Стійка до гербіцидів рослина соняшнику з множинними стійкими до гербіцидів алелями ahasl1

Реферат: Винахід належить до стійкої до гербіцидів рослини соняшнику, що містить певні мутації в двох різних алелях гена великої субодиниці синтази ацетогідроксикислоти 1 (AHASL1) соняшнику, які забезпечують стійкість до гербіциду, способів одержання такої рослини соняшнику та способів боротьби із бур'янами поблизу рослини соняшнику, що включає застосування гербіцидів, що інгібують синтазу ацетогідроксикислот, для обробки зазначеної рослини соняшнику. Винахід також належить до способів визначення генотипу рослини соняшнику для гена AHASL1. UA 102223 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Даний винахід відноситься галузі сільського господарства, особливо, до стійких до гербіцидів рослин соняшника, що містять два різні стійкі до гербіцидів алелей гену великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот 1 (AHASL1) соняшника. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Синтаза ацетогідроксикислот (AHAS; EC 4.1.3.18, також відома, як ацетолактат синтаза, чи ALS), є першим ферментом, що каталізує біохімічний синтез розгалужених ланцюгових амінокислот валіну, лейцину та ізолейцину (Singh (1999) "Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine, " у Plant Amino Acids, Singh, B.K., ed., Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227247). AHAS є місцем прикладення дії чотирьох структурно та хімічно різних сімейств гербіцидних, включаючи сульфонілсечовини (Tan et al. (2005) Pest Manag. Sci. 61:246-57; Mallory-Smith and Retzinger (2003) Weed Technology 17:620-626; LaRossa and Falco (1984) Trends Biotechnol. 2:158-161), імідазолінони (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546), тріазопіримідини (Subramanian and Gerwick (1989) "Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines, " у Biocatalysis in Agricultural Biotechnology, Whitaker, J.R. and Sonnet, P.E… eds., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, D.C., pp. 277-288), та пирімидінілоксибензоати (Subramanian et al. (1990) Plant Physiol. 94: 239-244). Гербіциди на основі імідазолінонів та сульфонілсечовин широко застосовують у сучасному сільському господарстві через їх ефективність при дуже низьких частках внесення та відносній нетоксичності у тварин. Шляхом інгібування активності AHAS, ці сімейства гербіцидів попереджають подальший ріст та розвиток сприйнятливих рослин, включаючи багато видів бур'янів. Декілька прикладів комерційно доступних гербіцидів на основі імідазолінону являють PURSUIT® (імазетапір), SCEPTER® (імазахін) та ARSENAL® (імазапір). Приклади гербіцидів на основі сульфонілсечовин є хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлорімурон етил, тіфенсульфурон метил, трібенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, рімсульфурон, тріфлусульфурон метил, тріасульфурон, прімісульфурон метил, ціносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон етил та галосульфурон. Через високу ефективність та низьку токсичність, гербіциди на основі імідазолінонів є переважними для нанесення шляхом розпилення зверху на широку область рослинності. Можливість розпилення гербіциду зверху на широку область рослинності зменшує витрати, пов'язані укоріненням та збереженням рослин та зменшує потребу у підготовці місця до застосування таких хімічних речовин. Розпилення зверху на бажані стійкі до тіні види також призводить до здатності досягати максимального потенційно можливого врожаю бажаних видів через відсутність конкуруючих видів. Проте, здатність до застосування таких методик розпилення зверху залежить від наявності стійких до імідазолінону видів бажаної вегетації в області розпилення. Серед основних сільськогосподарських культур, деякі бобові культури, таки, як соя, є природно стійкими до гербіцидів на основі імідазолінонів через їх здатність до швидкого метаболізму гербіцидних сполук (Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Інші культури, такі, як кукурудза (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886) та рис (Barrett et al. (1989) Crop Safeners for Herbicides, Academic Press, New York, pp. 195-220) деякою мірою сприйнятливі до гербіцидів на основі імідазолінонів. Різна чутливість до гербіцидів на основі імідазолінонів залежить від хімічної природи конкретного гербіциду та різного метаболізму сполуки, від токсичної до нетоксичної форми у кожної рослини (Shaner et al. (1984) Plant Physiol. 76:545-546; Brown et al., (1987) Pestic. Biochem. Physiol. 27:24-29). Інші фізіологічні відмінності рослин, такі, як поглинання та транслокація, також відіграють важливу роль у чутливості (Shaner and Robinson (1985) Weed Sci. 33:469-471). Рослини, стійкі до імідазолінонів, сульфонілсечовин, тріазолопіримідинів та пирімидинілоксибензоатів були успішно одержані за допомогою мутагенезу насіння, мікроспор, запилення та каллюсу у Zea mays, Arabidopsis thaliana, Brassica napus (тобто, канола) Glycine max, Нікоtiana tabacum, цукровий буряк (Beta vulgaris) та Oryza sativa (Sebastian et al. (1989) Crop Sci. 29:1403-1408; Swanson et al., 1989 Theor. Appl. Genet. 78:525-530; Newhouse et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 83:65-70; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol. 97:1044-1050; Mourand et al. (1993) J. Heredity 84:91-96; Wright and Penner (1998) Theor. Appl. Genet. 96:612-620; Патент США № 5,545,822). В усіх випадках, один частково домінантний ядерний ген надає стійкість. Чотири стійкі до імідазолінону рослини пшениці були також раніше виділені після мутагенезу рослин Triticum aestivum L. cv. Fidel (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Дослідження спадковості підтвердили, що один частково домінантний ядерний ген надавав стійкість. На підставі досліджень алелів, автори дійшли до висновку, що мутації у чотирьох 1 UA 102223 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ідентифікованих лініях були розташовані у тому ж самому локусі. Один з генів стійкості культивару Fidel був позначений як FS-4 (Newhouse et al. (1992) Plant Physiol. 100:882-886). Популяції рослин, що зустрічаються у природі, що. як було відкрито, є стійкими до гербіцидів на основі імідозолінону та/або сульфонілсечовини, також застосовували для розробки генеалогічних ліній соняшника, стійкого до гербіцидів. Нещодавно були розроблені дві лінії соняшника, стійкі до гербіцидів на основі сульфонілсечовини за допомогою ідіоплазми, що походила з дикої популяції соняшника звичайного (Helianthus annuus) як джерела стійкості до гербіцидів (Miller and Al-Khatib (2004) Crop Sci. 44:1037-1038). Раніше White et al. ((2002) Weed Sci. 50:432-437) повідомляли, що індивідууми з дикої популяції соняшника звичайного з Південної Дакоти, США, були перехресно стійкі до гербіциду на основі імідазолінoну та сульфонілсечовини. Аналіз частини кодуючої ділянки генів великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот (AHASL) індивідуумів з цієї популяції вивив точкову мутацію, що призводить до амінокислотного заміщення Ala-to-Val у протеїні AHASL соняшника, що відповідає Ala205 у протеїні Arabidopsis thaliana AHASL дикого типу (White et al. (2003) Weed Sci. 51:845-853). Раніше Al-Khatib та Miller ((2000) Crop Sci. 40:869) повідомили про одержання генеалогічних ліній чотирьох рослин соняшника стійких до імідазолінонів. Комп'ютерне моделювання трьохмірної конформації комплексу AHAS-інгібітор передбачає декілька амінокислот у запропонованому інгібітор-звязуючому "кармані" як сайтів, де індуковані мутації можуть, вірогідно, надавати селективну стійкість до імідазолінонів (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Рослини тютюну, одержані за деякими з таких раціонально розроблених мутацій у запропонованих сайтах зв'язування ферменту AHAS, фактично мають виражену специфічну стійкість до одного класу гербіцидів (Ott et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:359-368). Про стійкість рослин до гербіцидів на основі імідазолінонів також було повідомлено у низці патентів. У патентах США №№ 4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 та 6,222,100 загалом описано застосування зміненого гену AHAS для того, щоб викликати стійкість до гербіцидів у рослин, та конкретно описані деякі лінії кукурудзи, стійкі до імідазолінонів. У патенті США № 5,013,659 описано рослини, що проявляють стійкість до гербіцидів через мутації у, щонайменше, одній амінокислоті в одному чи більше консервативних ділянок. Мутацій, описані у цій заявці, кодують або перехресний імунітет до імідазолінонів та сульфонілсечовин, чи стійкість, специфічну до сульфонілсечовин, але імідазолінон-специфічна стійкість не описана. У патенті США № 5,731,180 та патенті США № 5,767,361 обговорено виділений ген, що має одне амінокислотне заміщення в односім'ядольній AHAS амінокислотній послідовності дикого типу, що призводить до імідазолінон-специфічної стійкості. Додатково, було розроблено рослини рису, стійкі до гербіцидів, що схрещуються із AHAS шляхом мутаційної селекції та також відбору стійких до гербіцидів рослин з пулу рослин рису, продукованих іншою культурою. Див. патенти США №№ 5,545,822, 5,736,629, 5,773,703, 5,773,704, 5,952,553 та 6,274,796. У рослинах, як у всіх інших досліджених організмах, фермент AHAS складається з двох субодиниць: великої субодиниці (каталітична роль) та малої субодиниці (регуляторна роль) (Duggleby and Pang (2000) J. Biochem. Mol. Biol. 33:1-36). AHAS велика субодиниця (що у цій заявці також має назву AHASL) може бути кодована одним геном, як у випадку Arabidopsis та цукрового буряку, або членами сімейства множинних генів, як у випадку маїсу, каноли та бавовни. Специфічні однонуклеотидні заміщення у великій субодиниці надають ферменту ступінь нечутливості до одного чи більше класів гербіцидів (Chang and Duggleby (1998) Biochem J. 333:765-777). Наприклад, пшениця звичайна, Triticum aestivum L., містить три гомогенні гени великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот. Кожен з генів проявляє значну експресію, виходячи з гербіцидного відклику та біохімічних даних, одержаних від мутантів у кожному з трьох генів (Ascenzi et al. (2003) International Society of Plant Molecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17). Кодуючі послідовності усіх трьох генів мають екстенсивну гомологію на нуклеотидному рівні (WO 03/014357). Шляхом секвенування генів AHASL декількох видів Triticum aestivum, було знайдено, що молекулярна основа переносності гербіцидів у більшості IMI-стійких (стійких до імідазолінону) ліній є мутацією S653(At)N, що вказує на заміщення серіну на аспарагін у положенні, еквівалентному положенню серину 653 в амінокислоті у Arabidopsis thaliana (WO 03/01436; WO 03/014357). Ця мутація викликана поліморфізмом одного нуклеотиду (SNP) у ДНК послідовності, що кодує протеїн AHASL. Також відомо, що множинні гени AHASL зустрічаються у дводольних видах рослин. Нещодавно, Kolkman et al. ((2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1147-1159) повідомили про ідентифікацію, клонування та секвенування трьох генів AHASL (AHASL1, AHASL2, та AHASL3) зі стійких до гербіцидів генотипів дикого типу соняшника (Helianthus annuus L.). Kolkman et al. повідомили, що стійкість до гербіцидів була викликана або Pro197Leu (з використанням 2 UA 102223 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 номенклатури амінокислотного положення Arabidopsis AHASL) заміщенням, або Ala205Val заміщенням у AHASL1 протеїні, та що кожне з цих заміщень забезпечувало стійкість як до гербіцидів на основі імідазолінону, так і до гербіцидів на основі сульфонілсечовини. Через високу ефективність та низьку токсичність гербіциди на основі імідазолінонів є переважними для застосування у сільському господарстві. Проте, здатність до застосування гербіцидів на основі імідазолінонів у конкретній системі продукування культур залежить від наявності стійких до імідазолінонів видів культурних рослин, що розглядаються. Для одержання таких стійких до імідазолінонів видів, селекціонери мають розробили генеалогічні лінії, що мають характеристики стійкості до імідазолінонів. Таким чином, існує потреба в додаткових стійких до імідазолінонів генеалогічних лініях та видах культурних рослин, а також у способах та композиціях для одержання та застосування стійких до імідазолінонів генеалогічних ліній та видів. СТИСЛИЙ ОПИС ДАНОГО ВИНАХОДУ Даний винахід забезпечує нові стійкі до гербіцидів рослини соняшника що містять два різні стійкі до гербіцидів гену великої субодиниці синтази ацетогідроксикислот 1 (AHASL1) соняшника. Зокрема, рослини соняшника відповідно до даного винаходу мають підвищену стійкість до гербіцидів, що інгібують синтазу ацетогідроксикислот (AHAS), порівняно із рослиною соняшника дикого типу. Стійкі до гербіцидів рослини соняшника відповідно до даного винаходу містять перший AHASL1 алель та другий AHASL1 алель, де перший та другий AHASL1 алелі кодують перший та другий AHASL1 протеїни соняшника, стійкого до гербіцидів, відповідно. Перший AHASL1 алель кодує AHASL1 протеїн соняшника, що містить A122T амінокислотне заміщення. Другий AHASL1 алель кодує AHASL1 протеїн соняшника, що містить A205V амінокислотне заміщення чи P197L амінокислотне заміщення. Також забезпечені частини рослини соняшника, тканини, клітини та насіння, що містять перший та другий AHASL1 алелі. Даний винахід додатково забезпечує a спосіб одержання гібридної рослини соняшника, що має стійкість до, щонайменше, одного AHAS-інгібуючого гербіциду. Спосіб включає перехресне запилення першої рослини соняшника другою рослиною соняшника таким чином, щоб продукувати гібридне насіння соняшника, що може бути висіяно та матиме можливість вирости у гібридну рослину соняшника, особливо, F1 гібридну рослину соняшника. Перша рослина соняшника містить у геномі, щонайменше, одну копію першого алелю AHASL1 гена, а друга рослина соняшника містить у геномі, щонайменше, одну копію другого алелю AHASL1 гена. Переважно, перша рослина соняшника гомозиготна по першому алелю, а друга рослина соняшника гомозиготна по другому алелю. Перший алель кодує протеїн AHASL1 соняшника, що містить A122T амінокислотне заміщення. Другий алель кодує протеїн AHASL1 соняшника, що містить A205V амінокислотне заміщення чи P197L амінокислотне заміщення. Даний винахід додатково забезпечує способи боротьби із бур'янами чи небажаною вегетацією поблизу до рослини соняшника відповідно до даного винаходу. Один спосіб включає нанесення ефективної кількості AHAS-інгібуючого гербіциду, особливо, гербіциду на основі імідазолініну чи сульфонілсечовини, на бур'яни та на рослину соняшника. Другий спосіб включає контактування насіння соняшника відповідно до даного винаходу перед засіванням та/або після попереднього пророщування із ефективною кількістю AHAS-інгібуючого гербіциду, особливо, гербіциду на основі імідазолініну чи сульфонілсечовини. Даний винахід додатково забезпечує насіння соняшника відповідно до даного винаходу, оброблене ефективною кількістю AHAS-інгібуючого гербіциду. Рослини соняшника та насіння для застосування у цих способах містять у геномах перший AHASL1 алель та другий AHASL1 алель. Перший AHASL1 алель кодує протеїн AHASL1 соняшника, що містить A122T амінокислотне заміщення. Другий AHASL1 алель кодує протеїн AHASL1 соняшника, що містить A205V амінокислотне заміщення чи P197L амінокислотне заміщення. Даний винахід додатково забезпечує способи боротьби з паразитними бур'янами Orobanche cumana та Orobanche cernua, що також відомі як вовчок, на інфікованих рослинах соняшника. Спосіб включає нанесення ефективної кількості гербіциду на основі імідазолінону на бур'яни та на рослину соняшника, стійку до гербіцидів відповідно до даного винаходу, особливо, рослину соняшника, що містить два A122T алелі, та на рослину соняшника, що містить один AHASL1 A122T алель та один A205V AHASL1 алель. Даний винахід забезпечує способи діагностики для визначення алелів AHASL1 гена в індивідуальних рослинах соняшника. Такі способи діагностики включають PCR (полімеразна ланцюгова реакція) ампліфікацію конкретних ділянок AHASL1 гена соняшника за допомогою праймерів, розроблених для гібридизації із конкретними сайтами у гені AHASL1 соняшника, такими, як, наприклад, сайти у мутаціях AHASL1 гена чи поблизу до них. Додатково забезпечені праймери, що застосовують у цих способах та набори для здійснення способів. 3 UA 102223 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 СТИСЛИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1 являє собою графічне представлення впливу нанесення на листя імазапіру на рослину висотою у 14 днів після обробки гомозиготних матеріалів для випадків мутацій A122T та A205V та гетерозиготних генотипів A205+A122T. Середні висоти (% контрольних ділянок) представлені символами та "вусами", що відображають стандартне відхилення від середніх значень. Фігура 2 являє собою графічне представлення впливу нанесення на листя імазапіру на індекс фітотоксичності (PI) через14 днів після обробки гомозиготних матеріалів для випадків мутацій A122T та A205V та гетерозиготних генотипів A205+A122T. Середні значення PI представлені символами та "вусами", що відображають стандартне відхилення від середніх значень. Фігура 3 являє собою графічне представлення впливу нанесення на листя імазапіру на накопичення біомаси через 14 днів після обробки гомозиготних матеріалів для випадків мутацій A122T та A205V та гетерозиготних генотипів A205+A122T. Середні значення сухої біомаси (% контрольних ділянок) представлені символами та "вусами", що відображають стандартне відхилення від середніх значень. Фігура 4 являє собою фотографію продуктів реакції PCR ампліфікації з використанням праймерів p-AHAS18/pAHAS-19 з наступним гель-електрофорезом на агарозі. Лінія 1 GM40 (A122T мутація), Лінія 2: L1 (A205V мутація), Лінія 3 та 4: H3; Лінія 5 та 6: H4; Лінія 7 та 8: H1; Лінія 9 та 10: L2. Фігура 5 являє собою фотографію продуктів реакції PCR ампліфікації рестриктазою з BmgB I наступним гель-електрофорезом на агарозі. Лінія M, Маркер молекулярної маси; Лінія 1: BTK47 (дикого типу); Лінія 2: GM40 (A122T); Лінія 3: F1 рослина від схрещування cmsBTK47 x GM40; та Лінія 4: cmsGM40 (A122T). Фігура 6 являє собою фотографію продуктів реакції PCR ампліфікації, одержаних за допомогою комбінації p-AHAS NIDF / AHAS 122 TMU. Лінія 1, Маркер молекулярної маси (25bp маркер), Лінія 2, Маркер молекулярної маси (100bp маркер), Лінія 3, 122 гомозиготний індивідуум, Лінія 4, 205 гомозиготний індивідуум, Лінія 5, 197 гомозиготний індивідуум, Лінія 6, ДИКОГО ТИПУ (Гаплотип 1), Лінія 7, 122/ДИКОГО ТИПУ індивідуум Лінія 8, 122/205 індивідуум, Лінія 9, 122/197 індивідуум, Лінія 10, вода (негативний контроль), Лінія 11, Маркер молекулярної маси (25bp маркер), Лінія 12, Маркер молекулярної маси (100bp маркер). Фігура 7 являє собою фотографію продуктів реакції PCR ампліфікації, одержаних за допомогою комбінації p-AHAS NIDF / AHAS 122 TДИКОГО ТИПУ. Лінія 1, Маркер молекулярної маси (25bp маркер), Лінія 2, Маркер молекулярної маси (100bp маркер), Лінія 3, 122 гомозиготний індивідуум, Лінія 4, 205 гомозиготний індивідуум, Лінія 5, 197 гомозиготний індивідуум, Лінія 6, ДИКОГО ТИПУ (Гаплотип 1), Лінія 7, 122/ДИКОГО ТИПУ індивідуум, Лінія 8, 122/205 індивідуум, Лінія 9, 122/197 індивідуум, Лінія 10, вода (негативний контроль), Лінія 11, Маркер молекулярної маси (25bp маркер), Лінія 12, Маркер молекулярної маси (100bp маркер). Фігура 8 являє собою вирівнювання послідовностей, де показано відмінності між нуклеотидними послідовностями AHASL1 гаплотипами соняшника, коли геномна ДНК соняшника кожного гаплотипу (Hap) ампліфікована за допомогою пари праймерів p-AHAS NIDF/AHAS122TWT чи пари праймерів p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU. Положення праймерів вказані стрілками. Положення нуклеотидної послідовності, що кодує (ACC) n повтор (кодує поліThr ділянку у передбачуваному транзитному пептиді) та INDELs у AHASL1 нуклеотиднійпослідовності вказано жирним шрифтом та підкреслено, відповідно. (ACC) n повтор та INDELS вважають такими, що відповідають частині нуклеотидної послідовності AHASL1, що кодує транзитний пептид AHASL1. Положення A122T поліморфізму одного пептиду (SNP) вказано розмірною стрілкою (▼). Номери у кінці послідовностей вказують на очікувану величину кожного гаплотипу при ампліфікації парою праймерів p-AHAS NIDF/AHAS122TWT (Hap1-5) чи p-AHAS NIDF/AHAS 122 TMU (Hap6). Фігура 9 являє собою фотографію продуктів реакції PCR ампліфікації, одержаних за допомогою ДНК екстрактів, взятих з тканин соняшника від рослин, що або гетерозиготні для AHASL1 A122T алелю (HET), гомозиготні (MUTANT) по AHASL1 A122T алелю, чи є рослинами дикого типу у локусі AHASL1 (ДИКОГО ТИПУ). PCR ампліфікацію проводили так, як описано у Прикладі 7, а PCR продукти відділяли за допомогою гель-електрофорезу на 2 % (мас. %) гелю агарози. Фігура 10 являє собою графічне представлення ураження культур (середній % фітотоксичності) при 200 г ai/га імазамоксу, визначеного на 9-12 день після обробки (ліва частина) та 25-30 день після обробки (права частина) на чотирьох польових сайтах 2007 для чотирьох різних видів гібридів. Чотирма сайтами: Velva, ND, USA; Angers, FR; Saintes FR; та 4 UA 102223 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Formosa, AR. Чотири різні види гібридів представлені на Фігурі 10 та являють собою A122T гомозиготний (CLHA-плюс гомо), A122T/A205 (CLHA-плюс/IMISUN гетеро), A122T гетерозиготний (CLHA-плюс гетеро), та A205V гомозиготний (IMISUN гомо). Ліва частина. Фігура 11 являє собою графічне представлення ураження культур різних типів гібридів соняшника, що мають CLHA-Plus мутацію, після нанесення імазамоксу. Чотири різні види гібридів представлені на Фігурі 11 та являють собою A122T гомозиготний (CLHA-плюс гомо), A122T/A205 (CLHA-плюс/ IMISUN гетеро), A122T гетерозиготний (CLHA-плюс/ДИКОГО ТИПУ гетеро), та A205V гомозиготний (IMISUN гомо). Фігура 12 являє собою графічне представлення ураження культур різних типів гібридів соняшника, що мають CLHA-Plus мутацію, після нанесення імазапіру (CLHA-плюс гомозиготний: b=0.20±0.06, P