистентність до інгібіторів AHAS, позначено жирним шрифтом. Заміщення гуанідину аденіном у BW755, Teal IMI 10A та Teal IMI 15A ведуть до заміщення серину аспарагіном (серин 627 у рисі) в домені IPSGG (Домен Е) Alsl гена. Відповідно, гени резистентності, присутні у рослинах BW755, Teal IMI 10A та Teal IMI 15А, були вказані як частина mil класу. Ці гени резистентності Teal вказуються авторами як Teal IMI 1 10А та Teal IMI 1 15 А. Фігура 9 показує лінійне розташування послідовності ДНК часткових генів пшениці Als2 та Imi2, ампліфікованих із геномної ДНК: CDC Teal (рядок 2; SEQ ID NO:25 і SEQ ID NO:26), BW755 (рядок 3; SEQ ID NO:27 і SEQ ID NO:28), Teal IMI 10A (рядок 4; SEQ ID NO:29 і SEQ ID NO:30), Teal IMI 11A (рядок 5; SEQ ID NO:31 і SEQ ID NO:32) і Teal IMI 15A (рядок 6; SEQ ID NO:33 і SEQ ID NO:34). Часткові послідовності AHAS суміщали з повною послідовністю AHAS рису (рядок 1; SEQ ID NO:13 і SEQ ID NO:14), отриманою з банку генів (інвентарний номер АВ049822) і переносили в білкові послідовності (представлені над послідовностями ДНК). П'ять висококонсервативних амінокислотних доменів, що містять мутації, які забезпечують резистентність до інгібіторів AHAS, позначено жирним шрифтом. Заміщення гуанідину аденіном у Teal IMI 11 А в результаті веде до заміщення серину аспарагіном (серин 627 у рисі) в домені IPSGG Als2 гена. Відповідно, ген резистентності, присутній у рослині Teal IMI 11А, було вказано як частину класу Imi2 нуклеїнових кислот. Цей ген резистентності Teal вказано авторами як Теаl ІМІ2 11 А. Фігура 10 показує часткову послідовність ДНК Teal IMI 1 15А (SEQ ID NO:1) та виведену з неї амінокислотну послідовність (SEQ ID NO:2). Фігура 11 показує часткову послідовність ДНК Теаl ІМІ2 НА (SEQ ID NO:3) та виведену з неї амінокислотну послідовність (SEQ ED NO:4). Фігура 12 показує нуклеїново кислотну послідовність Teal ALS1 ORF дикого типу (SEQ ID NO:5), Teal ALS2 ORF (SEQ ID NO:6) Teal ALS3 ORF (SEQ ID NO:7). Фігура 13 є схематичним зображенням консервативних амінокислотних послідовностей в AHAS генах, пов'язаних із резистентністю до різних інгібіторів AHAS. Конкретну амінокислотну ділянку, яка відповідає за резистентність, позначено підкресленням. (Modified from Devine, M.D. and Eberlein, С.V., 1997 Physiological., biochemical and molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites in Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amsterdam, p.159-185). Даний винахід стосується пшеничних культур, частин пшеничних культур та клітин пшеничних культур з підвищеною резистентністю до імідазолінонових гербіцидів. Даний винахід також охоплює насіння, вироблене описаними авторами пшеничними культурами, та способи контролю над бур'янами в оточенні описаних авторами пшеничних культур. Слід розуміти, що вжита в описі та формулі форма однини може означати як однину, так і множину, залежно від контексту, в якому її вжито. Так, наприклад, посилання на "клітину" може означати використання принаймні однієї клітини. Вжитий авторами термін "пшенична культура" стосується рослини, яка належить до роду Triticum. Пшеничні культури даного винаходу можуть належати до роду Triticum, включаючи, крім інших, Т. aestivum, Т. turgidum, T. timopheevii, T. monococcum, Т. zhukovskyi та Т. urartu і їх гібриди. Прикладами підвиду Т. aestivum, які охоплюються даним винаходом, є aestivum (пшениця звичайна), compaction (карликова пшениця), macha (пшениця маха), vavilovi (пшениця Вавілова), spelta та sphaecrococcum (пшениця спельта). Прикладами підвиду Т. turgidum, які охоплюються даним винаходом, є turgidum, carthlicum, dicoccon, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum та dicoccoides. Прикладами підвиду Т. monococcums, які охоплюються даним винаходом, є топососсит (einkom) та aegilopoides. В одному варіанті втілення даного винаходу пшенична культура належить до виду Triticum aestivum species, точніше, сорту CDC Teal. Термін "пшенична культура" охоплює пшеничні культури на будь-якій стадії стиглості або розвитку, а також будь-які тканини або органи (частини рослин), взяті або одержані від будь-якої подібної рослини, якщо в контексті прямо не вказано іншого. До частин рослин належать, крім інших, стебла, коріння, квітки, насінні зачатки, тичинки, листя, зародки, ділянки меристеми, тканина калюсу, культури пиляка, гаметофіти, спорофіти, пилок, мікроспори, протопласти та ін. Даний винахід також охоплює насіння, вироблене пшеничними культурами даного винаходу. В одному варіанті втілення насіння одержують шляхом розведення гомозигот для підвищеної 4 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 резистентності до імідазолінонового гербіциду порівняно з насінням сорту пшеничної культури дикого типу. У даному винаході описано пшеничну культуру, яка включає одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот, причому пшенична культура має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу. Вжитий авторами термін "ІМІ нуклеїнова кислота" стосується нуклеїнової кислоти, яка є мутованою від нуклеїнової кислоти AHAS у пшеничній культурі дикого типу, і яка надає підвищеної резистентності до імідазолінону рослині, в якій вона транскрибується. Нуклеїнові кислоти AHAS Teal дикого типу показано в SEQ ID NO:5 (Teal ALS1 ORF), SEQ ID NO:6 (Teal ALS2 ORF) і SEQ ID NO:7 (Teal ALS3 ORF). В одному варіанті втілення пшенична культура включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти. Вжитий в описі ІМІ нуклеїнових кислот термін "множинні" стосується ІМІ нуклеїнових кислот, які мають різні нуклеотидні послідовності і не стосується простого збільшення кількості однієї ІМІ нуклеїнової кислоти. Наприклад, ІМІ нуклеїнові кислоти можуть бути різними через те, що вони походять із різних геномів або містяться в різних геномах пшениці. Пшеничні культури даного винаходу можуть мати множинні ІМІ нуклеїнові кислоти з різних геномів, оскільки ці рослини можуть містити більше одного геному. Наприклад, пшенична культура Triticum aestivum містить три геноми, які іноді називають геномами А, В та D. Оскільки AHAS є потрібним метаболічним ферментом, то вважається, що геном має принаймні один ген, який кодує фермент AHAS, який зазвичай спостерігається з іншими метаболічними ферментами в гексаплоїдній пшениці, підданій картуванню. Нуклеїнова кислота AHAS у кожному геномі може відрізнятися і зазвичай відрізняється своєю нуклеотидною послідовністю від нуклеїнової кислоти AHAS в іншому геномі. Спеціаліст у даній галузі може визначити геном походження кожної нуклеїнової кислоти AHAS, застосовуючи генетичний кросинг та/або інші способи секвенування або гідроліз екзонуклеази, які відомі спеціалістам, а також описані нижче у Прикладі 2. З точки зору цього винаходу, ІМІ нуклеїнові кислоти, які походять із одного з геномів А, В або D, розпізнають і позначають як нуклеїнові кислоти Imi1, Imi2 або Imi3. Автори не стверджують, що будь-який конкретний клас ІМІ нуклеїнової кислоти співвідноситься з будь-яким конкретним геномом А, В або D. Наприклад, автори не стверджують, що Imi1 нуклеїнові кислоти співвідносяться з нуклеїновими кислотами геному А, що Imi2 нуклеїнові кислоти співвідносяться з нуклеїновими кислотами геному В і т. д. Позначення Imi1, Imi2 та Imi3 лише вказують, що ІМІ нуклеїнові кислоти в межах кожного такого класу не виділяються незалежно, тоді як дві ІМІ нуклеїнові кислоти різних класів виділяються незалежно і, таким чином, можуть походити з різних геномів пшениці. Клас Imi1 нуклеїнових кислот включає FS-4 ген, як описано в роботі Newhouse et al. (1992 Plant Physiol. 100:882-886), та ген Teal Imi1 15A, детальніше описаний нижче. Клас Imi2 нуклеїнових кислот включає ген Теаl ІМІ2 11А, описаний нижче. Кожен Imi клас може включати члени інших видів пшениці. Отже, кожен Imi клас включає ІМІ нуклеїнові кислоти, які відрізняються за своєю нуклеотидною послідовністю, але, незважаючи на це, позначаються як такі, що походять або містяться в одному геномі пшениці, на основі дослідження успадкування, як описано нижче у Прикладах і відомо спеціалістам у даній галузі. Відповідно, даний винахід охоплює пшеничну культуру, яка включає одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот, причому пшенична культура має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу, і одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот вибирають із групи, яка складається з нуклеїнової кислоти Imi1, Imi2 та Imi3. В одному варіанті втілення рослина містить Imi1 нуклеїнову кислоту та Imi3 нуклеїнову кислоту. В оптимальному варіанті втілення Imi1 нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO:1. В іншому варіанті втілення рослина містить Imi2 нуклеїнову кислоту. В оптимальному варіанті втілення Imi2 нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO:3. Вжитий авторами відносно до нуклеїнових кислот термін "із" стосується нуклеїнової кислоти, яка "міститься у" або "походить із" конкретного геному. Термін "міститься у" стосується нуклеїнової кислоти, яка міститься в межах конкретного геному. Також вжитий авторами відносно до геному термін "походить із" стосується нуклеїнової кислоти, видаленої або виділеної з цього геному. Термін "виділений" детальніше визначено нижче. В іншому варіанті втілення пшенична культура включає ІМІ нуклеїнову кислоту, причому ця нуклеїнова кислота не є Imi1 нуклеїновою кислотою. Термін "не Imi1" стосується ІМІ нуклеїнової кислоти, яка не належить до Imi1 класу, як описано вище. Приклади нуклеїнових кислот Imi1 класу показано в рядках 3, 4 та 5 на Фігурі 8. Один приклад не Imi1 нуклеїнової кислоти показано в рядку 5 на Фігурі 8. Відповідно, в оптимальному варіанті втілення пшенична культура містить ІМІ нуклеїнову кислоту, яка включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує 5 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептид SEQ ID NO:4. Полінуклеотидна послідовність може включати послідовність, показану в SEQ ID NO:3. Даний винахід включає пшеничні культури, які містять одну, дві, три або більше ІМІ нуклеїнових кислот, причому пшенична культура має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу. ІМІ нуклеїнові кислоти можуть включати нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з полінуклеотиду SEQ ID NO:1; полінуклеотиду SEQ ID NO:3; полінуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид SEQ ED NO:2; полінуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4, полінуклеотиду, який включає принаймні 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з вищезгаданих полінуклеотидів; та полінуклеотиду, комплементарного будь-якому з вищезгаданих полінуклеотидів. Імідазоліноновий гербіцид може бути вибраний, крім інших, з-поміж, PURSUIT® (імазетапір), CADRE® (імазапіку), RAPTOR® (імазамокс), SCEPTER® (імазахін), ASSERT® (імазетабензу), ARSENAL® (імазапір), похідної будь-якого з вищезгаданих гербіцидів або суміші двох або більшої кількості вищезгаданих гербіцидів, наприклад, імазапіру/імазамоксу (ODYSSEY®). Точніше, імідазоліноновий гербіцид може бути вибраний, крім інших, з-поміж, 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін2-іл)-3-хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинової кислоти, та суміші метил 6-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-m-толуату і метил 2-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-р-толуату. Перевагу віддають застосуванню 5-етил2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти та 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти. Особливу перевагу віддають застосуванню 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти. В одному варіанті втілення пшенична культура містить дві ІМІ нуклеїнові кислоти, причому нуклеїнові кислоти походять із або містяться в різних геномах пшениці. В оптимальному варіанті однією з двох нуклеїнових кислот є Imi1 нуклеїнова кислота, краще – якщо вона включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. В іншому варіанті втілення пшенична культура містить одну ІМІ нуклеїнову кислоту, причому нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. У ще одному варіанті втілення пшенична культура містить три або більше ІМІ нуклеїнових кислот, причому кожна нуклеїнова кислота походить із свого геному. В оптимальному варіанті принаймні одна з трьох ІМІ нуклеїнових кислот включає полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3. В оптимальному варіанті втілення даного винаходу одна або кілька ІМІ нуклеїнових кислот, які містяться в рослині, кодують амінокислотну послідовність, яка включає мутацію в домені, збереженому серед кількох білків AHAS. Ці консервативні домени вказуються авторами як Домен А, Домен В, Домен С, Домен D та Домен Е. Фігура 13 показує загальне розташування кожного домену в білку AHAS. Вжитий авторами термін Домен А містить амінокислотну послідовність AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:8); Домен В містить амінокислотну послідовність QWED (SEQ ID NO:9); Домен С містить амінокислотну послідовність VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:10); Домен D містить амінокислотну послідовність AFQETP (SEQ ID NO:11); Домен Е містить амінокислотну послідовність IPSGG (SEQ ID NO:12). Даний винахід також передбачає можливість незначних відхилень у консервативних доменах, наприклад, у куколі сериновий залишок у Домені Е заміщено аланіновим залишком. Відповідно, даний винахід охоплює пшеничну культуру, яка включає ІМІ нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка має мутацію в консервативному Домені, вибраному з групи, яка складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е. В одному варіанті втілення пшенична культура містить ІМІ нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, яка має мутацію в Домені Е. В інших оптимальних варіантах втілення мутації в консервативних доменах трапляються в місцях, позначених таким підкресленням: AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:8); QWED (SEQ ID NO:9); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:10); AFQETP (SEQ ID NO:11) та IPSGG (SEQ ID NO:12). Оптимальним заміщенням є аспарагін замість серину в Домені Е (SEQ ID NO:12). Описані авторами пшеничні культури можуть бути або трансгенними пшеничними культурами, або нетрансгенними пшеничними культурами. Вжитий авторами термін "трансгенний" стосується будь-якої рослини, рослинної клітини, калюсу, рослинної тканини або частини рослини, що містить, повністю або частково, принаймні один рекомбінантний полінуклеотид. У багатьох випадках рекомбінантний полінуклеотид, частково або повністю, є 6 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стабільно включеним у хромосому або стійкий позахромосомний елемент таким чином, що він передається наступним поколінням. З точки зору винаходу термін "рекомбінантний полінуклеотид" стосується полінуклеотиду, який було змінено, перебудовано або модифіковано шляхом генної інженерії. Прикладами є будь-який клонований полінуклеотид або полінуклеотиди, які є зв'язаними або приєднаними до гетерологічних послідовностей. Термін "рекомбінантний" не стосується змін полінуклеотидів, які є результатом природних подій, таких як спонтанні мутації, або неспонтанного мутагенезу з наступною селекцією. Рослини, які містять мутації, що виникають внаслідок неспонтанного мутагенезу та селекції, вказуються авторами як нетрансгенні рослини і охоплюються даним винаходом. У варіантах втілення, в яких пшенична культура є трансгенною і містить множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, нуклеїнові кислоти можуть походити з різних геномів або одного геному. Або ж у варіантах втілення, в яких пшенична культура є нетрансгенною і містить множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, нуклеїнові кислоти містяться в різних геномах. Прикладом нетрансгенного сорту пшеничної культури, що містить одну ІМІ нуклеїнову кислоту, є сорт рослини, депонований в АТСС під номером патентного депонування РТА-3953 і вказаний авторами як сорт пшениці Теаl ІМІ ПА. Сорт пшениці Теаl ІМІ НА містить Іmі2 нуклеїнову кислоту. Часткову нуклеотидну та виведену амінокислотну послідовності, які відповідають генові Теаl ІМІ2 11 А, показано в SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4, відповідно. Єдиним типом послідовностей, не включених до SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4, є послідовності, які кодують і відповідають сигнальній послідовності, яка відщеплюється від зрілого білка Теаl ІМІ2 ПА. Відповідно, SEQ ID NO:4 являє собою повну виведену послідовність зрілого білка Теаl ІМI2 11А. Прикладом сорту пшеничної культури, який містить дві ІМІ нуклеїнові кислоти в різних геномах, є сорт рослини, депонований в АТСС під номером патентного депонування РТА-3955 і вказаний авторами як сорт пшениці Теаl ІМІ 15А. Сорт пшениці Теаl ІМІ 15А містить Imi1 та Imi 3 нуклеїнові кислоти. Imi1 нуклеїнова кислота включає мутацію, яка веде до заміни серину на аспарагін у кодованому нею ІМІ білку. Мутовані гени AHAS позначено авторами як Теаl ІМІ1 15А та Теаl ІМІ3 15А. Часткову нуклеотидну та виведену амінокислотну послідовності, які відповідають генові Teal Imi1 15A, показано в SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, відповідно. Єдиним типом послідовностей, не включених до SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:2, є послідовності, які кодують і відповідають приблизно 100-150 парам основ на 5' кінці і приблизно 5 парам основ на 3' кінці кодуючої ділянки. Окремі депонування 2500 зразків насіння сортів пшениці Теаl ІМІ 11А та Теаl ІМІ 15А було зроблено в Американському зібранні типових культур, Манассас, Вірджинія, 3 січня 2002р. Ці депонування було зроблено згідно з умовами Будапештської угоди стосовно депонування мікроорганізмів. Депонування було зроблено на термін не менше тридцяти років і не менше п'яти років після отримання АТСС останнього запиту про надання депонованого зразка. Депоновані зразки насіння отримали номери патентного депонування РТА-3953 (Теаl ІМІ 11 А)таРТА-3955 (Теаl ІМІ 15А). Даний охоплює пшеничну культуру, яка має номер патентного депонування РТА-3953 або РТА-3955; мутантну, рекомбінантну або піддану генній інженерії похідну рослини з номером патентного депонування РТА-3953 або РТА-3955; будь-яке потомство з номером патентного депонування РТА-3953 або РТА-3955; та рослину, яке є потомством будь-якої з цих рослин. В оптимальному варіанті втілення пшенична культура даного винаходу додатково має характеристики резистентності до гербіцидів, як у рослини з номером патентного депонування РТА-3953 або РТА-3955. Даний винахід також охоплює описані авторами гібриди сортів пшениці Теаl ІМІ 11А та Теаl ІМІ 15А. Приклад 5 демонструє Теаl ІМІ 11А/Теаl ІМІ 15А гібриди з підвищеною резистентністю до імідазолінонового гербіциду. Даний винахід також охоплює гібриди сортів пшениці Теаl ІМІ 11А або Теаl ІМІ 15As та іншого сорту пшениці. До інших сортів пшениці належить, крім інших, Т. aestivum L. cv Fidel та будь-який сорт пшениці, який містить мутантний ген FS-1, FS-2, FS-3 або FS-4. (див. патент США №6,339,184 та патентну заявку США №08/474,832). В оптимальному варіанті втілення пшенична культура є гібридом між сортом Теаl ІМІ 11А та сортом Fidel FS-4. Гібриди Теаl ІМІ 11A/FS-4 містять Imi1 нуклеїнову кислоту та Imi2 нуклеїнову кислоту. Гібрид Теаl ІМІ 11А та сорту Fidel, який містить FS-4 ген, охоплюється даним винаходом і є депонованим в Американському зібранні типових культур, Манассас, Вірджинія, 3 січня 2002р. Це депонування було зроблено згідно з умовами Будапештської угоди стосовно депонування мікроорганізмів. Депонування було здійснено на термін не менше тридцяти років і не менше п'яти років після отримання АТСС останнього запиту про надання депонованого зразка. Депоноване насіння отримало номер патентного депонування РТА-3954. 7 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Терміни "сорт" та "різновид" стосуються групи рослин у межах виду, які мають певну кількість спільних характеристик або особливостей, які спеціалістами вважаються достатніми для відрізнення одного сорту або різновиду від іншого сорту або різновиду. Жоден з термінів не передбачає, що всі рослини будь-якого даного сорту або різновиду є генетично ідентичними на рівні повного гена або на молекулярному рівні, або що будь-яка дана рослина є гомозиготною в усіх локусах. Сорт або різновид вважають "розведенням гомозигот" для конкретної особливості, якщо в разі, коли гомозиготний сорт або різновид є самозапилюваним, усе потомство має цю особливість. У даному винаході особливість виникає внаслідок мутації в гені AHAS пшеничної культури або насіння. Слід розуміти, може включати дикий або немутований ген AHAS додатково до ІМІ гена. Як описано у Прикладі 4, передбачається, що сорт пшениці Teal IMI 11A містить мутацію лише в одному з множинних AHAS ізоферментів, і що сорт пшениці Teal IMI 15 А містить мутацію лише у двох із множинних AHAS ізоферментів. Отже, даний винахід охоплює пшеничну культуру, яка включає одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот додатково до однієї або кількох диких або немутованих нуклеїнових кислот AHAS. Крім пшеничних культур, даний винахід охоплює виділені ІМІ білки та нуклеїнові кислоти. Нуклеїнові кислоти включають полінуклеотид, вибраний з групи, яка складається з полінуклеотиду SEQ ID NO:1; полінуклеотиду SEQ ID NO:3; полінуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:2; а полінуклеотидної послідовності, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4, полінуклеотиду, який включає принаймні 60 послідовних нуклеотидів будь-якого з вищезгаданих полінуклеотидів; та полінуклеотиду, комплементарного будь-якому з вищезгаданих полінуклеотидів. В оптимальному варіанті втілення ІМІ нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4. В іншому оптимальному варіанті втілення ІМІ нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. Термін "білок AHAS" стосується білка синтази ацетогідроксіоцтової кислоти, а термін "ІМІ білок" стосується будь-якого білка AHAS, який є мутованим від білка AHAS дикого типу і який надає більшої резистентності до імідазолінону рослині, рослинній клітині, частині рослини, насінню рослини або рослинній тканині, якщо він у них експресується. В оптимальному варіанті втілення ІМІ білок включає поліпептид SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4. Також вжиті авторами терміни "нуклеїнова кислота" та "полінуклеотид" стосуються РНК або ДНК, яка є лінійною або розгалуженою, одно- або дволанцюговою, або їх гібриду. Термін також охоплює гібриди РНК/ДНК. Ці терміни також охоплюють нетрансльовану послідовність, розміщену на 3' та 5' кінцях кодуючої ділянки гена: принаймні близько 1000 нуклеотидів послідовності перед 5' кінцем кодуючої ділянки, і принаймні близько 200 нуклеотидів послідовності після 3' кінця кодуючої ділянки гена. Менш поширені основи, такі як інозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенін, гіпоксантин та інші, також можуть бути використані для антисмислового, dsPHK- та рибозимного спарювання. Наприклад, було виявлено, що полінуклеотиди, які містять С-5 пропінові аналоги уридину та цитидину, зв'язуються з РНК з високою спорідненістю і є сильними антисмисловими інгібіторами експресії генів. Також здійснюють інші модифікації, наприклад модифікацію фосфодіестерного основного ланцюга або 2'-гідрокси у групі рибози РНК. Антисмислові полінуклеотиди та рибозими можуть складатися повністю з рибонуклеотидів або можуть містити змішані рибонуклеотиди та деоксирибонуклеотиди. Полінуклеотиди винаходу одержують будьякими способами, включаючи одержання геномних препаратів, кДНК-препаратів, in vitro синтез, RT-ПЛР та in vitro або in vivo транскрипцію. "Виділеною" молекулою нуклеїнової кислоти є молекула, яка є практично відокремленою від інших молекул нуклеїнових кислот, присутніх у природному джерелі нуклеїнової кислоти (тобто послідовностей, які кодують інші поліпептиди). В оптимальному варіанті "виділена" нуклеїнова кислота є вільною від деяких із послідовностей, які у природі є фланкуючими на нуклеїновій кислоті (тобто послідовностей, розміщених на 5' та 3' кінцях нуклеїнової кислоти) в її природному репліконі. Наприклад, клоновану нуклеїнову кислоту вважають виділеною. У різних варіантах втілення виділена молекула ІМІ нуклеїнової кислоти може містити менше, ніж приблизно 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb або 0,1 kb нуклеотидних послідовностей, які у природі є фланкуючими на молекулі нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітині, з якої походить нуклеїнова кислота (наприклад, клітини Triticum aestivum). Нуклеїнову кислоту також вважають виділеною, якщо її було змінено через втручання людини або поміщено в локус або місце, яке не є її природним місцем, або якщо її було введено у клітину шляхом агроінфекції або біолістики. Крім того, "виділена" молекула нуклеїнової кислоти, така як молекула кДНК, може бути вільною від деякого іншого клітинного матеріалу, з яким вона пов'язана у природі, або 8 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 культурального середовища, якщо її одержують рекомбінантними способами, або хімічних попередників або інших хімічних речовин, якщо її синтезують хімічним шляхом. Прямо виключаються з визначення "виділені нуклеїнові кислоти": природні хромосоми (такі як розтягнуті хромосоми), бібліотеки штучних хромосом, геномні бібліотеки та бібліотеки кДНК, які існують або як in vitro препарат нуклеїнової кислоти, або як препарат трансфікованої/трансформованої клітини-хазяїна, причому клітини-хазяїни є або in vitro гетерогенним препаратом, або вирощеними на пластині як гетерогенна популяція окремих колоній. Також прямо виключаються вищезгадані бібліотеки, в яких зазначена нуклеїнова кислота складає менше 5 % від кількості нуклеїновокислотних вставок у векторних молекулах. Також прямо виключаються геномні ДНК цілих клітин або препарати РНК цілих клітин (включаючи препарати цілих клітин, які є механічно зрізаними або підданими ферментативному гідролізові). Крім того, прямо виключаються препарати цілих клітин, які існують або як in vitro препарат, або як гетерогенна суміш, відокремлена шляхом електрофорезу, в якій нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, не було піддано подальшому відокремленню від гетерологічних нуклеїнових кислот у середовищі електрофорезу (наприклад, подальшому відокремленню шляхом вирізання однієї смуги з гетерогенної сукупності смуг в агарозному гелі або шляхом блотування на нейлон). Молекулу нуклеїнової кислоти даного винаходу, наприклад молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, SEQ ED NO:3 або її частину, виділяють, застосовуючи стандартні способи молекулярної біології та представлену авторами інформацію про послідовність. Наприклад, ІМІ кДНК Т. aestivum виділяють з бібліотеки Т. aestivum, застосовуючи, повністю або частково, послідовність SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. Крім того, молекула нуклеїнової кислоти, яка включає, повністю або частково, SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, може бути виділена шляхом полімеразної ланцюгової реакції з застосуванням олігонуклеотидних праймерів, побудованих на основі цієї послідовності. Наприклад, мРНК виділяють із рослинних клітин (наприклад, шляхом процедури виділення гуанідин тіоціанату, описаної в роботі Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18:5294-5299), а кДНК одержують, застосовуючи зворотну транскриптазу (наприклад, Moloney MLV зворотну транскриптазу, яку отримують від Gibco/BRL, Bethesda, MD; або AMV зворотну транскриптазу, яку отримують від Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Синтетичні олігонуклеотидні праймери для ампліфікації полімеразної ланцюгової реакції можуть бути побудовані на основі нуклеотидної послідовності, показаної в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. Молекула нуклеїнової кислоти винаходу може бути ампліфікована з застосуванням кДНК або, в альтернативному варіанті, геномної ДНК як матриці та відповідних олігонуклеотидних праймерів згідно зі стандартними способами ампліфікації ПЛР. Ампліфіковану таким чином молекулу нуклеїнової кислоти клонують у відповідний вектор і характеризують шляхом аналізу послідовності ДНК Крім того, олігонуклеотиди, які відповідають нуклеотидній послідовності ІМІ, можуть бути одержані стандартними способами синтезу, наприклад, із застосуванням автоматизованого синтезатора ДНК. ІМІ нуклеїнові кислоти даного винаходу можуть включати послідовності, які кодують ІМІ білок (тобто "кодуючі ділянки"), а також 5' нетрансльовані послідовності та 3' нетрансльовані послідовності. В альтернативному варіанті молекули нуклеїнових кислот даного винаходу можуть включати лише кодуючі ділянки ІМІ гена, або можуть містити повні геномні фрагменти, виділені з геномної ДНК. Кодуючу ділянку цих послідовностей позначають як "ORF-позицію". Крім того, молекула нуклеїнової кислоти винаходу може включати частину кодуючої ділянки ІМІ гена, наприклад, фрагмент, який може бути використаний як зонд або праймер. Нуклеотидні послідовності, визначені за клонуванням ІМІ гена з Т. Aestivum, дозволяють утворювати зонди та праймери, призначені для застосування в розпізнанні та/або клонуванні ІМІ гомологів в інших типах клітин та організмів, а також ІМІ гомологів з інших пшеничних культур та споріднених видів. Частина кодуючої ділянки також може кодувати біологічно активний фрагмент ІМІ білка. Вжитий авторами термін "біологічно активна частина" ІМІ білка охоплює частину, наприклад, домен/мотив ІМІ білка, який у разі вироблення в рослині підвищує резистентність рослини до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу. Способи кількісного визначення підвищеної резистентності до імідазолінонових гербіцидів представлено нижче у Прикладах. Біологічно активні частини ІМІ білка включають пептиди, кодовані полінуклеотидними послідовностями, які включають SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, які включають менше амінокислот, ніж ІМІ білок повної довжини, і надають підвищеної резистентності до імідазолінонового гербіциду після експресії в рослині. Як правило, біологічно активні частини (наприклад, пептиди, які мають у довжину, наприклад, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 або більше амінокислот) включають домен або мотив з принаймні однією 9 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 активністю ІМІ білка. Крім того, інші біологічно активні частини, в яких делетовано інші ділянки поліпептиду, одержують рекомбінантними способами і оцінюють на наявність описаних авторами однієї або кількох активностей. В оптимальному варіанті біологічно активні частини ІМІ білка включають один або кілька консервативних доменів, вибраних з групи, яка складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е, причому консервативний домен містить мутацію. Винахід також забезпечує химерні або злиті ІМІ поліпептиди. Вжитий авторами термін ІМІ "химерний поліпептид" або "злитий Поліпептид" охоплює ІМІ поліпептид, функціонально зв'язаний з не-ІМІ поліпептидом. Термін "не-ІМІ поліпептид" стосується поліпептиду, який має амінокислотну послідовність, яка не має значної ідентичності ІМІ поліпептидові, наприклад, поліпептиду, який не є ІМІ ізоферментом, причому цей пептид виконує відмінну від ІМІ поліпептиду функцію. Відносно до злитого поліпептиду термін "функціонально зв'язаний" означає, що ІМІ поліпептид та не-ІМІ поліпептид є злитими один з одним таким чином, що обидві послідовності виконують передбачену функцію, характерну для даної послідовності. Не-ІМІ поліпептид може бути злитий з N-кінцем або С-кінцем ІМІ поліпептиду. Наприклад, в одному варіанті втілення злитий поліпептид є GST-IMI злитим поліпептидом, у якому ІМІ послідовність є злитою з С-кінцем GST послідовності. Такі злиті поліпептиди можуть сприяти очищенню рекомбінантних ІМІ поліпептидів. В іншому варіанті втілення злитий поліпептид є ІМІ поліпептидом, який містить гетерологічну сигнальну послідовність на своєму N-кінці. У деяких клітинах-хазяїнах (наприклад, клітинах-хазяїнах ссавців) експресія та/або секреція ІМІ поліпептиду може бути посилена завдяки застосуванню гетерологічної сигнальної послідовності. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує ІМІ поліпептид, що має послідовність, ідентичну поліпептидові, який кодується полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, може бути створена шляхом введення одного або кількох нуклеотидних заміщень, додавань або делецій у нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3 таким чином, щоб одне або кілька амінокислотних заміщень, додавань або делецій були введені в кодований поліпептид. Мутації вводять у послідовність SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3 стандартними способами, такими як сайт-специфічний мутагенез та ПЛР-опосередкований мутагенез. В оптимальному варіанті консервативні амінокислотні заміщення здійснюють в одному або кількох прогнозованих замінних амінокислотних залишках. "Консервативне амінокислотне заміщення" є таким, при якому амінокислотний залишок заміщується амінокислотним залишком, який має подібний боковий ланцюг. Спеціалістами було визначено групи амінокислотних залишків, які мають подібні бокові ланцюги. До цих груп належать амінокислоти з основними боковими ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін, гістидин), кислотними боковими ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), незарядженими полярними боковими ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), неполярними боковими ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), бета-розгалуженими боковими ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними боковими ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, прогнозований замінний амінокислотний залишок в ІМІ поліпептиді оптимально заміщується іншим амінокислотним залишком з тієї саМоl групи бокових ланцюгів. В альтернативному варіанті втілення мутації вводять випадково по всій ІМІ кодуючій послідовності або її частині, наприклад, шляхом насиченого мутагенезу, і одержані в результаті мутанти відбирають на наявність описаної авторами ІМІ активності для розпізнання мутантів, які зберігають ІМІ активність. Після мутагенезу послідовності SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, кодований поліпептид може бути експресований рекомбінантно, і активність поліпептиду може бути визначена шляхом аналізу резистентності до імідазолінону в рослини, яка експресує поліпептид, як описано нижче у Прикладах. Для визначення відсотка ідентичності послідовності двох амінокислотних послідовностей (наприклад, SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4 та їх мутантної форми) послідовності суміщають для оптимального порівняння (наприклад, у послідовність одного поліпептиду вставляють розриви для оптимального суміщення з іншим поліпептидом). Після цього порівнюють амінокислотні залишки у відповідних позиціях амінокислот. Якщо позиція в одній послідовності (наприклад, SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4) займається тим самим амінокислотним залишком, що й відповідна позиція в іншій послідовності (наприклад, мутантній формі SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4), то молекули в цій позиції є ідентичними. Таке саме порівняння здійснюють між двома послідовностями нуклеїнових кислот. Відсоток ідентичності послідовності між двома послідовностями залежить від кількості ідентичних позицій, спільних для цих послідовностей (тобто відсоток ідентичності послідовностей = кількість ідентичних позицій/загальна кількість 10 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 позицій х 100). З точки зору винаходу відсоток ідентичності послідовностей між двома нуклеїновими кислотами або поліпептидними послідовностями визначають, застосовуючи пакет програм Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Для визначення відсотка ідентичності двох нуклеїнових кислот виставляють показник "gap opening penalty" 15 і показник "gap extension penalty" 6,66. Для визначення відсотка ідентичності двох поліпептидів виставляють показник "gap opening penalty" 10 і показник "gap extension penalty" 0,1. Усі інші параметри встановлено за умовчанням. Слід розуміти, що для визначення ідентичності послідовності, якщо порівнюють послідовність ДНК з послідовністю РНК, тимідиновий нуклеотид є еквівалентом урацилового нуклеотиду. В оптимальному варіанті виділені ІМІ поліпептиди, які охоплюються даним винаходом, є принаймні приблизно на 5060 %, краще – принаймні приблизно на 60-70 %, ще краще – принаймні приблизно на 70-75 %, 75-80 %, 80-85 %, 85-90 % або 90-95 %, найкраще – принаймні приблизно на 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичними повній амінокислотній послідовності, кодованій полінуклеотидною послідовністю, показаною в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. В іншому варіанті втілення виділені ІМІ поліпептиди, які охоплюються даним винаходом, є принаймні приблизно на 50-60 %, краще – принаймні приблизно на 60-70 %, ще краще – принаймні приблизно на 70-75 %, 75-80 %, 8085 %, 85-90 % або 90-95 %, найкраще – принаймні приблизно на 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше ідентичними повній амінокислотній послідовності, показаній у SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:4. Крім того, можуть бути створені оптимізовані ІМІ нуклеїнові кислоти. В оптимальному варіанті оптимізована ІМІ нуклеїнова кислота кодує ІМІ поліпептид, який модулює толерантність рослини до імідазолінонових гербіцидів, ще краще – якщо підвищує толерантність рослини до імідазолінонового гербіциду після його переекспресії в рослині. Вжитий авторами термін "оптимізований" стосується нуклеїнової кислоти, підданої генній інженерії для посилення її експресії в даній рослині або тварині. Для забезпечення оптимізованих для рослини ІМІ нуклеїнових кислот послідовність ДНК гена модифікують, щоб вона 1) включала кодони, оптимальні для високоекспресованих рослинних генів; 2) включала А+Т, який практично відповідає за складом нуклеотидної основи тому, що міститься в рослинах; 3) утворювала ініціюючу послідовність рослини, 4) не містила послідовностей які викликають дестабілізацію, неналежне поліаденілювання, деградацію та термінацію РНК, або які утворюють шпильки вторинної структури або місця сплайсингу РНК. Посилення експресії ІМІ нуклеїнових кислот у рослинах досягають шляхом застосування частоти розподілу використання кодонів у рослинах взагалі або в конкретній рослині. Способи оптимізації експресії нуклеїнових кислот у рослинах описано в ЕРА 0359472; ЕРА 0385962; заявці РСТ №WO 91/16432; патенті США №5,380,831; патенті США №5,436,391; роботах Perlack et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; та Murray et al., 1989 Nucleic Acids Res. 17:477-498. Вжитий авторами термін "частота переважного використання кодонів" стосується переваги, яку віддає конкретна клітина-хазяїн при використанні нуклеотидних кодонів для визначення даної амінокислоти. Для визначення частоти використання конкретного кодону в гені кількість випадків цього кодону в гені ділять на загальну кількість випадків усіх кодонів, які вказують на ту саму амінокислоту в гені. Так само частота переважного використання кодонів, яку виявляє клітина-хазяїн, може бути розрахована через середнє значення частоти переважного використання кодонів у великій кількості генів, експресованих клітиною-хазяїном. В оптимальному варіанті цей аналіз обмежують генами, які сильно експресуються клітиноюхазяїном. Відсоток відхилення частоти переважного використання кодонів для синтетичного гена від частоти використання клітиною-хазяїном розраховують спочатку шляхом визначення відсотка відхилення частоти використання одного кодону від частоти використання клітиноюхазяїном з наступним одержанням середнього показника відхилення по всіх кодонах. Як визначено авторами, цей розрахунок включає унікальні кодони (тобто ATG і TGG). Тобто загальне середнє відхилення використання кодонів оптимізованого гена від показника клітинахазяїна розраховують, користуючись рівнянням 1А=n=1Z Xn – YnXn разів 100 Z, де Xn = частота використання для кодону n у клітині-хазяїні; Yn = частота використання для кодону n у синтетичному гені, n представляє окремий кодон, який визначає амінокислоту, і загальна кількість кодонів дорівнює Z. Загальне відхилення частоти використання кодонів, А, для всіх амінокислот в оптимальному варіанті становить менше, ніж приблизно 25 %, краще – менше, ніж приблизно 10 %. Таким чином, ІМІ нуклеїнова кислота може бути оптимізована таким чином, щоб її частота розподілу використання кодонів відхилялася в оптимальному варіанті не більше, ніж на 25 % від частоти високоекспресованих рослинних генів, у ще кращому варіанті – не більше, ніж приблизно на 10 %. Крім того, враховують відсотковий вміст G+C виродженої третьої основи 11 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (однодольні підтримують G+C у цій позиції, на відміну від дводольних). Визнано також, що XCG (де X є А, Т, С, або G) нуклеотид є найменшим оптимальним кодоном у дводольних, тоді як ХТА кодону уникають як однодольні, так і дводольні. Оптимізовані ІМІ нуклеїнові кислоти цього винаходу також бажано мати індекси уникнення дублетів CG і ТА, наближені до індексів вибраної рослини-хазяїна (тобто Triticum aestivum). Краще, якщо ці індекси відхиляються від індексу хазяїна не більше, ніж приблизно 10-15 %. Крім молекул нуклеїнових кислот, які кодують описані вище ІМІ поліпептиди, інший аспект винаходу стосується виділених молекул нуклеїнових кислот, які є антисмисловими до них. Вважається, що антисмислові полінуклеотиди інгібують генну експресію полінуклеотиду-мішені шляхом специфічного зв'язування з полінуклеотидом-мішенню і впливу на транскрипцію, сплайсинг, перенесення, трансляцію та/або стійкість полінуклеотиду-мішені. В існуючому рівні техніки описано способи спрямування антисмислового полінуклеотиду на хромосомну ДНК, на первинний транскрипт РНК або на процесовану мРНК. В оптимальному варіанті ділянки-мішені включають місця сплайсингу, кодони ініціації трансляції, кодони термінації трансляції та інші послідовності в межах відкритої рамки зчитування. Термін "антисмислова" з точки зору винаходу стосується нуклеїнової кислоти, яка включає полінуклеотид, який є достатньо комплементарним, повністю або частково, генові, первинному транскриптові або процесованій мРНК, щоб впливати на експресію ендогенного гена. "Комплементарними" полінуклеотидами є ті, які здатні до спарювання основ згідно зі стандартними правилами комплементарності Вотсона-Кріка. Зокрема, пурини створюють пари основ з піримідинами для утворення комбінації гуаніну, спареного з цитозином (G:C) та аденіну, спареного або з тиміном (А:Т) у разі ДНК, або аденіну, спареного з урацилом (A:U) у разі РНК. Слід розуміти, що два полінуклеотиди можуть гібридизуватися один з одним, навіть якщо вони не є повністю комплементарними один одному, якщо кожен має принаймні одну ділянку, практично комплементарну іншій. Термін "антисмислова нуклеїнова кислота" охоплює експресійні касети одноланцюгової РНК, а також дволанцюгової ДНК, які можуть бути транскрибовані для утворення антисмислової РНК. "Активними" антисмисловими нуклеїновими кислотами є молекули антисмислової РНК, здатні селективно гібридизуватися з первинним транскриптом або мРНК, що кодує поліпептид, який має принаймні 80 % ідентичність послідовності з поліпептидом, кодованим полінуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. Крім вищеописаних ІМІ нуклеїнових кислот та поліпептидів, даний винахід охоплює ці нуклеїнові кислоти та поліпептиди, приєднані до компонента. До цих компонентів, крім інших, належать компоненти виявлення, компоненти гібридизації, компоненти очищення, компоненти доставления, компоненти реакції, компоненти зв'язування та ін. Типовою групою нуклеїнових кислот, які мають приєднані компоненти, є зонди та праймери. Зонди та праймери, як правило, включають практично ізольований олігонуклеотид. Олігонуклеотид, як правило, включає ділянку нуклеотидної послідовності, яка гібридизується за жорстких умов з принаймні приблизно 12, краще – приблизно 25, ще краще – приблизно 40, 50 або 75 послідовними нуклеотидами смислового ланцюга послідовності, вказаної в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, антисмисловою послідовністю послідовності, вказаної в SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, або їх природними мутантами. Праймери на основі нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3 застосовують у ПЛР для клонування ІМІ гомологів. Зонди на основі ІМІ нуклеотидних послідовностей застосовують для виявлення транскриптів або геномних послідовностей, які кодують ті ж самі або гомологічні поліпептиди. В оптимальних варіантах втілення зонд також включає приєднану до нього мітку, наприклад мітку, яка може бути радіоізотопом, флуоресцентною сполукою, ферментом або кофактором ферменту. Такі зонди застосовують як частину випробувального комплекту геномного маркера для розпізнання клітин, які експресують ІМІ поліпептид, наприклад, шляхом вимірювання рівня ІМІ-кодуючої нуклеїнової кислоти, у зразку клітин, наприклад виявлення рівня ІМІ мРНК або визначення чи був геномний ІМІ ген мутованим, чи видаленим. Винахід також забезпечує виділений рекомбінантний вектор експресії, який включає ІМІ нуклеїнову кислоту, як описано вище, причому вектор експресії у клітині-хазяїні в результаті забезпечує підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидом клітини-хазяїна дикого типу. Вжитий авторами термін "вектор" стосується молекули нуклеїнової кислоти, здатної транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, з якою її було з'єднано. Одним типом вектора є "плазміда", яка означає кільцеву дволанцюгову петлю ДНК, у яку можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Іншим типом вектора є вірусний вектор, у якому додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори здатні до самостійної реплікації у клітині-хазяїні, в яку вони є введеними (наприклад, бактеріальні вектори, які мають бактеріальне 12 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 походження реплікації, та епісомні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомні вектори ссавців) вводять у геном клітини-хазяїна після введення у клітину-хазяїн, а отже, реплікують разом з геномом хазяїна. Крім того, деякі вектори здатні спрямовувати експресію генів, з якими вони є функціонально зв'язаними. Такі вектори названо авторами "векторами експресії". Взагалі, вектори експресії, які застосовують у технологіях рекомбінантних ДНК, часто мають форму плазмід. У даному описі терміни "плазміда" та "вектор" можуть вживатися поперемінно, оскільки плазміда є найпоширенішою формою вектора. Однак, винахід охоплює й інші форми векторів експресії, такі як вірусні вектори (наприклад, ретровіруси з недостатньою реплікацією, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які виконують рівноцінні функції. Рекомбінантні вектори експресії згідно з винаходом включають нуклеїнову кислоту винаходу у формі, придатної для експресії нуклеїнової кислоти у клітині-хазяїні, що означає, що рекомбінантні вектори експресії включають одну або кілька регуляторних послідовностей, вибраних на основі клітин-хазяїв, які мають бути застосовані для експресії, які є функціонально зв'язаними з нуклеїновокислотною послідовністю, яка підлягає експресії. Відносно до рекомбінантного вектора експресії "функціонально зв'язаний" означає, що дана нуклеотидна послідовність є зв'язаною з регуляторною(ими) послідовністю (послідовностями) таким чином, що це дозволяє експресію нуклеотидної послідовності (наприклад, в in vitro транскрипційній/трансляційній системі або у клітині-хазяїні, коли вектор є введеним у клітинухазяїн). Термін "регуляторна послідовність" охоплює промотори, енхансери та інші елементи контролю експресії (наприклад, сигнали поліаденілювання). Такі регуляторні послідовності описано, наприклад, у роботі Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), або в роботі Gruber and Crosby, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, включаючи посилання, які в них містяться. До регуляторних послідовностей належать ті, які спрямовують конститутивну експресію нуклеотидної послідовності в багатьох типах клітинхазяїнів, та ті, які спрямовують експресію нуклеотидної послідовності лише в деяких клітинаххазяях або за певних умов. Спеціалістам стане зрозуміло, що побудова вектора експресії може залежати від таких чинників, як вибір клітини-хазяїна, яка підлягає трансформації, рівень експресії потрібного поліпептиду і т. д. Вектори експресії згідно з винаходом вводять у клітинихазяїни для утворення поліпептидів або пептидів, включаючи злиті поліпептиди або пептиди, кодовані нуклеїновими кислотами, як описано авторами (наприклад, ІМІ поліпептиди, злиті поліпептиди і т. д.). В оптимальному варіанті втілення даного винаходу ІМІ поліпептиди експресуються в рослинах та рослинних клітинах, таких як клітини одноклітинних рослин (наприклад, водоростей) (див. Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3):239-251, та посилання, що містяться в цій роботі) та клітини вищих рослин (наприклад, сперматофімiв, таких як хлібні злаки). ІМІ полінуклеотид може бути "введений" у рослинну клітину будь-яким способом, включаючи трансфекцію, трансформацію або трансдукцію, електропорацію, бомбардування частинками, агроінфекцію, біолістику і т. ін. Одним з відомих спеціалістам способів трансформації є занурення рослини під час цвітiння в розчин Agrobacteria, в якому Agrobacteria містить ІМІ нуклеїнову кислоту, з наступним розведенням трансформованих гамет. Інші відомості про придатні способи трансформації або трансфекції клітин-хазяїнів, включаючи рослинні клітини, можна знайти в Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory nd Manual. 2 , ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) та інших лабораторних посібниках, таких як Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Оскільки підвищена резистентність до імідазолінонових гербіцидів є загальною особливістю, успадкування якої є бажаним для багатьох видів рослин, таких як кукурудза, пшениця, жито, овес, тритикале, рис, ячмінь, соя, арахіс, бавовна, рапс та канола, маніхот, перець, соняшник та чорнобривці, пасльонові рослини, такі як картопля, тютюн, баклажан та томати, види віки, горох, люцерна, чагарникові рослини (кава, какао, чай), види верби, дерева (олійна пальма, кокос), багаторічні трави та фуражні культури, ці хлібні злаки також є оптимальними рослинами, які можуть бути об'єктами генної інженерії як ще один варіант втілення даного винаходу. До фуражних культур належать, крім інших, пирій, Phalaris arundinacea, Bromopsis inermis, дике жито, Bluegrass, Dactillis glomerata L., люцерна, Salfoin, Lotus corniculatus L., шведська конюшина, червона конюшина та буркун. В одному варіанті втілення даного винаходу трансфекції ІМІ полінуклеотиду в рослину досягають шляхом Agrobacterium-опосередкованого перенесення гена. Agrobacteriumопосередкована трансформацію рослин здійснюють, застосовуючи, наприклад, GV3101(pMP90) (Koncz and Schell, 1986 Моl. Gen. Genet. 204:383-396) або LBA4404 (Clontech) штам 13 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Agrobacterium tumefaciens. Трансформацію здійснюють стандартними способами трансформації та регенерації (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. and nd Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual., 2 Ed. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. - in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. and Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Наприклад, рапс трансформують шляхом трансформації сім'ядолі або гіпокотиля (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91:694-701). Застосування антибіотиків для вибору Agrobacterium та рослини залежить від бінарного вектора та штаму Agrobacterium, який застосовують для трансформації. Вибір рапсу зазвичай здійснюють, застосовуючи канаміцин як маркер для селекції рослин. Agrobacterium-опосередковане перенесення генів у льон здійснюють, застосовуючи, наприклад, спосіб, описаний у роботі Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13:282-285. Крім того, трансформацію сої здійснюють, застосовуючи, наприклад, спосіб, описаний у європейському патенті №0424 047, патенті США №5,322,783, європейському патенті №0397 687, патенті США №5,376,543 або патенті США №5,169,770. Трансформації кукурудзи досягають шляхом бомбардування частинками, опосередкованого поліетиленгліколем поглинання ДНК або за допомогою волокон карбіду кремнію. (Див., наприклад, Freeling and Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Конкретний приклад трансформації кукурудзи міститься в патенті США №5,990,387, а конкретний приклад трансформації пшениці міститься в заявці РСТ №WO 93/07256. Згідно з даним винаходом, введений ІМІ полінуклеотид може стійко утримуватись у рослинній клітині, якщо його введено в нехромосомний автономний реплікон або введено у хромосоми рослин. В альтернативному варіанті введений ІМІ полінуклеотид може бути присутній на позахромосомному невідтворюваному векторі і може бути короткочасно експресованим або короткочасно активним. В одному варіанті втілення може бути створений гомологічний рекомбінантний мікроорганізм, у якому ІМІ полінуклеотид є введеним у хромосому, створюється вектор, який містить принаймні частину гена AHAS, у який введено делецію, додавання або заміщення для того, щоб змінити, наприклад, функціонально розірвати, ендогенний ген AHAS і створити ІМІ ген. Для створення точкової мутації через гомологічну рекомбінацію, використовують ДНК-РНК гібриди, застосовуючи спосіб, відомий як химерапластія (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323-1330 and Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist 87(3):240-247). Спеціалістам також добре відомі інші процедури гомологічної рекомбінації у вигляді Triticum, можливість застосування яких авторами передбачається. У векторі гомологічної рекомбінації до ІМІ гена на його 5' та 3' кінцях може приєднуватися додаткова молекула нуклеїнової кислоти гена AHAS, що дозволяє здійснення гомологічної рекомбінації між екзогенним ІМІ геном, що міститься у векторі, та ендогенним геном AHAS у мікроорганізмі або рослині. Додаткова молекула фланкуючої нуклеїнової кислоти AHAS має достатню довжину для успішної гомологічної рекомбінації ендогенним геном. Як правило, вектор включає від кількох сотень пар основ до тисяч основ фланкуючих ДНК (як на 5', так і на 3' кінцях) (див., наприклад, Thomas, К.R., and Capecchi, M.R., 1987 Cell 51:503, де описано вектори гомологічної рекомбінації, або Strepp et al., 1998 PNAS, 95(8):4368-4373, де описано рекомбінацію на основі кДНК у Physcomitrella patens). Однак, оскільки ІМІ ген зазвичай відрізняється від гена AHAS у дуже небагатьох амінокислотах, у фланкуючій послідовності не завжди є необхідність. Вектор гомологічної рекомбінації вводять у мікроорганізм або рослинну клітину (наприклад, через поліетиленгліколь-опосередковану ДНК) і відбирають клітини, в яких введений ІМІ ген було гомологічно рекомбіновано ендогенним геном AHAS, застосовуючи відомі спеціалістам способи. В іншому варіанті втілення одержують рекомбінантні мікроорганізми, які містять вибрані системи, що дозволяють здійснювати регульовану експресію введеного гена. Наприклад, включення ІМІ гена у вектор з поміщенням його під контроль Іас-оперона дозволяє експресію ІМІ гена лише у присутності IPTG. Такі регуляторні системи добре відомі спеціалістам. Чи є він присутнім у позахромосомному невідтворюваному векторі, чи у векторі, введеному у хромосому, ІМІ полінуклеотид в оптимальному варіанті містяться в експресійній касеті рослини. Експресійна касета рослини в оптимальному варіанті містить регуляторні послідовності, здатні викликати експресію гена в рослинних клітинах, які є функціонально зв'язаними таким чином, що кожна послідовність може виконувати свою функцію, наприклад, термінацію транскрипції сигналами поліаденілювання. Оптимальними сигналами поліаденілювання є ті, що походять із т-ДНК Agrobacterium tumefaciens, такі як ген 3, відомий як октопін синтаза Ті-плазміди pTiACHS (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3:835) або їх функціональні еквіваленти, але придатними є також усі 14 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інші термінатори, функціонально активні в рослинах. Оскільки експресія рослинних генів дуже часто не обмежується на транскрипційних рівнях, експресійна касета рослини в оптимальному варіанті містить інші функціонально зв'язані послідовності, такі як перехідні енхансери, наприклад, надлишкова послідовність (overdrive sequence), яка містить 5'-нетрансльовану лідерну послідовність вірусу тютюнової мозаїки, що збільшує пропорцію поліпептиду в РНК (Gallic et al., 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Прикладами рослинних векторів експресії можуть бути ті, які детально описано в роботах Becker, D. et al., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Моl. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; and Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S.15-38. Експресія рослинного гена має бути функціонально пов'язана з відповідним промотором, який забезпечує вчасну, клітино- або тканиноспецифічну експресію гена. До промоторів, застосовуваних в експресійних касетах, згідно з винаходом, може належати будь-який промотор, здатний ініціювати транскрипцію в рослинній клітині. До таких промоторів належать, крім інших, ті, які можуть бути одержані з рослин, рослинних вірусів та бактерій, які містять гени, що експресуються в рослинах, таких як Agrobacterium та Rhizobium. Промотор може бути конститутивним, індуцибельним, специфічним до стадії розвитку, специфічним до типу клітин, тканиноспецифічним або органоспецифічним. Конститутивні промотори є активними за більшості умов. Прикладами конститутивних промоторів є CaMV 19S та 35 S промотори (Odell et al. 1985 Nature 313:810-812), sX CaMV 35S промотор (Kay et al. 1987 Science 236:1299-1302) Sepl промотор, промотор актину рису (McElroy et al. 1990 Plant Cell 2:163-171), промотор актину Arabidopsis, промотор убіхітану (Christensen et al. 1989 Plant Molec Biol. 18:675-689); pEmu (Last et al. 1991 Theor Appl Genet. 81:581-588), 35S промотор вірусу мозаїки ранника, Smas промотор (Velten et al. 1984 EMBO J. 3:2723-2730), GRP1-8 промотор, промотор дегідрогенази цинамілового спирту (Патент США №5,683,439), промотори з Т-ДНК Agrobacterium, такі як манопін синтаза, нопалін синтаза та октопін синтаза, промотор малої субодиниці рибулоза біфосфат карбоксилази (ssuRUBISCO) промотор та ін. Індуцибельні промотори є активними за певних навколишніх умов, таких як наявність або відсутність поживної речовини або метаболіту, тепло або холод, світло, напад патогенів, анаеробні умови та ін. Наприклад, hsp80 промотор із Brassica індукується термічним ударом, PPDK промотор індукується світлом, PR-1 промотор з тютюну, Arabidopsis та кукурудзи індукуються інфекцією патогену, a Adh 1 промотор індукується гіпоксією та впливом холоду. Експресії рослинного гена також може сприяти індуцибельний промотор (див. Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Моl. Biol. 48:89-108). Хімічно індуцибельні промотори є особливо придатними, якщо потрібна специфічна до часу експресія гена. Прикладами таких промоторів є індукований саліциловою кислотою промотор (Заявка РСТ №WO 95/19443), індукований тетрацикліном промотор (Gatz et al., 1992 Plant J. 2:397-404) та індукований етанолом промотор (Заявка РСТ №WO 93/21334). Специфічні до стадії розвитку промотори в оптимальному варіанті експресуються на певних стадіях розвитку. До тканино- та органоспецифічних промоторів належать ті, які в оптимальному варіанті експресуються в певних тканинах або органах, таких як листя, коріння, насіння або ксилема. Прикладами тканиноспецифічних та органоспецифічних промоторів є, крім інших, специфічні до плодів, специфічні до насінних зачатків, специфічні до чоловічих тканин, специфічні до насіння, специфічні до шкірки, специфічні до бульб, специфічні до стебел, специфічні до оплодня та специфічні до листя, специфічні до приймочок, специфічні до пилку, специфічні до пиляка, специфічні до пелюсток, специфічні до чашолистка, специфічні до квітконіжки, специфічні до стручка, специфічні до суплідь, специфічні до коріння промотори та інші. Специфічні до насіння промотори в оптимальному варіанті експресуються під час розвитку насіння або проростання. Наприклад, специфічні до насіння промотори можуть бути специфічними до ембріонів, специфічними до ендосперму та специфічними до оболонки насіння. Див. Thompson et al. 1989 BioEssays 10:108. Прикладами специфічних до насіння промоторів є, крім інших, целюлоза-синтаза (сеlА), Сim1, гамма-зеїн, глобулін-1, зеїн кукурудзи 19 kD (cZ19Bl) та інші. До інших придатних тканиноспецифічних або органоспецифічних промоторів належать промотор напін-гена з рапсу (Патент США №5,608,152), USP-промотор із Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Моl Gen Genet. 225(3):459-67), олеозин-промотор із Arabidopsis (Заявка PCT №WO 98/45461), фазеолін-промотор із Phaseolus vulgaris (Патент США №5,504,200), Все4-промотор із Brassica (Заявка PCT №WO 91/13980) або легумін В4 промотор (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal., 2(2):233-9), а також промотори, які забезпечують специфічну до насіння експресію 15 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в однодольних рослинах, таких як кукурудза, ячмінь, пшениця, жито, рис і т. д. Придатними промоторами є промотор Ipt2 або lpt1-гена з ячменю (Заявка PCX №WO 95/15389 та Заявка PCX №WO 95/23230) або описані в заявці PCX №WO 99/16890 (промотори з гордеїн-гена ячменю, глютелін-гена рису, оризин-гена рису, проламін-гена рису, гліадин-гена пшениці, глютенін-гена пшениці, глютенін-гена вівса, касирин-гена сорго та секалін-гена жита). До інших промоторів, які застосовують в експресійних касетах винаходу, належать, крім інших, головний промотор а/b-зв'язувального білка хлорофілу, промотори гістону, Ар3 промотор, промотор конгліцину, промотор напіну, промотор соєвого лектину, промотор зеїну кукурудзи 15kD, промотор зеїну 22kD, промотор зеїну 27kD, промотор g-зеїну, промотори waxy, shrunken I, shrunken 2 та bronze, Zm13 промотор (Патент США №5,086,169), промотори полігалактуронази кукурудзи (PG) (Патенти США №№5,412,085 та 5,545,546) і SGB6 промотор (Патент США №5,470,359), а також синтетичні або інші природні промотори. Додаткової гнучкості в контролюванні експресії гетерологічного гена в рослинах досягають шляхом застосування доменів зв'язування ДНК та елементів відповіді з гетерологічних джерел (тобто доменів зв'язування ДНК з нерослинних джерел). Прикладом такого гетерологічного домену зв'язування є домен зв'язування ДНК LexA (Brent and Ptashne, Cell 43:729-736 (1985)). Інший аспект винаходу стосується клітин-хазяїнів, у які було введено рекомбінантний вектор експресії, згідно з винаходом. Терміни "клітина-хазяїн" та "рекомбінантна клітина-хазяїн" вживаються авторами поперемінно. Слід розуміти, що такі терміни стосуються не лише конкретної клітини, але вони також стосуються потомства або можливого потомства такої клітини. Оскільки в наступних поколіннях можуть траплятися певні зміни через мутації або вплив навколишнього середовища, таке потомство фактично не може бути ідентичним батьківській клітині, але все одно охоплюється вжитим авторами терміном. Клітина-хазяїн може бути будь-якою прокаріотною або еукаріотною клітиною. Наприклад, ІМІ полінуклеотид може бути експресований у бактеріальних клітинах, таких як С. glutamicum, клітини комах, грибкові клітини або клітини ссавців (такі як клітини яєчника китайського хом'яка (СНО) або клітини COS), водорості, війчасті, рослинні клітини, грибки або інші мікроорганізми, такі як С. glutamicum. Інші придатні клітини-хазяїни є відомими спеціалістам. Клітину-хазяїн, згідно з винаходом, таку як прокаріотна або еукаріотна клітина-хазяїн у культурі, використовують для вироблення (тобто експресії) ІМІ полінуклеотиду. Відповідно, винахід також забезпечує способи вироблення ІМІ поліпептидів з використанням клітин-хазяїв згідно з винаходом. В одному варіанті втілення спосіб включає культивування клітини-хазяїна, згідно з винаходом, (у яку було введено рекомбінантний вектор експресії, який кодує ІМІ поліпептид, або в геном якої було введено ген, який кодує поліпептид дикого типу або ІМІ поліпептид) у придатному середовищі до вироблення ІМІ поліпептиду. В іншому варіанті втілення спосіб також включає виділення ІМІ поліпептидів із середовища або клітини-хазяїна. Інший аспект винаходу стосується виділених ІМІ поліпептидів та їх біологічно активних частин. "Виділений" або "очищений" поліпептид або його біологічно активна частина є вільними від деякого клітинного матеріалу, якщо одержуються способами рекомбінантних ДНК, або хімічних попередників або інших хімічних речовин, якщо хімічно синтезуються. Вираз "практично вільний від клітинного матеріалу" охоплює препарати ІМІ поліпептиду, в яких поліпептид є відокремленим від деяких із клітинних компонентів клітин, у яких він природним або рекомбінантним шляхом виробляється. В одному варіанті втілення вираз "практично вільний від клітинного матеріалу" охоплює препарати ІМІ поліпептиду, що мають менше, ніж приблизно 30 % (сухої маси) відмінного від ІМІ матеріалу (який також вказується авторами як "забруднюючий поліпептид"), краще – менше, ніж приблизно 20 % відмінного від ІМІ матеріалу, ще краще – менше, ніж приблизно 10 % відмінного від ІМІ матеріалу, найкраще – менше, ніж приблизно 5 % відмінного від ІМІ матеріалу. Якщо ІМІ поліпептид або його біологічно активна частина виробляється рекомбінантно, вони також в оптимальному варіанті є практично вільними від культурального середовища, тобто культуральне середовище складає менше, ніж приблизно 20 %, краще – менше, ніж приблизно 10 %, найкраще – менше, ніж приблизно 5 % об'єму препарату поліпептиду. Вираз "практично вільний від хімічних попередників або інших хімічних речовин" охоплює препарати ІМІ поліпептиду, в яких поліпептид є відокремленим від хімічних попередників або інших хімічних речовин, які беруть участь у синтезі поліпептиду. В одному варіанті втілення вираз "практично вільний від хімічних попередників або інших хімічних речовин" охоплює препарати ІМІ поліпептиду, що мають менше, ніж приблизно 30 % (сухої маси) хімічних попередників або відмінних від ІМІ хімічних речовин, краще – менше, ніж приблизно 20 % хімічних попередників або відмінних від ІМІ хімічних речовин, ще краще – менше, ніж приблизно 10 % хімічних попередників або відмінних від ІМІ хімічних речовин, найкраще – менше, ніж приблизно 5 % 16 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хімічних попередників або відмінних від ІМІ хімічних речовин. В оптимальних варіантах втілення виділені поліпептиди або їх біологічно активні частини не містять забруднюючих поліпептидів з того організму, з якого походить ІМІ поліпептид. Як правило, такі поліпептиди одержують шляхом рекомбінантної експресії, наприклад, ІМІ поліпептиду Triticum aestivum у рослинах, які не є Triticum aestivum, або мікроорганізмах, таких як С. glutamicum, війчасті, водорості або грибки. Послідовності ІМІ полінуклеотиду та поліпептиду, згідно з винаходом, мають різне застосування. Нуклеїновокислотні та амінокислотні послідовності даного винаходу застосовують для трансформації рослин, таким чином, модулюючи резистентність рослин до імідазолінонових гербіцидів. Відповідно, винахід забезпечує спосіб одержання трансгенної рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, включаючи (а) трансформацію рослинної клітини одним або кількома векторами експресії, які включають одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот, і (б) вирощування з рослинної клітини трансгенної рослини з підвищеною резистентністю до імідазолінонового гербіциду порівняно з сортом рослини дикого типу. В одному варіанті втілення множинні ІМІ нуклеїнові кислоти походять із різних геномів. Даний винахід також охоплює способи одержання трансгенної рослини, яка має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, включаючи (а) трансформацію рослинної клітини вектором експресії, який включає ІМІ нуклеїнову кислоту, причому нуклеїнова кислота не є Imi1 нуклеїновою кислотою, і (б) вирощування з рослинної клітини трансгенної рослини з підвищеною резистентністю до імідазолінонового гербіциду порівняно з сортом рослини дикого типу. Даний винахід включає способи зміни толерантності рослини до імідазолінонового гербіциду, які включають зміну експресії однієї або кількох ІМІ нуклеїнових кислот. В оптимальному варіанті нуклеїнові кислоти містяться в різних геномах або походять із різних геномів. Резистентність рослини до імідазолінонового гербіциду може бути підвищена або знижена, що досягається посиленням або послабленням експресії ІМІ полінуклеотиду, відповідно. В оптимальному варіанті резистентність рослини до імідазолінонового гербіциду підвищують шляхом посилення експресії ІМІ полінуклеотиду. Експресія ІМІ полінуклеотиду може змінюватися будь-якими відомими спеціалістам способами. Застосовують способи посилення експресії ІМІ полінуклеотидів, у яких рослина є або трансгенною, або нетрансгенною. У випадках, коли рослина є трансгенною, рослина може бути трансформована вектором, який містить будь-яку з вищеописаних ІМІ кодуючих нуклеїнових кислот, або ж, рослина може бути трансформована промотором, який спрямовує експресію ендогенних ІМІ полінуклеотидів у рослині. Винахід передбачає, що такий промотор може бути тканиноспецифічним або регульованим розвитком. В альтернативному варіанті нетрансгенні рослини можуть мати експресію ендогенного ІМІ полінуклеотиду, яка змінюється включенням природного промотора. Експресія полінуклеотидів, які включають SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3 у заданих рослинах може здійснюватися, крім іншого, за допомогою: (а) конститутивного промотора, (б) хімічно індукованого промотора та (в) переекспресії підданого інженерії промотора, наприклад, похідними від цинкових пальців факторами транскрипції (Greisman and Pabo, 1997 Science 275:657). В оптимальному варіанті втілення транскрипцію ІМІ полінуклеотиду модулюють, застосовуючи похідні від цинкових пальців фактори транскрипції (ZFP), які описано у Greisman and Pabo, 1997 Science 275:657, і які виробляються Sangamo Biosciences, Inc. Ці ZFP включають як домен розпізнання ДНК, так і функціональний домен, який викликає активацію або пригнічення заданої нуклеїнової кислоти, такої як IМІ нуклеїнова кислота. Отже, створюють активуючі і пригнічувальні ZFP, які специфічно розпізнають промотори ІМІ полінуклеотиду, які було описано вище і які застосовують для посилення або послаблення експресії ІМІ полінуклеотиду в рослині, таким чином, модулюючи резистентність рослини до гербіцидів. Як було детальніше описано вище, рослини, які одержують способами даного винаходу, можуть бути однодольними або дводольними. Рослини вибирають, наприклад, з-поміж кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритикале, рису, ячменю, сої, арахісу, бавовни, рапсу, каноли, маніхоту, перцю, соняшника, чорнобривців, пасльонових рослин, картоплі, тютюну, баклажану, томатів, видів віки, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, видів верби, олійної пальми, кокосу, багаторічних трав та фуражних культур. До фуражних культур належать, крім інших, пирій, Phalaris arundinacea, Bromopsis inermis, дике жито, Bluegrass, Dactillis glomerata L., люцерна, Salfoin, Lotus corniculatus L., шведська конюшина, червона конюшина та буркун. В оптимальному варіанті втілення рослиною є пшенична культура. У кожному з вищеописаних способів рослинна клітина включає, крім іншого, протопласт, гаметопродукуючу клітину та клітину, яка регенерується в цілу рослину. Вжитий авторами термін "трансгенний" стосується 17 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 будь-якої рослини, рослинної клітини, калюсу, рослинної тканини або частини рослини, що містить, повністю або частково, принаймні один рекомбінантний полінуклеотид. У багатьох випадках рекомбінантний полінуклеотид, частково або повністю, є стабільно включеним у хромосому або стійкий позахромосомний елемент таким чином, що він передається наступним поколінням. Як описано вище, даний винахід пропонує композиції та способи підвищення резистентності до імідазолінону у пшеничної культури або насіння порівняно з різновидами рослини або насінням дикого типу. В оптимальному варіанті втілення резистентність до імідазолінону у пшеничної культури або насіння підвищується таким чином, що рослина або насіння може -1 витримувати нанесення імідазолінонового гербіциду в кількості приблизно 10-400 г аі/га , краще -1 -1 – 20-160 г аі/га , найкраще – 40-80 г аі/га . Вжитий авторами термін "витримувати" нанесення імідазолінонового гербіциду означає, що рослина не знищується або не зазнає ураження від такого нанесення. Крім того, авторами пропонується спосіб контролю над бур'янами в оточенні пшеничної культури, який включає нанесення імідазолінонового гербіциду на бур'яни та пшеничну культуру, причому пшенична культура має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з сортом пшеничної культури дикого типу, і рослина містить одну або кілька ІМІ нуклеїнових кислот. В одному варіанті втілення рослина містить множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, які містяться в різних геномах або походять із різних геномів. В іншому варіанті втілення рослина містить відмінну від Imi1 нуклеїнову кислоту. Завдяки забезпеченню пшеничних культур з підвищеноюрезистентністю до імідазолінону, існує широкий вибір придатних до застосування композицій для захисту пшеничних культур від бур'янів з метою активізації росту рослин та зниження конкурентної боротьби за поживні речовини. Імідазоліноновий гербіцид застосовують окремо для досходового, післясходового, передпосівного та посівного контролю над бур'янами на площах, які оточують описані авторами пшеничні культури, або ж застосовують композицію імідазолінонового гербіциду, яка містить інші додатки. Імідазоліноновий гербіцид також застосовують для обробки насіння. До додатків, які містяться в композиції імідазолінонового гербіциду, належать інші гербіциди, детергенти, ад'юванти, засоби розсіювання, засоби прилипання, стабілізатори або інші подібні агенти. Композиція імідазолінонового гербіциду може бути рідкою або сухою композицією і може включати, крім іншого, сипкі порошки, емульговані концентрати та рідкі концентрати. Імідазоліноновий гербіцид та гербіцидні композиції наносять традиційними способами, наприклад, шляхом розпилення, поливання, зрошування або іншими подібними способами. У заявці містяться посилання на різні публікації. Описи всіх цих публікацій та посилання, наведені в цих публікаціях у їх повному обсязі, включено авторами шляхом посилання в цю заявку для більш повного опису рівня техніки, якого стосується цей винахід. Слід також розуміти, що вищенаведене стосується оптимальних варіантів втілення даного винаходу, і що існує можливість внесення численних змін без відхилення від обсягу винаходу. Винахід далі пояснюється на представлених нижче прикладах, які не повинні розглядатись як такі, що якимось чином обмежують його обсяг. Навпаки, слід чітко розуміти, що існує можливість звернення до різних інших варіантів його втілення, модифікацій та еквівалентів, які, по ознайомленню з представленим описом, стануть зрозумілими спеціалістам без відхилення від сутності даного винаходу та/або обсягу формули винаходу, що додається. Приклад 1 Мутагенез та відбір резистентних ліній пшениці Приблизно 40 000 зразків насіння Triticum aestivum L. cv CDC Teal (Hughes and Hucl, 1993 Can. J. Plant Sci. 73:193-197) піддавали мутагенезові, застосовуючи змінені процедури, описані в роботі Washington and Sears (1970). Насіння попередньо вимочували в дистильованій воді протягом чотирьох годин, після чого обробляли 0,3 % EMS протягом шести годин. Насіння постійно промивали водопровідною водою протягом семи годин і залишали висихати протягом приблизно чотирьох годин перед висіванням у полі. Рослини М 1 змішували і насіння збирали в 6 загальну масу. Приблизно 2 × 10 рослин М2 вирощували в полі наступного року і обприскували -1 -1 на стадії двох листків імазамоксом при нормі 40 г аі/га в об'ємі аерозолю 100 л га . До розчину аерозолю додавали допоміжну речовину для злиття 0,05 % (об'єм/об'єм). Відбирали шість ліній, резистентних до імазамоксу, які позначали як лінії 1А, 9А, 10А, 11А, 15А та 16А. Покоління М3 та М4 вирощували в камері для вирощування і відбирали рослини, резистентні до імазамоксу при -1 -1 нормі 20 г аі/га . Резистентні рослини відбирали в поколінні Ms після нанесення 40 г аі/га в полі. Насіння M5 було гомозиготним за характеристиками, оскільки випробування потомства не виявляло сегрегації щодо резистентності до імазамокс. Приклад 2 18 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Способи, які застосовують для визначення успадкування та алелізму ІМІ генів Для визначення генетичного контролю резистентності до імазамоксу в шести лініях пшениці здійснювали взаємне схрещування між шістьма гомозиготними резистентними М6 лініями та CDC Teal (чутливим до імазамоксу). Випадково відібрані рослини F1 від кожного схрещування піддавали зворотному схрещуванню з CDC Teal для утворення зворотно схрещених (BC)F1 популяцій. Для дослідження алелізму здійснювали всі можливі взаємні схрещування між шістьма мутантами та SWP965001 (Grandin/3*Fidel-FS-4). SWP965001 є лінією ярової пшениці, яка є гомозиготною для FS-4 алелі. Батьківські генотипи вирощували в камері для вирощування з 16-годинним фотоперіодом і 24 °C денним та 16 °C нічним температурним режимом. Колоски, які з'являлися на ¾, піддавали емаскуляції, а потім запилювали через 2-3 дні після емаскуляції. Випадково відібрані рослини F2 з усіх сегрегуючих гібридів змішували для одержання груп F2:3. Батьківські рослини, F1, BCF1, F2 та групи F2:3 випробували на реакцію на імазамокс. Усі експерименти здійснювали в камері для вирощування з 16-годинним фотоперіодом і 23 °C денним та 16 °C нічним температурним режимом. Усі експерименти здійснювали на повністю випадковій основі. В експериментах із залученням груп F2:3 намагалися забезпечити рандомізацію як у межах групи, так і між групами. Популяції F1 та F2 відбирали в такому самому експерименті разом з батьківськими генотипами та CDC Teal як контрольними зразками. Обидві популяції, BCF1 та F2:3, відбирали у двох окремих експериментах разом з відповідними батьківськими генотипами як контрольними зразками. Обробку гербіцидами застосовували до рослин, які вирощували на платформах з комірками 8 × 16, на стадії двох листків, використовуючи шланговий розпилювач, калібрований таким -1 -1 чином, щоб розпилювати 100 л га . Імазамокс наносили на рослини при нормі 20 г аі/га , застосовуючи насадку 8001 EVS під тиском 275 кПа. До розчину гербіциду перед нанесенням додавали поверхнево-активну речовину для злиття (0,05 % (об'єм/об'єм)). Через п'ятнадцять днів після нанесення гербіциду рослини розбивали по групах на основі первинної реакції і поділяли на резистентні, проміжні або чутливі. Резистентні рослини після гербіцидної обробки були фенотипічно неушкодженими, тоді як проміжні рослини характеризувалися затримкою росту перших двох листків, потемнінням (темно-зеленим забарвленням) листя та появою колеоптильних відростків. Чутливі рослини характеризувалися відсутністю розвитку нових листків, широким хлорозом листя і, зрештою, загибеллю рослини. Для менделевського аналізу сегрегуючих популяцій рослини поділяли на резистентні та чутливі категорії і випробували на адекватність різним 1-генним, 2-генним та 3-генним моделям аналіз chi-square. Для даних по рослинах F2 та BCF1 проміжні реакції було включено до категорії резистентної реакції. Для регулювання значення chi-square застосовували корекцію за Yates для безперервності, коли в аналізі chi-square користувалися лише одним ступенем свободи (Steele and Torrie 1980 Principles and procedures of statistics. McGraw-Hill, New York, New York, pp.633). Приклад 3 Результати, що стосуються успадкування ІМІ генів -1 Усі резистентні батьківські рослини давали однаковий фенотип при розпилюванні 20 г аі/га імазамоксу. (Фігура 1). Взаємне схрещування між резистентними лініями та чутливими батьківськими рослинами (CDC Teal) у результаті давало рослини Fi, які витримували нанесення імазамоксу (Фігура 1), що вказувало на те, що резистентність до імазамокс є ядерною, а не цитоплазматичною характеристикою. За винятком гібриду 15А х Teal., рослини F1, одержані в результаті схрещування кожної з резистентних ліній з CDC Teal., виявляли проміжну реакцію (Фігура 1). Оскільки рослини Fi були фенотипічно проміжними між двома батьківськими рослинами, було зроблено висновок, що резистентність до імазамоксу в цих лініях була частково домінантною характеристикою (Фігура 1). Генетичний аналіз резистентності до імідазолінонів та сульфонілсечовини в Arabidopsis thaliana (Haughn and Somerville, 1986 Моl. Gen. Genet. 204:430-434) Zea mays (Newhouse et al., 1991 Theor. Appl. Genet. 83:65-70), Brassica napus (Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Gen. 78:525-530) та Glycine max (Sebastian et al., 1989 Crop Sci. 29:1403-1408) також вказував на присутність єдиного, частково домінантного ядерного гена. Чотирнадцять рослин F1, одержаних у результаті схрещування 15А х Teal., зараховували до резистентних (Фігура 1). Оцінка популяцій F2 від цього схрещування показала, що два незалежно сегреговані локуси були пов'язані з забезпеченням резистентності в цьому генотипі (Фігура 2). Оскільки F1 має нести два гетерозиготні резистентні локуси, можна очікувати, що спостерігатиметься резистентна реакція. Якщо кожен з цих локусів окремо забезпечує часткове домінування, то в сумі два гетерозиготні локуси мають забезпечувати резистентну реакцію. Swanson et al. (1989) комбінували дві напівдомінантні алелі резистентності до імідазолінону з 19 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Brassica napus, які представляють два роз'єднані гени, для одержання гібриду F1, який переважав у резистентності до імідазолінону будь-яку з окремих гетерозиготних ліній. Автори дійшли висновку, що механізми резистентності є сукупними, і вищий рівень резистентності спостерігають у лініях, які несуть більше однієї алелі резистентності. Аналіз цитоплазматичної спадковості здійснювали в поколінні F2 шляхом випробування рівномірності відхилення від співвідношення сегрегації між двома взаємними популяціями F2. Аналіз chi-square не виявив значного відхилення між взаємними популяціями, підтвердивши відсутність цитоплазматичної спадковості (Фігура 2). Оскільки цитоплазматична спадковість була відсутня, дані двох взаємних популяцій комбінували і розраховували загальний показник chi-square по об'єднаних даних F2 (Фігура 2). За винятком Teal x 15А, усі популяції F2, одержані в результаті схрещувань резистентних та чутливих рослин, відповідали співвідношенню 3:1 резистентності до чутливості, вказуючи на сегрегацію єдиного головного гена резистентності до імазамоксу (Фігура 2). Коли рослини F1 схрещували з чутливими батьківськими рослинами, одержані в результаті популяції BCF1 відповідали співвідношенню 1:1 резистентності:чутливості, підтверджуючи однолокусну гіпотезу (Фігура 2). Дані щодо популяції F2 від схрещування 15А х Teal відповідають співвідношенню 15:1 резистентності:чутливості (Р=0,08), вказуючи на сегрегацію двох незалежних, комплементарних генів (Фігура 2). Популяція BCF1 відповідала співвідношенню 3:1 резистентності:чутливості зі значенням Р Chi-square 0,35, підтверджуючи результати для F2 (Фігура 2). Оскільки на основі даних для F2 було висловлено припущення, що резистентність у лініях 1А, 9А, 10А, 11 А та 16А контролюється одним головним геном, групи F2:3 мають сегрегуватися і відповідати співвідношенню 1:2:1 груп гомозиготної резистентності: сегрегації: гомозиготної чутливості. Оцінка груп F2:3 показала, що гібриди Teal х 1А, Teal х 9А, Teal x 10A, Teal x 11 А та Teal x 16A усі відповідають співвідношенню групи F2:3 1:2:1 резистентності: сегрегації: чутливості зі значеннями Р Chi-squares 0,64, 0,66, 0,52, 0,40 та 0,94, відповідно (Фігура 3). Ці результати підтверджують результати даних для F2 та BCF1, за якими резистентність у лініях 1А, 10А, 9А, 11А та резистентність у 16А контролюється одним головним геном. Ця модель спадковості узгоджується з іншими даними, які свідчили про генетичний контроль резистентності до інгібуючих AHAS гербіцидів. На даний час майже всі мутації рослин, які забезпечують резистентність до імідазолінонів, демонструють, що єдиний, частково домінантний ген контролює характеристику резистентності. У Triticun aestivum, Zea mays, Glycine max, Arabidopsis thaliana та Nicotiana tabacum резистентність до інгібіторів AHAS успадковується як єдиний частково домінантний ядерний ген (Newhouse et al. 1991; Newhouse et al. 1992; Chaleff and Ray, 1984 Science 223:1148-1151; Sathasivan et al., 1991 Plant Physiol. 97:1044-1050). Резистентність рослин до інгібуючих AHAS гербіцидів відбувається здебільшого через одиночну мутацію в гені, що кодує фермент AHAS (Harms et al. 1992, Моl. Gen. Genet. 233:427-435; Winder and Spalding, 1988 Моl. Gen. Genet. 238:394-399). Дані для популяції F2, одержаної в результаті схрещування Teal x 15А, відповідали співвідношенню 15:1 резистентності:чутливості, вказуючи на сегрегацію двох незалежно сегрегованих локусів (Фігура 2). Якщо це так, то групи F2:3 мають сегрегуватися і відповідати співвідношенню групи F2:3 7:8:1 резистентності:сегрегації:чутливості. Групи F2:3 від схрещування 15А х Teal не відповідали очікуваному співвідношенню 7:8:1 (Фігура 3), підтверджуючи результати для популяцій F2 та BCF1, які свідчили про те, що резистентність у 15А забезпечується двома незалежними локусами. Наскільки відомо винахідникові, це перший повідомлений випадок, коли дві незалежно сегреговані резистентні даімідазолінону алелі були ідентифіковані в одній лінії після мутагенезу насіння. Приклад 4 Результати, що стосуються алелізму ІМІ генів. Для визначення алельних взаємозв'язків генів резистентності досліджували всі можливі схрещування між резистентними лініями. Не спостерігали чутливих рослин у популяціях F2, одержаних у результаті взаємного схрещування між лініями SWP965001, 1А, 9А, 10А, 15А та 16А (Фігура 4). Оскільки ці популяції не сегрегувалися, гени резистентності в цих лініях є або алелями в локусі FS-4, або є дуже щільно зв'язаними. Оскільки ці популяції не сегрегувалися в поколінні F2, групи F2:3 від цих схрещувань не досліджували. Усі схрещування за участі лінії 11А сегрегувалися в поколінні F2, вказуючи на присутність унікального гена резистентності у 11А (Фігура 4). У разі присутності двох незалежно сегрегованих генів резистентності в результаті схрещування двох ліній, кожна з яких несе один ген резистентності, слід очікувати співвідношення 15:1 резистентності: чутливості в поколінні F2. У поколінні F2, гібриди SWP965001 × 11А, 1А х 11А, 10А х 11А та 16А х 11А відповідають очікуваному співвідношенню 15:1 резистентності:чутливості, вказуючи на незалежну сегрегацію 20 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 двох головних генів резистентності (Фігура 4). Співвідношення у групі F2:3 від цих схрещувань також відповідали співвідношенням 7:8:1 резистентності: сегрегації: чутливості, підтверджуючи результати, отримані для покоління F2 (Фігура 5). Гібрид 11А х 9А давав сегреговану популяцію F2, але співвідношення не відповідало показникові сегрегації 15:1 через надлишок чутливих сегрегантів. Випробували різні інші дводенні гіпотези, але всі виявилися високозначущими (дані не показано). Однак, оцінка груп F2:3 від цього схрещування відповідала показникові сегрегації 7:8:1, вказуючи на сегрегацію двох незалежних генів (Фігура 5). Ці результати підтверджують, що ген резистентності у 11А є відмінним від генів у лініях SWP96001, 1А, 9А, 10А та 16А. Гібрид 11А х 15А не давав сегрегованої популяції F2. Оскільки 15А несе два гени резистентності, один алельний до FS-4, сегрегована популяція F2 у гібриді 11А х 15А має вказувати на присутність трьох сегрегованих генів. Сегреговані покоління, одержані в результаті схрещування 15А х 11А, було випробувано на сегрегацію трьох незалежних локусів. Рослини F2 відповідали очікуваному співвідношенню 63:1 резистентності:чутливості, вказуючи на сегрегацію трьох незалежних локусів (Фігура 4). Ці результати вказують на те, що друга мутація у 15А не є алельною генові резистентності у 11А. Групи F2:3 не піддавали відборові, оскільки довелося б відбирати понад 330 рослин у кожній групі, щоб забезпечити достатню потужність критерію (Hanson, 1959 Agron. J. 51:711-716). Було ідентифіковано три незалежні локуси резистентності, кожен з яких мав алель, яка забезпечує резистентність до імазамоксу. Опубліковано рекомендовані правила для генного локусу та символізації алелей (Mclntosh et al., 1998 Catalogue of Gene Symbols. Volume 5, th Proceedings of the 9 International Wheat Genetics Symposium. Saskatoon, Saskatchewan). Неалельні генні локуси ферменту, які каналізують одну реакцію, мають позначатися однаковим символом, який відповідає традиційній назві ферменту. Традиційною назвою для AHAS є ALS. За відсутності даних для призначення локусів для конкретних хромосом та геномів вони позначаються послідовною серією. Позначення фенотипу, який спостерігають у разі змін у гені, в результаті чого виникає нова алель, має відображати цей фенотип. Таким чином, пропонується, щоб алель резистентності до імідазолінону FS-4 позначалася як Imi1, а її локус – позначався як Als1. Imi означає резистентність до імідазолінону. Це позначення вказує, що ген є домінантною характеристикою, і він є першою ідентифікованою алеллю. Дані для сегрегованих популяцій F2 та F2:3 вказують, що 15А та 11А несуть дві нові незалежні алелі резистентності в різних локусах (Фігури 2 та 3). Позначеннями для цих алелей є Imi2 для мутації 11А в локусі Als2 і Imi3 для другої мутації 15А в локусі Als3. Авторами було ідентифіковано три незалежно сегреговані алелі, які забезпечують резистентність до імазамоксу, а саме, Imi1 (1А, 9А, 10А, 15А та 16А), Imi2 (11А) та Imi3 (15А). Пропонується, щоб кожна з трьох ідентифікованих алелей пов'язувалася зі своїм структурним геном, який кодує нечутливі до гербіциду форми AHAS. Оскільки пшениця є гексаплоїдною, слід очікувати багато локусів AHAS. Було виявлено, що інші поліплоїдні види мають більше однієї копії AHAS. У Nicotiana tabacum, алотетраплоїді, було ідентифіковано і охарактеризовано два гени AHAS (Mazur et al. 1987). Chaleff and Ray (1984) ідентифікували два незалежно сегреговані алелі резистентності до сульфонілсечовини в Nicotiana tabacum, кожна з яких кодує змінену форму AHAS. Zea mays має два конститутивно експресовані ідентичні гени AHAS (Fang et al., 1992 Plant Моl. Biol. 18:1185-1187). В алотетраплоїді Brassica napus та Gossypium hirsutum присутня багатогенна група AHAS, яка складається з п'яти та шести членів, відповідно (Rutledge et al., 1991 Моl Gen. Genet. 229:31-40; Grula et al., 1995 Plant Моl. Biol. 28:837-846). Вищий рівень резистентності до гербіцидів спостерігали в поліплоїдних видах у разі присутності багатьох алелей резистентності. Swanson et al. (1989 Theor. Appl. Gen. 78:525-530) комбінували дві унікальні алелі резистентності до імідазолінону з двох гомозиготних ліній Brassica napus, в результаті чого одержували потомство з вищим рівнем резистентності, ніж у кожної з цих гомозиготних ліній окремо. Creason and Chaleff (1988 Theor. Appl. Genet. 76:177-182) ідентифікували рослини Nicotiana tabacum, гомозиготні для двох мутацій, які забезпечували резистентність до сульфонілсечовини. Рослини, гомозиготні для обох мутацій, були в п'ять разів більш резистентними до нанесення на листя хлорсульфурону, ніж рослини, гомозиготні для кожної окремо мутації. Даний винахід пропонує вироблення вищого рівня резистентності до імідазолінонового гербіциду у пшениці шляхом комбінування будь-яких двох або всіх трьох алелей резистентності. Приклад 5 Толерантність до імідазолінонових гербіцидів у Teal 11A, Teal11A та гібриді Теаl11А/15А Підвищена толерантність, яку демонструють Teal 11А та Teal 15A до 20 грамів на гектар імазамоксу, підтверджувалася в наведених вище прикладах можливістю відрізнення толерантних від чутливих батьківських та сегрегованих рослин у дослідженні успадкування. 21 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Було виявлено, що Teal 11А забезпечує такий самий рівень толерантності до імідазолінонових гербіцидів, як і той, що забезпечується мутацією FS4 у Fidel у різних оранжерейних та польових порівняннях. Подібність толерантності також відбивається в порівнянні in vitro активності AHAS, видобутої з толерантних рослин. Це є можливим, оскільки толерантність у Teal 11А, Teal 15A та FS4 зумовлюється мутаціями у ферменті AHAS, що забезпечує резистентність до інгібування імідазоліноновими гербіцидами. Фігура 6 вказує, що активність ферменту AHAS, видобутого з Teal 11А та BW755, лінії, що містить FS4, змінює подібність зі збільшенням норми імазамоксу, й обидва мають вищий відсоток активного (резистентного) ферменту при найвищій концентрації імазамоксу, ніж у контрольної рослини Teal дикого типу. Присутність двох ІМІ нуклеїнових кислот у Teal 15A забезпечує підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів порівняно з такою лінією, як BW755, що має лише одну ІМІ нуклеїнову кислоту. Ця підвищена толерантність відбивається й у меншому ураженні при більш високих нормах гербіциду, й у більшій неінгібованій активності AHAS ферменту. Фігура 7 пояснює, що при Юх нормі імазамоксу (200 г/га) усі оброблені одногенні рослини зазнавали ураження, тоді як жодна з двогенних рослин не була ураженою. При всіх концентраціях імазамоксу в in vitro аналізі активності AHAS (Фігура 6), але особливо – при найвищих концентраціях, рослина Теаl 15А мала вищий відсоток активного (резистентного) ферменту, ніж у будь-якої з моногенних ліній, Теаl 11А та В)У755. Комбінування трьох неалельних генів, кожен з яких забезпечує толерантність "I імідазолінонових гербіцидів, у результаті дає більшу толерантність, шж у разі лише двох „еалельних генів (Фігура 7). При нормі 30Х або 600 т/га імазамоксу більше половини рослин не витримали уражень у ще сегрегованій змішаній популяції Teal 11A, схрещеній з Teal 15А, тоді як усі рослини гомозиготної популяції Teal 15А витримали ураження. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Рослина пшениці, що містить IMI нуклеїнову кислоту, причому рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу, де IMI нуклеїнова кислота являє собою В-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi2) нуклеїнову кислоту, розташовану на локусі Als2, причому нуклеїнова кислота кодує IMI поліпептид, який має мутацію в Домені Е, що виявляється в заміщенні серину на аспарагін в IMI білку, порівняно з білком AHAS дикого типу. 2. Рослина пшениці за п. 1, у якій Imi2 нуклеїнова кислота вибрана з групи, що включає: a) полінуклеотиди, які включають SEQ ID NO:3; b) полінуклеотиди, які кодують поліпептиди, що включають SEQ ID NO:4; та c) полінуклеотиди, які кодують IMI поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептиди включають заміщення серину на аспарагін в Домені Е. 3. Рослина пшениці за п. 2, у якій Imi2 нуклеїнова кислота включає полінуклеотид, що містить SEQ ID NO:3. 4. Рослина пшениці за п. 2, у якій Imi2 нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4. 5. Рослина пшениці за п. 1, де рослина пшениці додатково включає IMI нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка включає Imi1 нуклеїнову кислоту та Imi3 нуклеїнову кислоту. 6. Рослина пшениці за п. 5, де рослина пшениці включає дві IMI нуклеїнові кислоти. 7. Рослина пшениці за п. 5, де рослина пшениці включає три IMI нуклеїнові кислоти. 8. Рослина пшениці за п. 1, де імідазоліноновий гербіцид вибраний з 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинової кислоти, сумішей метил 6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-m-толуату і метил 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-p-толуату та їх сумішей. 9. Рослина пшениці за п. 8, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту. 10. Рослина пшениці за п. 8, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинову кислоту. 11. Рослинна частина рослини пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де рослинна частина включає зазначену IMI нуклеїнову кислоту. 22 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12. Рослинна клітина рослини пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де рослинна клітина включає зазначену IMI нуклеїнову кислоту. 13. Насіння, вироблене рослиною пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де насіння включає зазначену IMI нуклеїнову кислоту. 14. Насіння за п. 13, де насіння являє собою розведення гомозигот для підвищеної резистентності до імідазолінонового гербіциду, порівняно з насінням сорту рослини пшениці дикого типу. 15. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де рослина є трансгенною. 16. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де рослина не є трансгенною. 17. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де рослина пшениці являє собою гібридну рослину рослинної лінії Teal IMI 11A та іншої рослини пшениці, де представницький зразок насіння лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3953. 18. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 1-7, де рослина пшениці являє собою гібрид між рослинами ліній Teal IMI 11A або їх потомства, де представницький зразок насіння гібридної лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3954; та рослини пшениці, яка включає IMI нуклеїнову кислоту, де рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду, порівняно з різновидами рослини дикого типу, де IMI нуклеїнова кислота являє собою D-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi1) нуклеїнову кислоту, розташовану на локусі Als1, причому нуклеїнова кислота кодує IMI поліпептид, який має мутацію в Домені Е, що виявляється в заміщенні серину на аспарагін в IMI білку, порівняно з білком AHAS дикого типу. 19. Виділена, мутагенізована, рекомбінантна або генно-інженерна IMI нуклеїнова кислота, яка включає полінуклеотид, вибраний з групи, яка включає: a) полінуклеотиди, які включають SEQ ID NO:3; b) полінуклеотиди, які кодують поліпептид, який включає SEQ ID NO:4; та c) полінуклеотиди, які кодують будь-який поліпептид, що має амінокислотну послідовність, принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептид включає заміщення серину на аспарагін в Домені Е, де полінуклеотид, отриманий з лінії Teal IMI 11A, де представницький зразок насіння лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3953. 20. Виділена IMI нуклеїнова кислота за п. 19, яка включає полінуклеотид SEQ ID NO:3. 21. Виділена IMI нуклеїнова кислота за п. 19, яка включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4. 22. Спосіб боротьби з бур'янами в оточенні рослини пшениці, який включає нанесення імідазолінонового гербіциду на бур'яни та рослину пшениці, де рослина пшениці, містить IMI нуклеїнову кислоту та має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду, порівняно з різновидами рослини пшениці дикого типу, де IMI нуклеїнова кислота являє собою В-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi2) нуклеїнову кислоту, розташовану на локусі Als2, причому нуклеїнова кислота кодує IMI поліпептид, який має мутацію в Домені Е, що виявляється в заміщенні серину на аспарагін в IMI білку, порівняно з білком AHAS дикого типу. 23. Спосіб за п. 22, у якому Imi2 нуклеїнова кислота вибрана з групи, що включає: a) полінуклеотиди, які включають SEQ ID NO:3; b) полінуклеотиди, які кодують поліпептиди, що включають SEQ ID NO:4; та c) полінуклеотиди, які кодують IMI поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептиди включають заміщення серину на аспарагін в Домені Е. 24. Спосіб за п. 23, у якому IMI нуклеїнова кислота включає полінуклеотид SEQ ID NO:3. 25. Спосіб за п. 23, у якому IMI нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4. 26. Спосіб за п. 22, у якому рослина пшениці додатково включає IMI нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка включає Imi1 нуклеїнову кислоту та Imi3 нуклеїнову кислоту. 27. Спосіб за п. 26, у якому рослина пшениці включає дві IMI нуклеїнові кислоти. 28. Спосіб за п. 26, у якому рослина пшениці включає три IMI нуклеїнові кислоти. 29. Спосіб за будь-яким з пп. 22-28, у якому рослина пшениці являє собою рослину лінії Teal 11A або її потомства, де представницький зразок насіння лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3953. 30. Спосіб за будь-яким з пп. 22-28, у якому рослина пшениці являє собою гібрид між рослинами ліній Teal 11A та FS4, або їх потомства, де представницький зразок насіння гібридної лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3954. 23 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 31. Спосіб модифікації толерантності рослини до імідазолінонового гербіциду, який включає модифікацію експресії IMI нуклеїнової кислоти за допомогою вектора експресії, що містить IMI нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка включає: a) полінуклеотиди, які включають SEQ ID NO:3; b) полінуклеотиди, які кодують поліпептид, що включає SEQ ID NO:4; та c) полінуклеотиди, які кодують будь-який поліпептид, що має амінокислотну послідовність принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептид включає заміщення серину на аспарагін в Домені Е. 32. Спосіб за п. 31, у якому IMI нуклеїнова кислота включає полінуклеотид SEQ ID NO:3. 33. Спосіб за п. 31, у якому IMI нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4. 34. Спосіб за п. 31, у якому спосіб додатково включає модифікацію експресії IMI нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, яка включає Imi1 нуклеїнову кислоту та Imi3 нуклеїнову кислоту. 35. Спосіб одержання трансгенної рослини з підвищеною резистентністю до імідазолінонового гербіциду, який включає a) трансформацію рослинної клітини вектором експресії, що містить IMI нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка включає: i) полінуклеотиди, які включають SEQ ID NO:3; ii) полінуклеотиди, які кодують поліпептид, що включає SEQ ID NO:4; та iii) полінуклеотиди, які кодують будь-який поліпептид, що має амінокислотну послідовність, принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептид включає заміщення серину на аспарагін в Домені Е, та b) вирощування з рослинної клітини трансгенної рослини з підвищеною резистентністю до імідазолінонового гербіциду, порівняно з сортом рослини дикого типу. 36. Спосіб за п. 35, у якому IMI нуклеїнова кислота включає полінуклеотид SEQ ID NO:3. 37. Спосіб за п. 35, у якому IMI нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4. 38. Спосіб за п. 35, у якому рослина пшениці додатково включає IMI нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка включає Imi1 нуклеїнову кислоту та Imi3 нуклеїнову кислоту. 39. Рослина пшениці, що містить множину IMI нуклеїнових кислот, причому рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду, порівняно з різновидами рослини дикого типу, де нуклеїнові кислоти мають походження від різних геномів, причому принаймні одна з множини IMI нуклеїнових кислот являє собою В-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi2) нуклеїнову кислоту, розташовану на локусі Als2, причому принаймні одна з множини IMI нуклеїнових кислот кодує IMI поліпептид, який має мутацію в Домені Е, що виявляється в заміщенні серину на аспарагін в IMI білку, порівняно з білком AHAS дикого типу. 40. Рослина пшениці за п. 39, у якій принаймні одна з множини IMI нуклеїнових кислот являє собою полінуклеотид, що містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що включає: i) полінуклеотиди, які включають SEQ ID NO:3; ii) полінуклеотиди, які кодують поліпептиди, що включають SEQ ID NO:4; та iii) полінуклеотиди, які кодують IMI поліпептиди, що мають амінокислотну послідовність, принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептиди включають заміщення серину на аспарагін в Домені Е. 41. Рослина пшениці за п. 39, у якій одна з IMI нуклеїнових кислот включає полінуклеотидну послідовність, визначену в SEQ ID NO:3. 42. Рослина пшениці за п. 39, у якій одна з IMI нуклеїнових кислот включає полінуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид SEQ ID NO:4. 43. Рослина пшениці за п. 39, у якій одна з IMI нуклеїнових кислот включає полінуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який має амінокислотну послідовність, принаймні на 90 % ідентичну до SEQ ID NO:4, причому поліпептиди включають заміщення серину на аспарагін в Домені Е. 44. Рослина пшениці за п. 39, яка включає дві IMI нуклеїнові кислоти. 45. Рослина пшениці за п. 44, у якій друга IMI нуклеїнова кислота являє собою Imi1 нуклеїнову кислоту. 46. Рослина пшениці за п. 39, яка включає три IMI нуклеїнові кислоти. 47. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 39-46, де рослина пшениці являє собою гібридну рослину рослинної лінії Teal IMI 11A та другої рослини пшениці, де представницький зразок насіння лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3953. 24 UA 104990 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 48. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 39-46, де рослина пшениці являє собою гібрид між рослинами ліній Teal IMI 11A або їх потомства, де представницький зразок насіння гібридної лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3954; та рослини пшениці, яка включає IMI нуклеїнову кислоту, де рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду порівняно з різновидами рослини дикого типу, де IMI нуклеїнова кислота являє собою D-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi1) нуклеїнову кислоту, розташовану на локусі Als1, причому нуклеїнова кислота кодує IMI поліпептид, який має мутацію в Домені Е, що виявляється в заміщенні серину на аспарагін в IMI білку, порівняно з білком AHAS дикого типу. 49. Рослина пшениці за п. 39, де імідазоліноновий гербіцид вибраний з 2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинової кислоти, сумішей метил 6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-m-толуату і метил 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-p-толуату та їх сумішей. 50. Рослина пшениці за п. 49, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту. 51. Рослина пшениці за п. 49, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинову кислоту. 52. Рослинна частина рослини пшениці за п. 39, де рослинна частина включає зазначену множину IMI нуклеїнових кислот. 53. Рослинна клітина рослини пшениці за п. 39, де рослинна клітина включає зазначену множину IMI нуклеїнових кислот. 54. Насіння рослини пшениці за п. 39, де насіння включає зазначену множину IMI нуклеїнових кислот. 55. Насіння за п. 54, де насіння являє собою розведення гомозигот для підвищеної резистентності до імідазолінонового гербіциду, порівняно з насінням сорту рослини пшениці дикого типу. 56. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 39-46, де рослина є трансгенною. 57. Рослина пшениці за будь-яким з пп. 39-46, де рослина не є трансгенною. 58. Спосіб боротьби з бур'янами в оточенні рослини пшениці, який включає нанесення імідазолінонового гербіциду на бур'яни та рослину пшениці, де рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду, порівняно з різновидами рослини пшениці дикого типу, причому рослина пшениці являє собою рослину пшениці за будь-яким з пп. 39-48. 59. Спосіб за п. 58, де імідазоліноновий гербіцид вибраний з 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл)-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-3хінолінкарбонової кислоти, 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинової кислоти, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-метилнікотинової кислоти, сумішей метил 6-(4ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-m-толуату і метил 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-p-толуату та їх сумішей. 60. Спосіб за п. 58, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 5-етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5оксо-2-імідазолін-2-іл)-нікотинову кислоту. 61. Спосіб за п. 58, де імідазоліноновий гербіцид являє собою 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)-нікотинову кислоту. 62. Насіння рослини пшениці, де рослина пшениці має підвищену резистентність до імідазолінонового гербіциду, порівняно з різновидами рослини дикого типу, причому зазначена рослина пшениці являє собою гібрид з першої рослини пшениці та другої рослини пшениці, де перша рослина пшениці являє собою рослину лінії Teal 11A, де представницький зразок насіння лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3953. 63. Насіння за п. 62, де друга рослина пшениці включає IMI нуклеїнову кислоту, яка являє собою D-геномну імідазолінон толерантну Als алель (Imi1) нуклеїнову кислоту, розташовану на локусі Als1, причому зазначена нуклеїнова кислота кодує IMI поліпептид, який має мутацію в Домені Е, що виявляється в заміщенні серину на аспарагін в IMI білку, порівняно з білком AHAS дикого типу. 64. Насіння за п. 62, де друга рослина пшениці являє собою рослину лінії Teal 15A, де представницький зразок насіння лінії був депонований в ATCC з номером патентного депонування PTA-3955. 25 UA 104990 C2 26 UA 104990 C2 27 UA 104990 C2 28