Рослина, що містить мутацію в домені с анаs білка, яка забезпечує підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів

Реферат: Винахід належить до послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує білок AHAS, яка містить мутації в геномі imi1, домену С, що надає рослинам пшениці, які містять зазначену нуклеїнову кислоту, толерантності до імідазолінонону. Винахід також належить до стійких до імідазолінонових гербіцидів рослин пшениці, що мають зазначену послідовність нуклеїнової кислоти, способів їх отримання та способів контролю бур'янів, що виростають поблизу зазначених рослин пшениці. UA 97623 C2 (12) UA 97623 C2 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується рослин, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. Зокрема, даний винахід стосується рослин, отриманих шляхом мутагенезу, перехресного схрещування та трансформації, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. Ацетогідроксикислотасинтаза (AHAS; EC 4.1.3.18; ацетолактатсинтаза (ALS)), що кодується Als нуклеїновою кислотою, представляє собою перший фермент, що каталізує біохімічний синтез розгалуженого ланцюга амінокислот валіну, лейцину та ізолейцину (Singh В. K., 1999, Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh В. K. (Ed) Plant amino acids. Marcel Dekker Inc. New York, New York. стор. 227-247). AHAS являє собою сайт впливу чотирьох структурно різних сімейств гербіцидів, у тому числі, сульфонілсечовин (LaRossa RA та Falco SC, 1984, Trends Biotechnol. 2: 158-161), імідазолінонів (Shaner та ін., 1984, Plant Physiol. 76: 545-546), триазолпіримідинів (Subramanian та Gerwick, 1989, Inhibition of acetolactate by triazolopyrimidines: в (ред.) Whitaker JR, Sonnet PE Biocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, D.C. стор. 277-288) та піримідилоксибензоатів (Subramanian та ін., 1990, Plant Physiol. 94: 239-244). Гербіциди на основі імідазолінону та сульфонілсечовини широко використовуються у даний момент у сільському господарстві завдяки своїй ефективності при низьких нормах витрати та відносній нетоксичності для тварин. Шляхом інгібування активності AHAS ці сімейства гербіцидів запобігають подальшому розвитку чутливих рослин, у тому числі великої кількості різних видів бур'янів. Деякі приклади комерційно доступних імідазолінонових гербіцидів являють собою PURSUIT® (імазетапір), SCEPTER® (імазаквін) та ARSENAL® (імазапір). Приклади гербіцидів на основі сульфонілсечовини являють собою хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон етил, тіфенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфурон метил, триасульфурон, примісульфурон метил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон етил та галосульфурон. Завдяки своїй високій ефективності та низькій токсичності імідазолінонові гербіциди є сприятливими для застосування шляхом розпилення на надземну частину рослин, що займають значну площу. Здатність гербіциду до розпилення на надземну частину рослин, що займають значну площу, знижує витрати, асоційовані з висаджуванням та вирощуванням, а також знижує необхідність підготовки місця обробки перед застосуванням таких хімічних засобів. Розпилення на надземну частину бажано толерантних видів також приводить до можливості досягнення максимального потенційного врожаю бажаних видів завдяки відсутності конкурентних видів рослин. Однак можливість застосування таких методик на основі розпилення на надземну частину рослин залежить від наявності толерантних до імідазолінону видів бажаних рослин на площі, що піддають впливу розпилення. Серед основних сільськогосподарських культур деякі види бобових рослин є природно толерантними до імідазолінонових гербіцидів завдяки своїй здатності швидко метаболізувати гербіцидні сполуки (Shaner та Robson, 1985, Weed Sci. 33: 469-471). Інші рослини, такі, як кукурудза (Newhouse та ін., 1992, Plant Physiol. 100: 882-886) та рис (Barrett та ін., 1989, Crop Safeners for Herbicides, Academic Press New York, стор. 195-220), є чутливими до імідазолінонових гербіцидів. Різна чутливість до імідазолінонових гербіцидів залежить від хімічної природи конкретного гербіциду та різного метаболізму сполуки від токсичної до нетоксичної форми в кожній рослині (Shaner та ін., 1984, Plant Physiol. 76: 545-546; Brown та ін., 1987, Pestic. Biochem. Physiol. 27: 24-29). Інші фізіологічні відмінності рослин, такі, як поглинання та переміщення речовин, також відіграють важливу роль у чутливості (Shaner та Robson, 1985, Weed Sci. 33: 469-471). Культивари рослин, чутливих до імідазолінонів, сульфонілсечовин та триазолпіримідинів були успішно отримані при використанні мутагенезу насіння, мікроспор, пилку, калусів у Zea mays, Brassica napus, Glycine max тa Nicotiana tabacum (Sebastian та ін., 1989, Crop Sci. 29: 1403-1408; Swanson та ін., 1989, Theor. Appl. Genet. 78: 525-530; Newhouse та ін., 1991, Theor. Appl. Genet. 83: 65-70; Sathasivan та ін., 1991, Plant Physiol. 97: 1044-1050; Mourand та ін., 1993, J. Heredity 84: 91-96). В усіх випадках толерантність забезпечував єдиний частково домінантний ядерний ген. Чотири рослини пшениці, толерантні до імідазолінонів, були також раніше ізольовані за допомогою мутагенезу насіння Triticum oestivum L. cv Fidel (Newhouse та ін., 1992, Plant Physiol. 100: 882-886). Дослідження спадковості підтвердили, що толерантність забезпечує єдиний частково домінантний ген. На основі алельних досліджень автори прийшли до висновку, що мутації в чотирьох ідентифікованих лініях розміщувалися в тому самому локусі. Один з генів толерантності культивару позначали як FS-4 (Newhouse та ін., 1992, Plant Physiol. 100: 882-886). 1 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Комп'ютерне моделювання просторової конформації AHAS-інгібіторного комплексу надало можливості передбачити деякі амінокислоти в запропонованій кишені зв'язування інгібітору як сайти, в яких індуковані мутації, імовірно, забезпечували б селективну толерантність до імідазолінонів (Ott та ін., 1996, J. Моl. Віоl. 263: 359-368). Рослини тютюну, отримані з використанням деяких із цих раціонально відповідних мутацій у запропонованих сайтах зв'язування ферменту AHAS, дійсно демонстрували специфічну толерантність до одного класу гербіцидів (Ott та ін., 1996, J. Моl. Віоl. 263: 359-368). Толерантність рослин до імідазолінонових гербіцидів також була описана в ряді патентів. Патенти США №№ 4,761,373, 5,331,107, 5,304,732, 6,211,438, 6,211,439 та 6,222,100 загалом описують застосування зміненої Als нуклеїновою кислоти для одержання толерантності до гербіцидів у рослин. Патент США №. 5,013,659 описує рослини, що демонструють толерантність до гербіцидів, які мають мутації, принаймні, однієї амінокислоти в одній або більше консервативних ділянок. Описані в цьому патенті мутації кодують або перехресну толерантність для імідазолінонів та сульфонілсечовин, або специфічну для сульфонілсечовини толерантність, однак при цьому специфічна для імідазолінону толерантність не була описана. Крім того, патент США № 5,731,180 та патент США № 5,767,361 обговорюють ізольований ген, що має єдину амінокислотну заміну в амінокислотній послідовності однодольних рослин дикого типу, що приводить до специфічної для імідазолінону толерантності. На сьогоднішній день у рівні техніки не було описано жодних мутацій у гені Als1, які б забезпечували толерантність до імідазолінонового гербіциду, відмінних від мутації в толерантній до імідазолінону лінії FS-4. У рівні техніки також не було описано толерантності до імідазолінону в рослинах пшениці та тритікале, які включають, принаймні, одну змінену Als нуклеїнову кислоту, одержану з Triticum aestivum культивару Shiloh. Таким чином, в області техніки існує потреба в ідентифікації додаткових мутацій, які забезпечують толерантність до імідазолінонових гербіцидів. В області техніки також існує потреба в рослинах пшениці та тритікале, які мають підвищену толерантність до гербіцидів, таким, як імідазолінон, та містять, принаймні, одну Als нуклеїнову кислоту. Також необхідні способи боротьби з ростом бур'янів, що виростають поруч із такими рослинами пшениці та тритікале. Такі композиції та способи дозволили б використати методики обприскування надземної частини при застосуванні гербіцидів до площ, на яких вирощуються рослини пшениці та тритікале. Даний винахід забезпечує рослини пшениці, які включають ІМІ нуклеїнові кислоти, при цьому рослина пшениці має підвищену толерантність імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. Рослини пшениці можуть містити один, два, три або більше ІМІ алелів. В одному втіленні рослина пшениці включає, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту. В іншому втіленні, принаймні, одна нуклеїнова кислота являє собою Imi 1 нуклеїнову кислоту. В іншому втіленні, принаймні, одна ІМІ нуклеїнова кислота включає ІМІ нуклеїнову кислоту Triticum aestivum. В іншому втіленні, принаймні, одна ІМІ нуклеїнова кислота включає ІМІ нуклеїнову кислоту культивару Shiloh. Ще в одному втіленні рослина пшениці включає безліч ІМІ нуклеїнових кислот, які розміщуються в різних геномах. В іншому втіленні численні ІМІ нуклеїнові кислоти включають Imi 1 нуклеїнову кислоту Triticum aestivum культивару Shiloh. Бажано, коли Imi 1 нуклеїнова кислота культивару Shiloh кодує білок, що містить мутацію в консервативній амінокислотній послідовності, вибраної із групи, що складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Ε. Більш бажано, коли мутація перебуває в консервативному Домені С. Також забезпечуються частини рослин та насіння рослин, отримані з рослин пшениці, описаних у даній заявці. Даний винахід також забезпечує рослини тритікале, які включають ІМІ нуклеїнові кислоти, при цьому рослина тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною тритікале дикого типу. В одному втіленні рослина тритікале включає, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту. В іншому втіленні, принаймні, одна нуклеїнова кислота являє собою Imi 1 нуклеїнову кислоту. В іншому втіленні, принаймні, одна ІМІ нуклеїнова кислота включає ІМІ нуклеїнову кислоту Triticum aestivum культивару Shiloh. В іншому втіленні рослина тритікале включає безліч ІМІ нуклеїнових кислот, які розміщуються в різних геномах. Ще в одному втіленні численні ІМІ нуклеїнові кислоти кодують білок, що містить мутацію в консервативній амінокислотній послідовності, вибраній із групи, що складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е. Більш бажано, коли мутація перебуває в консервативному Домені С. Навіть більш бажано, коли мутація кодує поліпептид, що має заміну аланіну на треонін у положенні 96 поліпептиду ALS. Також забезпечуються частини рослин та насіння рослин, які отримані з рослин тритікале, описаних у даній заявці. ІМІ нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом можуть включати полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з полінуклеотиду, як визначено в SEQ ID NO:1; 2 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 полінуклеотидної послідовності, що кодує поліпептид, як визначено в SEQ ID NO:2; полінуклеотиду, що включає, принаймні, 60 послідовних нуклеотидів будь-якого зі згаданих вище полінуклеотидів; полінуклеотиду, комплементарного до будь-якого із згаданих вище полінуклеотидів. Рослини згідно з даним винаходом можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Приклад нетрансгенної рослини пшениці, що володіє підвищеною толерантністю до імідазолінонового гербіциду, являє собою рослину пшениці, що має номер депонування для цілей патентної процедури в АТСС РТА-5625; або мутант, рекомбінант або отриману за допомогою генетичної інженерії похідну рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС РТА5625; або будь-якого нащадка рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС РТА-5625; або рослину, що є нащадком будь-якої з цих рослин. У доповнення до композицій згідно з даним винаходом забезпечуються також кілька способів. У даній заявці описані способи модифікації толерантності рослин до імідазолінонового гербіциду, що включають модифікацію експресії ІМІ нуклеїновою кислоти в рослині. Також описані способи одержання трансгенної рослини, що володіє підвищеною толерантністю до імідазолінонового гербіциду, що включають трансформацію рослинної клітини за допомогою експресійного вектора, що включає одну або більше ІМІ нуклеїнових кислот, та одержання рослини із цієї рослинної клітини. Винахід також включає спосіб боротьби з бур'янами, які виростають поблизу рослини пшениці або тритікале, що передбачає застосування імідазолінонового гербіциду до бур'янів та до рослини пшениці або тритікале, при цьому рослина пшениці або тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною пшениці або тритікале дикого типу, та де рослина включає одну або більше ІМІ нуклеїнових кислот. У деяких кращих втіленнях цих способів рослини включають множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, які розташовані в різних геномах. Також забезпечуються експресійні касети, вектори трансформації, трансформовані хазяйські клітини, відмінні від людських, трансформовані рослини, рослинні клітини, частини рослин та насіння, які включають одну або більше ІМІ нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом. Фігура 1 показує порівняння послідовності кДНК нуклеїновою кислоти Imi 1 Shiloh-8 (SEQ ID NO:1), нуклеїновою кислоти Als1 дикого типу (SEQ ID NO:3) та консенсусної послідовності нуклеїновою кислоти (SEQ ID NO:5). Пара основ, замінена в послідовності Imi 1, позначена жирним шрифтом. Фігура 2 показує порівняння дедукованої амінокислотної послідовності ІМІ1 поліпептиду Shiloh-8 (SEQ ID NO:2), ALS1 поліпептидів дикого типу (SEQ ID NO:4) та консенсусної амінокислотної послідовності (SEQ ID NO:6). Амінокислота, замінена в ІМП амінокислотної послідовності, позначена жирним шрифтом. Фігура 3 є схематичним представленням консервативних амінокислотних послідовностей у генах AHAS, втягнених у толерантність до різних інгібіторів AHAS. Специфічний амінокислотний сайт, відповідальний за толерантність, позначений підкреслюванням (зі зміною від Devine, Μ. D. та Eberlein, С. V., 1997, Physiological, biochemical, and molecular aspects of herbicide tolerance based on altered target sites в: Herbicide Activity: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amersterdam, стор. 159-185). Даний винахід спрямований на ізольовані нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди, які забезпечують підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду, коли експресуються у рослині. Даний винахід також спрямований на рослини пшениці або тритікале, частини рослин пшениці або тритікале та клітини рослини пшениці або тритікале, що володіють підвищеною толерантністю до імідазолінонових гербіцидів. Даний винахід також включає насіння, отримане від рослин пшениці або тритікале, описаних у даній заявці, та способи для боротьби з бур'янами, що виростають поруч із рослинами пшениці або тритікале, описаними в даній заявці. Як використається в даній заявці, термін "рослина пшениці" відноситься до рослини, що є членом роду Triticum. Рослини пшениці згідно з даним винаходом можуть бути членами роду Triticum, включаючи, але не обмежуючись, Т. aestivum, Т. turgidum, Т. timopheevii, Т. monococcum, Т. zhukovskyi та Т. urartu, а також їх гібриди. Приклади підвидів Т. aestivum, включених у даний винахід, являють собою aestivum (пшениця звичайна), compactum (пшениці карликова), macha (пшениця імеретинська), vavilovi (пшениця Вавілова), spelta (пшениця спельта) та sphaerococcwn (пшениця круглозерна). Приклади підвидів Т. turgidum, які включені в даний винахід, являють собою turgidum, carthlicum, dicoccom, durum, paleocolchicum, polonicum, turanicum та dicoccoides. Приклади підвидів Т. monococcum, включених у даний винахід, являють собою monococcum (пшениця однозернянка) та aegilopoides. В одному втіленні згідно з 3 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 даним винаходом рослина пшениці являє собою члена видів Triticum aestivum L., та зокрема, культивар Shiloh. Термін "рослина пшениці" призначений для того, щоб охоплювати рослини пшениці на будьякій стадії зрілості та розвитку, а також будь-які тканини або органи (частини рослин), які одержані від або мають походження від яких-небудь таких рослин, якщо інше чітко не зазначено в контексті. Частини рослин без обмеження включають наступні: стебла, корінь, квіти, насінний зачаток, тичинки, листя, зародки, меристематичні ділянки, калусні тканини, культури пиляків, гаметофіти, спорофіти, пилок, мікроспори, протопласти тощо. Даний винахід також включає насіння, отримане від рослин пшениці згідно з даним винаходом. В іншому втіленні насіння являє собою таке, що є отриманим шляхом розведення гомозигот для збільшення толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з насінням рослини пшениці дикого типу. Даний винахід також охоплює рослини тритікале, частини рослин тритікале та клітини рослин тритікале, які мають підвищену толерантність до імідазолінонових гербіцидів. Як використається в даній заявці, термін "рослина тритікале" відноситься до рослини, отриманій шляхом схрещування рослини жита (Secale cereale) або з тетраплоїдною рослиною пшениці (наприклад, Triticum turgidum), або з гексаплоїдною рослиною пшениці (наприклад, Triticum aestivum). Даний винахід також включає насіння, отримане від рослин тритікале, описаних у даній заявці, та способи боротьби з бур'янами, що виростають поруч із рослинами тритікале, описаними в даній заявці. Даний винахід описує рослину пшениці, що включає, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту, де рослина пшениці має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. Є можливим для рослин пшениці згідно з даним винаходом мати множинні ІМІ нуклеїнові кислоти з різних геномів, оскільки ці рослини можуть містити більше одного геному. Наприклад, рослина пшениці Triticum aestivum містить три геноми, позначені як геноми А, В та D. Оскільки AHAS являє собою необхідний метаболічний фермент, передбачається, що кожний геном має, принаймні, ген, що кодує фермент AHAS (тобто, принаймні, один ген Als), що звичайно спостерігається з іншими метаболичними ферментами в гексаплоїдній рослині пшениці, що була картована. Як використовується в даній заявці, термін "локус гена Als" відноситься до положення гена Als у геномі, а термін "ген Als" та "Als нуклеїнова кислота" стосується нуклеїнової кислоти, що кодує фермент AHAS. Als нуклеїнова кислота в кожному геномі відрізняється своєю нуклеотидною послідовністю від Als нуклеїновою кислоти в іншому геномі. Фахівець у даній галузі може визначити геном, що має походження від кожної Als нуклеїнової кислоти за допомогою генетичного схрещування та/або способів секвенування, або способів на основі екзонуклеазного перетравлювання, відомих фахівцеві в даній галузі техніки. Як використовується в даній заявці, терміни "Als1 нуклеїнова кислота", "Als2 нуклеїнова кислота" та "Als3 нуклеїнова кислота" відносяться до Als нуклеїнових кислот, які розташовані в трьох різних геномах. Для цілей даного винаходу локус гена Als3 розташований у геномі А, локус гена Als2 розташований у геномі В, а локус гена Als1 розташований у геномі D. Також для цілей даного винаходу варто вказати, що ІМІ нуклеїнові кислоти, що мають походження від геномів А, В або D, є відмінними та позначаються, як Іmі3, Іmі2 або Іmі1 нуклеїнові кислоти, відповідно. Як використовується в даній заявці, термін "ІМІ нуклеїнова кислота" відноситься до Als нуклеїнової кислоти, що має послідовність, отриману шляхом мутації Als нуклеїнової кислоти дикого типу, та такої, що надає підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду рослині, у якому вона експресується. Як використовується в даній заявці, терміни "Imi1 нуклеїнова кислота" "Іmі2 нуклеїнова кислота" та "Іmі3 нуклеїнова кислота" являють собою ІМІ нуклеїнові кислоти, які відносяться до алелів імідазолінонової толерантності Als1, Als2 та Als3 генів, відповідно. Оскільки рослини пшениці містять дві копії кожного геному, то рослина пшениці містить дві копії кожної конкретної Als нуклеїнової кислоти. Наприклад, рослина пшениці Triticum aestivum включає дві копії кожного геному А, В та D і, таким чином, дві копії кожного гена Als3, Als2 та Als1. Як використовується в даній заявці, термін "ІМІ алель" відноситься до єдиної копії конкретної ІМІ нуклеїнової кислоти. Відповідно, для цілей даного винаходу рослина пшениці може містити два Imi1 алелі, один у кожній із двох копій генома D. В іншому втіленні рослина пшениці включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти. Як використовується в даній заявці, коли описується рослина, що включає "множинні ІМІ нуклеїнові кислоти" фраза "множинні ІМІ нуклеїнові кислоти" відноситься до присутності різних ІМІ нуклеїнових кислот у рослині, але не до того чи є рослина гомозиготною або гетерозиготною в окремому локусі Als. Наприклад, рослина, що включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, може 4 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 включати Imi1 та Іmі2 нуклеїнові кислоти, на противагу такій, яка має дві копії Imi1 нуклеїнової кислоти. Imi1 клас нуклеїнових кислот включає FS-4 ген, як описано Newhouse та ін. (1992 Plant Physiol. 100: 882-886) та Shiloh-8 ген, описаний більш докладно нижче. Кожний Imi клас може включати членів з різних видів пшениці. Таким чином, кожний Imi клас включає ІМІ нуклеїнові кислоти, які відрізняються за своєю нуклеотидною послідовністю, але які, проте, позначаються як такі, які мають походження від, або такі, які розташовані в тому самому геномі пшениці, при використанні дослідів по успадковуванню, як відомо середньому фахівцеві в даній галузі техніки. [0026] Відповідно, даний винахід включає рослину пшениці, що включає, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту, де рослина пшениці має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу та де, принаймні, одна ІМІ нуклеїнова кислота являє собою Imi1 нуклеїнову кислоту. У кращому втіленні Imi1 нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO:1. В іншому кращому втіленні рослина пшениці включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти. Даний винахід також охоплює толерантну до імідазолінону рослину тритікале. Як використовується в даній заявці, "рослина тритікале" відноситься до рослини, що отримана шляхом схрещування рослини жита (Secale cereale) або з тетраплоїдною рослиною пшениці (наприклад, Triticum turgidum), або з гексаплоїдною рослиною пшениці (наприклад, Triticum aestivum). Для цілей згідно з даним винаходом толерантна до імідазолінону рослина тритікале включає, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту, де рослина тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу та де, принаймні, одна ІМІ нуклеїнова кислота являє собою Imi1 нуклеїнову кислоту. У кращому втіленні Imi1 нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. В іншому кращому втіленні рослина тритікале включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти. Як використовується в даній заявці стосовно нуклеїнових кислот, термін "одержаний з" відноситься до нуклеїнової кислоти, "розташованої в" або "такої, що має походження від" частини геному. Термін "розташований в" відноситься до нуклеїнової кислоти, що міститься у в частині геному. Як такий, що також використовується в даній заявці у відношенні генома, термін "такий, що має походження від" відноситься до нуклеїнової кислоти, що була вилучена або ізольована з такого генома. Термін "ізольований" визначається більш докладно нижче. Даний винахід включає рослини пшениці, що містять один, два, три або більше алелів ІМІ, де рослини пшениці мають підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. ІМІ алелі можуть включати нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з полінуклеотиду, як визначено в послідовності SEQ ID NO:1; полінуклеотиду, що кодує поліпептид, як визначено в послідовності SEQ ID NO:2; полінуклеотиду, що містить, принаймні, 60 послідовних нуклеотидів кожного з вищезгаданих полінуклеотидів; та полінуклеотиду, комплементарного кожному з вищезгаданих полінуклеотидів. Даний винахід також включає рослини тритікале, що включають один, два, три або більше алелів ІМІ, де рослина тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. ІМІ алелі можуть включати полінуклеотидні послідовності, вибрані із групи, що складається з полінуклеотиду, як визначено в SEQ ID NO:1; полінуклеотиду, що кодує поліпептид, як визначено в SEQ ID NO:2; полінуклеотиду, що включає, принаймні, 60 послідовних нуклеотидів кожного зі згаданих вище полінуклеотидів; та полінуклеотиду, комплементарного кожному зі згаданих вище полінуклеотидів. В одному втіленні рослина пшениці або рослина тритікале включає дві різні ІМІ нуклеїнові кислоти. Переважно, коли, принаймні, одна із двох нуклеїнових кислот являє собою Imi1 нуклеїнову кислоту. Більш переважно, коли, принаймні, одна із двох ІМІ нуклеїнових кислот включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. В іншому втіленні рослина пшениці або рослина тритікале включає одну ІМІ нуклеїнову кислоту, де нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. Ще в одному втіленні рослина пшениці включає більше ніж дві ІМІ нуклеїнові кислоти, де кожна ІМІ нуклеїнова кислота походить із різного генома. Бажано, коли, принаймні, одна з ІМІ нуклеїнових кислот включає полінуклеотидну послідовність, що кодує поліпептидну послідовність SEQ ID NO:2, або полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. У кращому втіленні згідно з даним винаходом ізольована ІМІ нуклеїнова кислота кодує амінокислотну послідовність, що включає мутацію в домені, що є консервативним серед декількох білків AHAS. Ці домени позначаються в даній заявці як Домен А, Домен В, Домен С, Домен D та Домен Е. Фігура 3 показує загальне розташування кожного домена в білку AH AS. Домен А містить амінокислотну послідовність AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:7). Домен В містить 5 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислотну послідовність QWED (SEQ ID NO:8). Домен С містить амінокислотну послідовність VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:9). Домен D містить амінокислотну послідовність AFQETP (SEQ ID NO:10). Домен Ε містить амінокислотну послідовність IPSGG(SEQ ID NO:11). Даний винахід також допускає, що можуть існувати незначні варіації в консервативних доменах, наприклад, у рослинах дурнишника (страхополоху) залишок серину в Домені Ε замінений на залишок аланіну. Згідно з цим даний винахід включає рослину пшениці або рослину тритікале, що включає ІМІ нуклеїнову кислоту, яка кодує амінокислотну послідовність, що має мутацію в консервативному домені, вибраному із групи, що складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е. В одному втіленні рослина пшениці або рослина тритікале включає ІМІ нуклеїнову кислоту, що кодує амінокислотну послідовність, яка має мутацію в Домені Е. У подальших кращих втіленнях мутації в консервативних доменах виникають у місцях, позначених у наведені нижче послідовностях підкресленням: AITGQVPRRMIGT (SEQ ID NO:7); QWED (SEQ ID NO:8); VFAYPGGASMEIHQALTRS (SEQ ID NO:9); AFQETP (SEQ ID NO:10) та IPSGG (SEQ ID NO:11). Одна краща заміна являє собою заміну аланіну на треонін у Домені С Навіть більш кращою є заміна аланіну на треонін у положенні 96 ALS поліпептиду. Даний винахід забезпечує способи для підвищення толерантності або стійкості рослини, тканини рослини, рослинної клітини або іншої хазяйської клітини, принаймні, до одного гербіциду, що перешкоджає активності ферменту AHAS. Даний винахід також забезпечує рослини, клітини рослин, частини рослин, органи рослин, насіння та хазяйські клітини, що володіють толерантністю, принаймні, до одного гербіциду, зокрема до гербіциду, який інгібує AHAS. Бажано, коли такий гербіцид, що інгібує AHAS являє собою імідазоліноновий гербіцид, гербіцид на основі сульфонілсечовини, триазолпіримідиновий гербіцид, гербіцид на основі піримідинілоксибензоату, сульфоніламінокарбонілтриазоліноновий гербіцид або їх суміш. Більш бажано, коли такий гербіцид являє собою імідазоліноновий гербіцид або суміш двох або більше імідазолінонових гербіцидів. Для даного винаходу імідазолінонові гербіциди без обмеження включають наступні PURSUIT® (імазетапір), CADRE® (імазапік), RAPTOR® (імазамокс), SCEPTER® (імазаквін), ASSERT® (імазетабенз), ARSENAL® (імазапір), похідну кожного зі згаданих вище гербіцидів, наприклад, імазапір/імазамокс (ODYSSEY®). Зокрема, імідазоліноновий гербіцид може бути без обмеження вибраний з наступних: 2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинова кислота, [2-(4-ізопротл)-4-][метил-5-оксо-2-імідазолін2-іл)-3-хінолінкарбонова]кислота, [5-етил-2-(4-ізопропіл]-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2іл)нікотинова кислота, 2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5(метоксиметил)нікотинова кислота, [2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-]-імідазолін-2-іл)-5метилнікотинова кислота та суміш метил [6-(4-ізопропіл-4-]-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-мтолуату та метил [2-(4-ізопропіл-4-метил-5-]-оксо-2-імідазолін-2-іл)-п-толуату. Застосування 5етил-2-(4-ізопропіл-4-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)нікотинової кислоти та [2-(4-ізопропіл-4метил-5-оксо-2-імідазолін-2]-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти є бажаним. Застосування [2-(4-ізопропіл-4]-метил-5-оксо-2-імідазолін-2-іл)-5-(метоксиметил)нікотинової кислоти є особливо бажаним. Для цілей даного винаходу сульфонілсечовинні гербіциди без обмеження включають наступні: хлорсульфурон, метсульфурон метил, сульфометурон метил, хлоримурон етил, тіфенсульфурон метил, трибенурон метил, бенсульфурон метил, нікосульфурон, етаметсульфурон метил, римсульфурон, трифлусульфурон метил, триасульфурон, примісульфурон метил, циносульфурон, амідосульфурон, флузасульфурон, імазосульфурон, піразосульфурон, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флуірсульфурон метил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, похідну кожного зі згаданих вище гербіцидів, суміш двох або більше згаданих вище гербіцидів. Триазолпіримідинові гербіциди згідно з даним винаходом без обмеження включають наступні: хлорамсулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам та пеноксулам. Гербіциди на основі піримідинілоксибензоату відповідно до винаходу без обмеження включають наступні: біспірибак, піритіобак, піримінобак, пірибензоксим та пірифталід. Сульфоніламінокарбонілтриазолінові гербіциди без обмеження включають наступні: флукарбазон та пропоксикарбазон. Визнається, що гербіциди на основі піримідинілоксибензоату є досить близькими з гербіцидами на основі піримідинілтіобензоату, вони узагальнені під назвою останніх Американським Суспільством по боротьбі з бур'янами. Таким чином, гербіциди згідно з даним винаходом також включають гербіциди на основі піримідинілтіобензоату, включаючи без обмеження піримідинілоксибензоатні гербіциди, описані вище. 6 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Рослини пшениці, описані в даній заявці, можуть бути або трансгенними рослинами пшениці, або нетрансгенними рослинами пшениці. Подібно до цього рослини тритікале, описані в даній заявці, можуть бути або трансгенними рослинами тритікале, або нетрансгенними рослинами тритікале. Як використовується в даній заявці, термін "трансгенний" відноситься до будь-якої рослини, рослинної клітини, калусу, тканини рослин або частини рослин, які містять весь або, принаймні, частину одного рекомбінантного полінуклеотиду. У багатьох випадках весь рекомбінантний полінуклеотид або його частина є стабільно інтегрованим у хромосому або стабільний екстрахромосомний елемент, так, що він переходить до наступних поколінь. Для цілей даного винаходу термін "рекомбінантний полінуклеотид" відноситься до полінуклеотиду, що є зміненим, перебудованим або модифікованим за допомогою генетичної інженерії. Приклади включають будь-який клонований полінуклеотид або полінуклеотиди, які зв'язані або з'єднані з гетерологічними послідовностями. Термін "рекомбінант" не відноситься до змін полінуклеотидів , які відбуваються внаслідок природних подій, таких, як спонтанні мутації, або внаслідок спонтанного мутагенезу, що супроводжується селективним розмноженням. Рослини, що мають мутації, які виникли завдяки неспонтанному мутагенезу та селективному розведенню, позначаються в даній заявці як нетрансгенні рослини або включені в об'єм даного винаходу. У втіленнях, в яких рослина пшениці або рослина тритікале є трансгенною та включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, нуклеїнові кислоти можуть мати походження від різних геномів або від того самого генома. Альтернативно, у втіленнях, в яких рослина пшениці або рослина тритікале не є трансгенною та включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти, нуклеїнові кислоти є розташованими в різних геномах або в тому самому геномі. Приклад культивару нетрансгенної рослини пшениці, що включає одну ІМІ нуклеїнову кислоту, являє собою рослинний культивар, задепонований під номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС РТА-5625АТСС та позначений у даній заявці як лінія Shiloh-8. Лінія Shiloh-8 містить Imi1 нуклеїнову кислоту. Нуклеотидна послідовність неповної довжини, що відповідає гену Shiloh-8, представлена в SEQ ID NO:1. Депонування 2500 насінин лінії Shiloh-8 (позначені як і4417-8) було здійснено в Американській колекції типових культур, Манассас, Вірджинія, 30 жовтня, 2003. Це депонування було проведено у відповідності зі строками та умовами Будапештського Договору, що стосується депонування мікроорганізмів. Депонування було здійснено на строк, принаймні, тридцять років і, принаймні, п'ять років після одержання АТСС самого останнього запиту на надання депонованого зразка. Депонованому насінню був наданий номер депонування для цілей патентної процедури РТА-5625. Даний винахід включає рослини пшениці, що мають номер депонування для цілей патентної процедури РТА-5625; мутант, рекомбінант або генетично отриману похідну рослини з номером депонування для цілей патентної процедури РТА-5625; будь-яке потомство рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС РТА-5625; та рослина, що є нащадком будь-якої з цих рослин. У кращому втіленні рослина пшениці згідно з даним винаходом додатково має характеристики гербіцидної толерантності рослини з номером депонування для цілей патентної процедури РТА-5625. Даний винахід також включає гібриди рослин пшениці Shiloh-8, описаних у даній заявці, та гібриди Shiloh-8 з іншими рослинами пшениці. Інші рослини пшениці включають без обмеження наступні: Τ aestivum L. cv Fidel та будь-яку рослину пшениці, що несе мутантні гени FS-1, FS-2, FS-3 або FS-4. (Дивися патент США № 6,339,184 та заявку на патент США № 08/474,832). Терміни "культивар" та "сорт" відносяться до групи рослин у межах видів, що характеризується тим, що має загальний набір характеристик або характерних рис, прийнятих фахівцем у даній галузі техніки як достатні для розрізнення одного культивару або сорту від іншого культивару або сорту. При цьому не мається на увазі ні те, що всі рослини якогось даного культивару або сорту будуть генетично ідентичними або в цільному гені, або на молекулярному рівні, ні те, що якась дана рослина буде гомозиготною у всіх локусах. Культивар або сорт вважається таким, який отриманий розведенням гомозигот стосовно конкретної характеристики, якщо при самозапиленні отриманого при такому розведенні гомозигот культивару або сорту все потомство має цю характеристику. Терміни "селекційна лінія" або "лінія" відносяться до групи рослин у межах культивару, що характеризується тим, що має загальний набір характеристик або характерних рис, прийнятих фахівцем у даній галузі техніки як достатні для розрізнення однієї селекційної лінії або лінії від іншої селекційної лінії або лінії. При цьому не мається на увазі ні те, що всі рослини якоїсь даної селекційної лінії або лінії будуть генетично ідентичними або в цільному гені, або на молекулярному рівні, ні те, що якась дана рослина буде гомозиготною в усіх локусах. Селекційна лінія або лінія вважається такою, що отримана розведенням гомозигот стосовно конкретної характеристики, якщо при 7 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 самозапиленні отриманої при такому розведенні гомозигот селекційної лінії або лінії все потомство має цю характеристику. У даному винаході характерна риса виникає внаслідок мутації в гені Als рослини пшениці або тритікале або насіння. Крім того, застосування термінів "культивар" та "сорт" у даній заявці не призначене для обмеження рослин згідно з даним винаходом одним або більше сортами рослин. Незважаючи на те, що даний винахід охоплює сорти рослин, рослини згідно з даним винаходом включають будь-які рослини, які мають характеристики толерантності до гербіцидів рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС 5625 та/або мають одну або більше ІМІ нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом. При цьому зрозуміло, що рослина пшениці або рослина тритікале згідно з даним винаходом може включати Als нуклеїнову кислоту дикого типу на доповнення до ІМІ нуклеїнової кислоти. Як описано в Прикладі 1, передбачається, що лінія Shiloh-8 містить мутацію тільки в одному з безлічі ізоферментів AHAS. Таким чином, даний винахід включає рослину пшениці або рослину тритікале, що містить, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту у доповнення до однієї або більше Als нуклїнових кислот дикого типу. У доповнення до рослин пшениці та тритікале даний винахід охоплює ІМІ білки та нуклеїнові кислоти. Нуклеїнові кислоти включають полінуклеотид, вибраний із групи, що складається з полінуклеотиду, як визначено в SEQ ID NO:1; полінуклеотиду, що кодує поліпептид, як визначено в SEQ ID NO:2; полінуклеотиду, що включає, принаймні, 60 послідовних нуклеотидів кожного зі згаданих вище полінуклеотидів; та полінуклеотиду, комплементарного кожному зі згаданих вище полінуклеотидів . У кращому втіленні ІМІ нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1. Терміни "AHAS білок", "AHAS поліпептид", "ALS білок" та "ALS поліпептид" відносяться до білка ацетогідроксикислотасинтази, а терміни "ІМІ білок" або "ІМІ поліпептид" відносяться до будь-якого AHAS білка, що є отриманим шляхом мутації білка AHAS дикого типу та який надає підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду рослині, рослинній клітині, частині рослини, насінню рослини або рослинної тканини, коли експресується в них. У кращому втіленні ІМІ білок включає поліпептид, який кодується полінуклеотидною послідовністю, що включає SEQ ID NO: 1. Такі ІМІ білки включають толерантну до гербіциду активність AHAS, зокрема, толерантну до імідазолінону активність AHAS. Така гербіцид-толерантна активність AHAS може бути оцінена шляхом аналізів активності AHAS. Дивися, наприклад, Singh та ін. (1988) Anal. Biochem. 171:173-179, що введена в дану заявку як посилання. В іншому кращому втіленні ІМІ білок включає поліпептид, що містить SEQ ID NO:2. Як також використовується в даній заявці, терміни "нуклеїнова кислота" та "полінуклеотид" відносяться до РНК або ДНК, які є лінійними або розгалуженими, одноланцюговими або дволанцюговими, або до їх гібридів. Термін також охоплює гібриди РНК/ДНК. Ці терміни також охоплюють нетрансльовану послідовність, розташовану як на 3' кінці, так і на 5' кінці кодуючої ділянки гена: принаймні, приблизно 1000 нуклеотидів послідовності вище 5' кінця кодуючої ділянки і, принаймні, 200 нуклеотидів послідовності нижче 3' кінця кодуючої гена. Менш традиційні основи, такі, як інозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенін, гіпоксантин та інші, також можуть використовуватися для антисмислової дцРНК та рибозимного спарювання. Наприклад, полінуклеотиди, які містять С-5 пропінові аналоги уридину та цитидину, були продемонстровані як такі, що зв'язують РНК із високим ступенем афінності та являють собою ефективні антисмисловіі інгібітори генної експресії. Також можуть бути здійснені інші модифікації, такі, як модифікація фосфодіефірного скелету або 2'-гідрокси в групі цукру рибози РНК. Антисмисловіі полінуклеотиди та рибозими можуть повністю складатися з рибонуклеотидів або можуть містити змішані рибонуклеотиди та дезоксирибонуклеотид. Полінуклеотиди відповідно до винаходу можуть бути отримані за допомогою будь-яких способів, включаючи геномні препарати, препарати кДНК, синтез in vitro, ПЛР у реальному часі та транскрипцію in vitro або in vivo. "Ізольована" молекула нуклеїнової кислоти являє собою таку, що істотно відокремлена від молекул нуклеїнової кислоти, які присутні в природному джерелі нуклеїнової кислоти (тобто послідовностей, що кодують інші поліпептиди). Бажано, коли "ізольована" нуклеїнова кислота є вільною від послідовностей, які звичайно фланкують нуклеїнову кислоту (тобто, послідовностей, розташованих на 5' та 3' кінцях нуклеїнової кислоти) у її існуючому в природі репліконі. Наприклад, клонована нуклеїнова кислота вважається ізольованою. У різних втіленнях ізольована молекула ІМІ нуклеїнової кислоти може містити менше ніж приблизно 5 кб, 4 кб, 3 кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб або 0,1 кб нуклеотидних послідовностей, які в природі фланкують молекулу нуклеїнової кислоти в геномній ДНК клітини, з якої отримана ця нуклеїнова кислота (наприклад, клітини Triticum aestivum). Нуклеїнова кислота також вважається ізольованою, якщо вона була змінена шляхом втручання людини або розміщена в локусі або таке у такому розташувані, що 8 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 не є її природним сайтом, або якщо вона була введена в клітину шляхом методу агроінфекції, біолістики або з використанням будь-якого іншого способу трансформації рослин. Крім того, "ізольована" молекула нуклеїнової кислоти, така, як молекула ДНК, може бути вільною від деякого іншого клітинного матеріалу, з яким вона асоційована в природі, або культурального середовища, коли її одержують за допомогою рекомбінантних способів, або хімічних попередників або інших хімічних агентів, що використовуються при хімічному синтезі. 3 визначення "ізольованих нуклеїнових кислот", зокрема, виключаються: існуючі в природі хромосоми (такі, як препарати хромосом), штучні хромосомні бібліотеки, геномні бібліотеки та бібліотеки кДНК, які існують або як in vitro препарат нуклеїнової кислоти або як препарат трансфікованої/трансформованої хазяйської клітини, де хазяйські клітини являють собою або in vitro гетерогенний препарат, або такі, що висаджені як гетерогенна популяція одиничних колоній. Зокрема, також виключаються згадані вище бібліотеки, в яких зазначена нуклеїнова кислота становить менш ніж 5% числа вставок нуклеїнової кислоти у векторних молекулах. Зокрема, також виключається геномна ДНК цільних клітин або препарати РНК цільних клітин (включаючи препарати цільної клітини, які є механічно зруйнованими або такими, що піддані ферментативному перетравлюванню). Також специфічно виключаються препарати цільних клітин, виявлені або як in vitro препарат, або як гетерогенна суміш, розділена за допомогою електрофорезу, де нуклеїнова кислота згідно з винаходом не була надалі відокремлена від гетерологічних нуклеїнових кислот в електрофоретичному середовищі (наприклад, подальше розділення за допомогою вирізання однієї смуги з популяції гетерогенних смуг в агарозному гелі або у нейлоновому блоті). Молекула нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, наприклад, молекула нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1 або її частина, може бути ізольована при використанні стандартних методик молекулярної біології та інформації про послідовності, які наведені в даній заявці. Наприклад, ІМІ кДНК Т. aestivum може бути ізольована з бібліотеки Т. aestivum при використанні всієї або частини послідовності SEQ ID NO:1. Крім того, молекула нуклеїнової кислоти, що охоплює всю або частину послідовності SEQ ID NO:1, може бути ізольована шляхом полімеразної ланцюгової реакції при використанні олігонуклеотидних праймерів, сконструйованих на основі цієї послідовності. Наприклад, мРНК може бути ізольована з рослинних клітин (наприклад, за допомогою процедури гуанідинійтіоцианатної екстракції, описаної Chirgwin тa ін., 1979, Biochemistry 18:5294-5299), а кДНК може бути отримана при використанні зворотної транскриптази (наприклад, Moloney MLV зворотної транскриптази, доступної від Gibco/BRL, Bethesda, MD; або AMV зворотної транскриптази, доступної від Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Синтетичні олігонуклеотидні праймери для полімеразної ланцюгової реакції ампліфікації можуть бути сконструйовані на основі нуклеотидної послідовності, представленої в SEQ ID NO:1. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може бути ампліфікована при використанні кДНК або альтернативно, геномної ДНК, як матриця та прийнятних олігонуклеотидних праймерів у відповідності зі стандартною методикою ПЛР ампліфікації. Молекула нуклеїнової кислоти, ампліфікована таким чином, може бути клонована в прийнятний вектор та охарактеризована за допомогою аналізу послідовності ДНК. Крім того, олігонуклеотиди, що відповідають нуклеотидній послідовності ІМІ можуть бути отримані за допомогою стандартних методик синтезу, наприклад, при використанні автоматичного синтезатора ДНК. ІМІ нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом можуть включати послідовності, що кодують ІМІ білок (тобто, "кодуючі ділянки"), а також 5' нетрансльовані послідовності та 3' нетрансльовані послідовності. Альтернативно, молекули нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом можуть включати тільки кодуючі ділянкиІМІ гена або можуть містити цільні геномні фрагменти, ізольовані з геномної ДНК. Кодуюча ділянка цих послідовностей позначається як "ORP положення". Крім того, молекула нуклеїнової кислоти згідно з винаходом може включати частину кодуючої ділянки ІМІ гена, наприклад, фрагмент, що може використовуватися як зонд або праймер. Нуклеотидні послідовності, визначені в результаті клонування ІМІ генів з Т. aestivum, дозволяють здійснювати одержання зондів та праймерів, призначених для використання при ідентифікації та/або клонуванні гомологів ІМІ в інших типах клітин та організмів, вони також можуть використовуватися як ІМІ гомологи з інших рослин пшениці та родинних видів. Частина кодуючої ділянки може також кодувати біологічно активний фрагмент ІМІ білка. Як використовується в даній заявці, термін "біологічно активна частина" ІМІ білка призначений для включення частини, наприклад, домена/елемента ІМІ білка, що при продукуванні в рослині підвищує толерантність рослини до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. Способи для кількісної оцінки підвищеної толерантності до 9 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імідазолінонових гербіцидів забезпечуються в прикладах, наведених нижче. Біологічно активні частини ІМІ білка включають пептиди, що мають походження від SEQ ID NO:2, що включає менше амінокислот, ніж ІМІ білок повної довжини та надає підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду при експресії в рослині. Типово, біологічно активні частини (наприклад, пептиди, які містять наприклад, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 або більше амінокислот у довжину) включають домен або елемент, принаймні, з однією активністю ІМІ білка. Крім того, інші біологічно активні частини, в яких інші ділянки поліпептиду є делетованими, можуть бути отримані за допомогою рекомбінантних методик та оцінені на одну або більше активностей, описаних у даній заявці. Бажано, коли біологічно активні частини ІМІ білка включають один або більше консервативних доменів, вибраних з групи, що складається з Домену А, Домену В, Домену С, Домену D та Домену Е, де консервативний домен містить мутацію. Винахід також забезпечує химерні або злиті ІМІ поліпептиди. Як використовується в даній заявці, ІМІ "химерний поліпептид" або "злитий поліпептид" включає ІМІ поліпептид, оперативно зв'язаний з не-ІМІ поліпептидом. "Не-ІМІ поліпептид" відноситься до поліпептиду, що має амінокислотну послідовність, що не є істотно ідентичною такій ІМІ поліпептиду, наприклад, поліпептид, що не є ІМІ ізоферментом, при цьому пептид виконує функцію, відмінну від такої ІМІ поліпептиду. Як використовується в даній заявці відносно злитого поліпептиду, термін "оперативно зв'язаний" призначений для вказівки, що ІМІ поліпептид та не-ІМІ поліпептид є злитими один з одним так, що обидві послідовності доповнюють запропоновану функцію, властиву використовуваній послідовності. Не-ІМІ поліпептид може бути злитий з Nтермінальним кінцем або С-термінальним кінцем ІМІ поліпептиду. Наприклад, в одному втіленні злитий поліпептид являє собою GST-IMI злитий поліпептид, у якому ІМІ послідовність є злитою з С-термінальним кінцем послідовності GST. Такі злиті поліпептиди можуть поліпшувати очищення рекомбінантних ІМІ поліпептидів. В іншому втіленні злитий поліпептид являє собою ІМІ поліпептид, що містить гетерологічну сигнальну послідовність на своєму N-термінальному кінці. У деяких хазяйських клітинах (наприклад, у хазяйських клітинах ссавців), експресія та/або секреція ІМІ поліпептиду може бути підвищена за допомогою використання гетерологічної сигнальної послідовності. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти, що кодує ІМІ поліпептид, який має певний відсоток ідентичності послідовності з поліпептидом послідовності SEQ ID NO:2, може бути отримана шляхом введення однієї або більше нуклеотидних замін, доповнень або делецій у нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:1, так що одна або більше амінокислотних замін, доповнень або делецій вводяться у поліпептид,що кодується. Мутації можуть бути введені в послідовність SEQ ID NO:1 за допомогою стандартних методик, таких як сайт-направлений мутагенез та ПЛР-опосредкований мутагенез. Бажано, коли консервативні амінокислотні заміни здійснюються в одному або більше передбачених несуттєвих амінокислотних залишків. "Консервативна амінокислотна заміна" являє собою таку, в якій амінокислотний залишок замінюється амінокислотним залишком, що має подібний амінокислотний ланцюг. Сімейства амінокислотних залишків, які мають подібний амінокислотний ланцюг, є відомі у рівні техніки. Ці сімейства включають амінокислоти з основними бічними ланцюгами (наприклад, лізин, аргінін), з кислотними бічними ланцюгами (наприклад, аспарагінова кислота, глутамінова кислота), з незарядженими бічними ланцюгами (наприклад, гліцин, аспарагін, глутамін, серин, треонін, тирозин, цистеїн), з неполярними бічними ланцюгами (наприклад, аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан), з бета-розгалуженими бічними ланцюгами (наприклад, треонін, валін, ізолейцин) та ароматичними бічними ланцюгами (наприклад, тирозин, фенілаланін, триптофан, гістидин). Таким чином, розрахований заздалегідь несуттєвий амінокислотний залишок ІМІ поліпептиду переважно замінюють іншим амінокислотним залишком з того ж самого сімейства бічних ланцюгів. Альтернативно, в іншому втіленні мутації можуть бути введені випадково уздовж всієї або частини кодуючої послідовності ІМІ, наприклад, шляхом насичувального мутагенезу, та отримані мутанти можуть бути піддані скринінгу на ІМІ активність, описану в даній заявці для ідентифікації мутантів, які зберігають ІМІ активність. Після мутагенезу послідовності SEQ ID NO:1 поліпептид, який кодується може бути експресований рекомбінантно, та активність поліпептиду може бути визначена шляхом аналізу толерантності до імідазолінону рослин, що експресують поліпептид, так, як описано в прикладах, наведених нижче. Для визначення відсотка ідентичності послідовності двох амінокислотних послідовностей ці послідовності піддають порівнянню з метою оптимального порівняння (наприклад, пробіли можуть бути введені у послідовність одного поліпептиду для оптимального порівняння з іншим поліпептидом). Амінокислотні залишки у відповідних положеннях амінокислот потім порівнюють. 10 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Коли положення в одній послідовності займає той самий амінокислотний залишок, що й у відповідному положенні в іншій послідовності, то молекули є ідентичними в цьому положенні. Такий же тип порівняння може бути проведений між двома послідовностями нуклеїнових кислот. Відсоток ідентичності послідовності між двома послідовностями являє собою функцію кількості ідентичних положень, що поділяються послідовностями (тобто, відсоток ідентичності послідовності = кількість ідентичних положень/загальна кількість положень × 100). Для цілей даного винаходу відсоток ідентичності послідовності між двома амінокислотними або поліпептидними послідовностями визначається при використанні програмного забезпечення Vector NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Штрафна санкція відносно розкриття пробілу 15 та штрафна санкція подовження пробілу 6,66 використовуються для визначення відсотка ідентичності двох нуклеїнових кислот. Штрафна санкція відносно розкриття пробілу 10 та штрафна санкція подовження пробілу 0,1 використовується для визначення відсотка ідентичності двох поліпептидів. Всі інші параметри встановлюються по умовчанню. При цьому зрозуміло, що для цілей визначення ідентичності послідовностей, коли ДНК послідовність порівнюється з РНК послідовністю, тимідиновий нуклеотид є еквівалентним урациловому нуклеотиду. Бажано, коли ізольовані ІМІ нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом є, принаймні, приблизно на 50-60%, переважно, принаймні, приблизно на 60-70% та більш переважно, принаймні, приблизно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, або 90-95% та найбільш переважно, принаймні, приблизно на 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичними цільноій полінуклеотидній послідовності, представленій в SEQ ID NO:1. В іншому втіленні ізольовані ІМІ нуклеїнові кислоти, включені в даний винахід, є, принаймні, приблизно на 50-60%, переважно, принаймні, приблизно на 60-70% та більш переважно, принаймні, приблизно на 7075%, 75-80%, 80-85%, 85-90% або 90-95% та найбільше переважно, принаймні, приблизно на 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичними цільній полінуклеотидній послідовності, представленій в SEQ ID NO:1. Бажано, коли ізольовані ІМІ поліпептиди згідно з даним винаходом є, принаймні, приблизно на 50-60%, переважно, принаймні, приблизно на 60-70% та більш переважно, принаймні, приблизно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% або 90-95% та найбільше переважно, принаймні, приблизно на 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичними цільній амінокислотній послідовності, показаній в SEQ ID NO:2. В іншому втіленні ізольовані ІМІ поліпептиди, включені в даний винахід, є, принаймні, приблизно на 50-60%, переважно, принаймні, приблизно на 6070% та більш переважно, принаймні, приблизно на 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% або 9095% та найбільш переважно, принаймні, приблизно на 96%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичними цільній амінокислотній послідовності, представленій в SEQ ID NO:2. Додатково можуть бути отримані оптимізовані ІМІ нуклеїнові кислоти. Бажано, коли оптимізована ІМІ нуклеїнова кислота кодує ІМІ поліпептид, що модулює рослинну толерантність до імідазолінонових гербіцидів та більш переважно підвищує толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду при понадекспресії в рослині. Як використовується в даній заявці, термін "оптимізований" відноситься до нуклеїнової кислоти, що є отриманою за допомогою методів генетичної інженерії, підвищує її експресію в даній рослині або тварині. Для забезпечення оптимізованих для рослин ІМІ нуклеїнових кислот послідовність ДНК гена може бути модифікована для 1) включення кодонів, кращих для рослинних генів, що експресуються на високому рівні; 2) для зміни вмісту А+Т у складі нуклеотидних основ до рівня, що в основному виявлений у рослин; 3) для формування рослинних послідовностей ініціації, 4) для усунення послідовностей, які викликають дестабілізацію, неприйнятне поліаденілування, деградацію та термінацію РНК або які утворюють вторинну структуру шпильок або сайтів сплайсингу РНК. Підвищена експресія ІМІ нуклеїнових кислот у рослинах може бути досягнута шляхом використання кривої розподілу використовуваності кодона в рослинах взагалі або в конкретній рослині. Способи оптимізації експресії нуклеїнової кислоти в рослинах можуть бути знайдені в ЕРА 0359472; ЕРА 0385962; заявці РСТ WO 91/16432; патенті США № 5,380,831; патенті США № 5,436,391; Perlack та ін., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; та Murray та ін., 1989, Nucleic Acids Res. 17: 477-498. Як використовується в даній заявці, "частота використовуваності кращого кодона" відноситься до переваги, що демонструється специфічною хазяйською клітиною у відношенні використовуваності нуклеотидних кодонів для визначення даної амінокислоти. Для визначення частоти використовуваності певного кодона в гені частоту зустрічальності цього кодона в гені ділять на загальну кількість зустрічальності всіх кодонів, що визначають ту ж саму амінокислоту в гені. Подібно до цього частота використовуваності кращого кодона, що демонструється хазяйською клітиною, може бути підрахована шляхом усереднення частоти використовуваності 11 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кращого кодона у великій кількості генів, що експресуються хазяйською клітиною. Відсоток відхилення частоти використовуваності кращого кодона для синтетичного гена від такої, що є характерною для хазяйської клітини, підраховується шляхом визначення відсотка відхилення частоти використовуваності, одного кодона від такої, що є характерної для хазяйської клітини, після чого одержують середнє значення відхилення для всіх кодонів. Як визначено в даній заявці, такий підрахунок включає унікальні кодони (тобто, ATG та TGG). Загалом, сумарне середнє відхилення використовуваності кодона оптимізованого гена від такого для хазяйської клітини підраховують при використанні рівняння 1А = n = 1ΖX n - ΥnXn разів 100 Ζ, де Xn = частота використовуваності кодона в хазяйській клітині; Υn = частота використовуваності кодона в хазяйському гені, n являє собою індивідуальний кодон, що визначає амінокислоту, а загальна кількість кодів представляє собою Ζ. Сумарне відхилення частоти використовуваності кодона, А, для всіх амінокислот переважно повинне становити менше приблизно 25%, та більш переважно менш ніж приблизно 10%. Таким чином, ІМІ нуклеїнова кислота може бути оптимізована так, що її крива розподілу використовуваності кодона відхиляється переважно не більше ніж на 25% від такої для рослинних генів, що експресуються на високому рівні, та більш переважно не більш ніж приблизно на 10%. У доповнення наведено розгляд для процентного вмісту G+C виродженої третьої основи (однодольні рослини, як з'ясувалося, віддають перевагу G+C у цьому положенні, у той час як дводольні - ні). Визнається також, що XCG (де X являє собою А, Т, С або G) нуклеотид є найгіршим кодоном у дводольних рослин, у той час, як і однодольні, так і дводольні рослини уникають ХТА кодона. Оптимізовані ІМІ нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом також переважно мають індекси уникнення CG та ТА дублетів, що наближає такі до вибраної хазяйської рослини (тобто, Triticum aestivum). Більш переважно ці індекси відхиляються від таких для хазяйського організму не більше ніж приблизно на 10-15%. У доповнення до молекул нуклеїнової кислоти, які кодують ІМІ поліпептиди, описані вище, інший аспект даного винаходу відноситься до ізольованих молекул нуклеїнової кислоти, які є антисмисловими. Антисмислові полінуклеотиди, як передбачається, інгібують генну експресію цільового полінуклеотиду шляхом специфічного зв'язування із цільовим полінуклеотидом та перешкоджання транскрипції, сплайсингу, транспорту, трансляції та/або стабільності цільового полінуклеотиду. У рівні техніки описані способи для націлювання антисмислового полінуклеотиду на хромосомну ДНК, на первинний РНК транскрипт або процесовану мРНК. Переважно, цільові ділянки включають сайти сплайсингу, кодони ініціації трансляції, кодони термінації трансляції та інші послідовності у відкритій рамці зчитування. Термін "антисмисловий" для цілей даного винаходу відноситься до нуклеїнової кислоти, що включає полінуклеотид, який є в достатній мірі комплементарним усьому гену або частині гена, первинному транскрипту або процесованій мРНК, так, що перешкоджає експресії ендогенного гена. "Комплементарні" полінуклеотиди являють собою ті, що є здатними до спарювання основ у відповідності зі стандартним правилом Уотсона-Крика. Зокрема, пурини будуть спарюватися з піримідинами з утворенням комбінації гуаніну, який спарюєтьсяо із цитозином (G:C), та аденіну, який спарюється або з тиміном (А:Т) у випадку ДНК, або аденіну, який спарюється з урацилом (A:U) у випадку РНК. При цьому зрозуміло, що два полінуклеотиди можуть гібридизуватися один з одним, навіть якщо вони не є повністю комплементарними один одному. Термін "антисмислова нуклеїнова кислота" включає експресійні касети як одноланцюгової РНК, так і дволанцюгової ДНК, які можуть транскрибуватися з утворенням антисмислової РНК. "Активні" антисмислові нуклеїнові кислоти являють собою РНК молекули, які здатні селективно гібридизуватися з первинним транскриптом або з мРНК, що кодує поліпептид, який має, принаймні, 80%-ну ідентичність послідовності з поліпептидною послідовністю SEQ ID NO:2. На доповнення до ІМІ нуклеїнових кислот та поліпептидів, описаних вище, даний винахід охоплює нуклеїнові кислоти та поліпептиди, приєднані до залишку. Такі залишки без обмеження включають залишки, призначені для визначення, залишки для гібридизації, залишки для очищення, залишки для доставки, реакційні залишки, зв'язувальні залишки тощо. Типова група нуклеїнових кислот, що володіють приєднаними залишками, представляє собою зонди та праймери. Зонди та праймери типово включають ділянку нуклеотидної послідовності, що гібридизується у жорстких умовах, принаймні, з приблизної, переважно приблизно з 25, більш переважно приблизно з 40, 50 або 75 послідовними нуклеотидами смислового ланцюга послідовності, як представлено в SEQ ID NO:1, антисмислової послідовності до послідовності, як представлено в SEQ ID NO:1, або їх існуючими в природі мутантами. Праймери на основі нуклеотидної послідовності SEQ ID NO:1 можуть використовуватися в реакціях ПЛР для клонування ІМІ гомологів. Зонди на основі ІМІ нуклеотидних послідовностей можуть використовуватися для визначення транскриптів або геномних послідовностей, що кодують ті ж 12 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 самі або гомологичні поліпептиди. У кращих втіленнях зонд додатково включає групу мітки, приєднану до нього, наприклад, група мітки може являти собою радіоізотоп, флуоресцентну сполуку, фермент або фермент-кофактор. Такі зонди можуть використовуватися як частина набору геномного маркерного тесту для ідентифікації клітин, які експресують ІМІ поліпептид, такого як шляхом вимірювання рівня нуклеїнової кислоти, що кодує ІМІ у зразку клітин, наприклад, за допомогою визначення рівнів мРНК ІМІ або визначення того факту, що геномний ІМІ ген був мутований або делетований. Винахід також забезпечує ізольований рекомбінантний експресійний вектор, що включає ІМІ нуклеїнову кислоту, як описано вище, де експресія вектора в хазяйській клітині приводить до підвищеної толерантності до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з хазяйською клітиною дикого типу. Як використовується в даній заявці, термін "вектор" відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, здатної до транспорту іншої нуклеїнової кислоти, з якої вона зв'язана. Один тип вектора являє собою "плазміду", цей термін відноситься до кільцевої дволанцюгової ДНК петлі, у яку можуть бути ліговані додаткові сегменти ДНК. Інший тип вектора являє собою вірусний вектор, де додаткові сегменти ДНК можуть бути ліговані у вірусний геном. Деякі вектори є здатними до автономної реплікації в хазяйській клітині, у яку вони можуть бути введені (наприклад, бактеріальні вектори, які мають бактеріальне джерело реплікації, та епісомальні вектори ссавців). Інші вектори (наприклад, неепісомальні вектори ссавців) є інтегрованими в геном хазяйської клітини в результаті інтродукції в хазяйську клітину та, таким чином, реплікуються разом з хазяйським геномом. Крім того, деякі вектори є здатними направляти експресію генів, з якими вони оперативно зв'язані. Такі вектори називаються в даній заявці "експресійними векторами". У загальному випадку, експресійні вектори, які використаються в методиках рекомбінантної ДНК, часто перебувають у формі плазмід. В даному описі терміни "плазміда" та "вектор" можуть використовуватися почергово, оскільки плазміда являє собою найбільш часто використовувану форму вектора. Проте, винахід призначений для включення таких інших форм експресійних векторів, таких, як вірусні вектори (наприклад, дефектні по реплікації ретровіруси, аденовіруси та аденоасоційовані віруси), які виконують еквівалентні функції. Рекомбінантні експресійні вектори згідно з винаходом включають нуклеїнову кислоту згідно з винаходом у формі, прийнятній для експресії нуклеїнової кислоти в хазяйській клітині, що означає, що рекомбінантні експресійні вектори включають одну або більше регуляторних послідовностей, вибраних на основі хазяйських клітин, використовуваних для експресії, які є оперативно зв'язаними з послідовністю нуклеїнової кислоти, що експресується. У відношенні рекомбінантного експресійного вектора термін "оперативно зв'язаний" призначений для позначення того факту, що нуклеотидна послідовність, яка представляє інтерес, є зв'язаною з регуляторною(ними) послідовністю(послідовностями) таким чином, що дозволяє здійснювати експресію нуклеотидної послідовності (наприклад, в in vitro транскрипційній/ трансляційній системі або в хазяйській клітині тоді, коли вектор вводиться в хазяйську клітину). Термін "регуляторна послідовність "призначений для включення промоторів, енхансерів та інших елементів контролю експресії (наприклад, сигналів поліаденілування). Такі регуляторні послідовності описуються, наприклад, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) та Gruber та Crosby, в: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, ред. Glick та Thompson, Розділ 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, включаючи посилання, наведені там. Регуляторні послідовності включають такі, які направляють конститутивну експресію нуклеотидної послідовності в багатьох типах клітин, та такі, які направляють експресію нуклеотидної послідовності тільки в певних хазяйських клітинах або за певних умов. При цьому фахівцеві в даній галузі техніки буде зрозуміло, що конструювання експресійного вектора може залежати від таких факторів, як вибір хазяйської клітини, яку піддають трансформації, рівня експресії бажаного поліпептиду тощо. Експресійні вектори згідно з винаходом можуть бути введені в хазяйські клітини для одержання поліпептидів або пептидів, включаючи злиті поліпептиди або пептиди, які кодуються нуклеїновими кислотами, як описано в даній заявці (наприклад, ІМІ поліпептиди, злиті поліпептиди, тощо). В кращому втіленні згідно з даним винаходом ІМІ поліпептиди експресуються в рослинах та рослинних клітинах, таких, як клітини одноклітинних рослин (таких, як водорості) (Дивися Falciatore та ін., 1999, Marine Biotechnology 1(3):239-251 та посилання, які там наведені) та рослинних клітинах, отриманих від вищих рослин (наприклад, сперматофітів, таких, як рослини, що вживаються як їжа). ІМІ полінуклеотид може бути "введений" у рослинну клітину за допомогою будь-якого способу, включаючи трансфекцію, трансформацію або трансдукцію, електропорацiю, бомбардування частинками, агроінфікування, біолістику та тому інші. 13 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Прийнятні способи для трансформації або трансфекції хазяйських клітин, які включають клітини рослин, можуть бути знайдені в Sambrook та ін. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-е вид., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) та інших лабораторних посібниках, таких, як Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ред.: Gartland та Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Оскільки підвищена толерантність до імідазолінонових гербіцидів являє собою загальну бажану для успадкування характерну рису широкого кола рослин, подібних до кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритікале, рису, ячменю, сої, бавовника, рапса та каноли, маніока їстівного, перця, соняшника та чорнобривців, пасльонових рослин, подібних до картоплі, тютюну, баклажанам та томатам, видам Vicia, гороху, люцерні, чагарниковим рослинам (кава, какао, чай), видам Salix, деревним рослинам (гвінейській олійній пальмі, кокосовій пальмі), щетиннику безбородому та фуражним культурам, ці рослини також являють собою кращі цільові рослини для генетичного конструювання як додаткового втілення даного винаходу. У кращому втіленні ця рослина являє собою рослину пшениці. Фуражні культури без обмеження включають пирій повзучий, канареєчник канарський, костер, волосянець сибірський, тонконіг, їжу збірну, люцерну, Salfoin, лядвенець, шведську конюшину, червону конюшину та солодку конюшину. В одному втіленні згідно з даним винаходом трансфекція ІМІ полінуклеотиду в рослину досягається за допомогою опосередкованого Agrobacterium генного переносу. Один спосіб трансформації, відомий фахівцеві в даній галузі, являє собою занурення квіткової рослини в розчин, що містить Agrobacteria, де Agrobacteria містить ІМІ нуклеїнову кислоту, після чого здійснюють розмноження трансформованих гамет. Опосередкована Agrobacterium трансформація рослин може бути здійснена при використанні, наприклад, GV3101(pMP90) (Koncz та Schell, 1986, Моl. Gen. Genet. 204:383-396) або LBA4404 (Clontech) штаму Agrobacterium tumefaciens. Трансформація може бути здійснена за допомогою способів стандартної трансформації та регенерації (Deblaere та ін., 1994, Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton В. та Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2-е вид. - Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995, - в Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Benard R. та Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology та Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Наприклад, рапс може бути трансформований за допомогою трансформації сім'ядолі або гіпокотиля (Moloney та ін., 1989, Plant Cell Report 8:238-242; De Block та ін., 1989, Plant Physiol. 91:694-701). Застосування антибіотиків для Agrobacterium та рослинної селекції залежить від бінарного вектора та штаму Agrobacterium, використовуваного для трансформації. Селекцію рапсу звичайно здійснюють при використанні канаміцину як рослинного селективного маркера. Опосередкований Agrobacterium перенос генів у бавовнику може бути здійснений при використанні, наприклад, методики, описаної Mlynarova та ін., 1994, Plant Cell Report 13:282-285. Крім того, трансформація сої може бути здійснена при використанні, наприклад, способу, описаного в європейському патенті № 0424 047, патенті США № 5,322,783, європейському патенті № 0397 687, патенті США № 5,376,543 або патенті США № 5,169,770. Трансформація кукурудзи може бути досягнута за допомогою бомбардування частинками, опосередкованого поліетиленгліколем захоплення ДНК або за допомогою методики на основі волокон карбіду кремнію (дивися, наприклад, Freeling та Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Специфічний приклад трансформації кукурудзи може бути знайдений у патенті США № 5,990,387, а специфічний приклад трансформації пшениці може бути знайдений у заявці РСТ WO 93/07256. Згідно з даним винаходом введений ІМІ полінуклеотид може стабільно підтримуватися в рослинній клітині, якщо він вводиться в нехромосомний автономний реплікон або інтегрується в рослинні хромосоми. Альтернативно, введений ІМІ полінуклеотид може бути представлений в екстрахромосомному векторі, що не реплікується, та може бути транзієнтно експресований або транзієнтно активним. В одному втіленні може бути отриманий гомологічний рекомбінантний мікроорганізм, в якому ІМІ полінуклеотид інтегрований у хромосому, при цьому одержують вектор, що містить, принаймні, частину гена AHAS, в який введена делеція, доповнення або заміна для його зміни, наприклад, функціональний розрив, для зміни, таким чином, ендогенного гена AHAS та для створення ІМІ гена. Для створення точкової мутації за допомогою гомологічної рекомбінації можна використовувати гібриди ДНК-РНК у методиці, відомій як химеропластика (Cole-Strauss та ін., 1999, Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 та Kmiec, 1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247). Інші процедури гомологічної рекомбінації у видах Triticum є також відомими в області техніки та розглядаються для застосування в даній заявці. 14 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У векторі гомологічної рекомбінації ІМІ ген може бути фланкований на своїх 5' та 3' кінцях додатковою молекулою нуклеїнової кислоти AHAS гена, для того, щоб дозволити здійснювати гомологічну рекомбінацію між екзогенним геном ІМІ, що несе вектор, та ендогенним AHAS геном, у мікроорганізмі або рослині. Додаткова фланкуюча AHAS молекула нуклеїнової кислоти має достатню довжину для гомологічної рекомбінації з ендогенним геном. Типово, у вектор включається від кількох сотень пар основ до кілобаз фланкуючої ДНК (як на 5', так і на 3' кінці) (дивися, наприклад, Thomas, K. R. та Capecchi, M. R., 1987, Cell 51:503 для опису векторів гомологічної рекомбінації або Strepp та ін., 1998, PNAS, 95(8):4368-4373 для опису рекомбінації на основі кДНК в Physcomitrella patens). Проте, оскільки ІМІ ген у нормі відрізняється від AHAS дуже незначною кількістю амінокислот, фланкуюча послідовність, не завжди є необхідною. Вектор гомологічної рекомбінації вводиться в мікроорганізм або рослинну клітину (наприклад, за допомогою опосередкованої поліетиленгліколем ДНК), та клітини, в які введений ІМІ ген є гомологічно рекомбінованими з ендогенним AHAS геном, піддають селекції при використанні добре відомих у рівні техніки методик. В іншому втіленні можуть бути отримані рекомбінантні мікроорганізми, які містять відібрані системи, що дозволяють здійснювати регульовану експресію вбудованого гена. Наприклад, включення ІМІ гена у вектор, що перебуває під контролем lac оперона, дозволяє здійснювати експресію ІМІ гена тільки в присутності IPTG. Такі регуляторні системи є добре відомими в області техніки. Або у випадку присутності в екстрахромосомному векторі,що не реплікується, або у векторі, що є інтегрованим у хромосому, ІМІ полінуклеотид переважно перебуває в рослинній експресійній касеті. Рослинна експресійна касета переважно містить регуляторні послідовності, здатні направляти генну експресію в рослинних клітинах, які є оперативно зв'язаними таким чином, щоб кожна послідовність могла здійснювати свою функцію, наприклад, функцію термінації транскрипції за допомогою сигналів поліаденілування. Кращі сигнали поліаденілування є такими, які мають походження від t-ДНК Agrobacterium tumefaciens, такими, як ген 3, відомий як октопинсинтаза Ті-плазміди рТіАСН5 (Gielen та ін., 1984, ЕМВО J. 3:835) або функціональними еквівалентами, проте всі інші функціонально активні в рослинах термінатори є прийнятними. Оскільки генна експресія дуже часто не є обмеженою на транскрипційних рівнях, рослинна експресійна касета переважно містить інші оперативно зв'язані послідовності, подібні до трансляційних енхансерів, такі як овердрайв-послідовність, що містить 5'нетрансльовану лідерну послідовність з вірусу мозаїки тютюну, що підвищує співвідношення поліпептиду до РНК (Gallie та ін., 1987, Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Приклади рослинних експресійних векторів включають такі, що докладно описаними в: Becker, D. та ін., 1992, New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Моl. Biol. 20:1195-1197; Bevan, M.W., 1984, Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; та Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering та Utilization, ред.: Kung та R. Wu, Academic Press, 1993, стор. 15-38. Експресія рослинного гена повинна бути оперативно зв'язаною з прийнятним промотором, що здійснює експресію гена вчасно, залежним від переважного типу клітин або залежним від переважного типу тканин чином. Промотори, корисні в експресійних касетах згідно з винаходом, включають будь-який промотор, що є здатним до ініціації транскрипції в рослинній клітині. Такі промотори включають без обмеження такі, які можуть бути отримані з рослин, рослинних вірусів та бактерій, які містять гени, що експресуються в рослинах, таких як, наприклад, Agrobacterhim та Rhizobium. Промотор може бути конститутивним, індуцибельним, переважним для певної стадії розвитку, переважним для певного типу клітин, переважним для тканини або специфічним для органа. Конститутивні промотори є активними при більшості умов. Приклади конститутивних промоторів включають промотори CaMV 19S та 35S (Odell та ін., 1985, Nature 313:810-812), sX CaMV 35S промотор (Каутаін., 1987, Science 236:1299-1302), Sep1 промотор, актиновий промотор рису (McElroy та ін., 1990, Plant Cell 2:163-171), актиновий промотор Arabidopsis, убіквітиновий промотор (Christensen та ін., 1989, Plant Molec. Віоl. 18:675-689); pEmu (Last та ін., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:581-588), промотор 35S вірусу мозаїки ранника шишкуватого, Smas промотор (Velten та ін., 1984, ЕМВО J. 3:2723-2730), GRP1-8 промотор, промотор цинамілалкогольдегідрогенази (патент США № 5,683,439), промотори з Т-ДНК Agrobacterium, такі, як манопінсинтаза, нопалінсинтаза та октопінсинтаза, промотор малої субодиниці рибулозобіфосфаткарбоксилази, (ssuRUBISCO) тощо. Індуцибельні промотори є активними за певних умов навколишнього середовища, таких, як присутність або відсутність живильної речовини або метаболіту, тепла або холоду, світла, інфекцією патогенів, анаеробніе умови тощо. Наприклад, hsp80 промотор з Brassica індукується 15 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 тепловим шоком; PPDK промотор індукується світлом, PR-1 промотори з тютюну, Arabidopsis та кукурудзи індукуються інфекцією патогена; a Adh1 промотор індукується гіпоксією та холодовим стресом. Експресія рослинних генів може бути також удосконалена при використанні індуцибельного промотора (для огляду дивися Gatz, 1997, Аnnu. Rev. Plant Physiol. Plant Моl. Biol. 48:89-108). Промотори, які хімічно індукуються, є особливо прийнятними, якщо є бажаної час-специфічна генна експресія. Приклади таких промоторів являють собою промотор, що індукується, саліциловою кислотою (заявка РСТ WO 95/19443), промотор, що індукується, тетрацикліном (Gatz та ін., 1992, Plant J. 2:397-404) та промотор що індукується етанолом, (заявка РСТ WO 93/21334). Бажані для певної стадії розвитку промотори переважно експресуються на певних стадіях розвитку. Бажані для тканини та органа промотори включають такі, які переважно експресуються в певних тканинах або органах, таких, як листя, корінь, насіння або ксилема. Приклади бажаних для тканини та бажаних для органа промоторів включають без обмеження такі, бажані для плода, бажані для семяпочки, бажані для чоловічої тканини, бажані для насіння, бажані для оболонки, бажані для бульб, бажані для стебла, бажані для перикарпію, бажані для листя, бажані для рильця, бажані для пилка, бажані для пиляка, бажані для пелюстків, бажані для чашолистків, бажані для плодоніжки, бажані для стручка, бажані для стебла, бажані для кореня тощо. Бажані для насіння промотори переважно експресуються під час розвитку насіння та/або проростання. Наприклад, бажані для насіння промотори можуть бути переважними для зародка, переважними для ендосперму, переважними для оболонки насіння. Дивися Thompson та ін., 1989, BioEssays 10:108. Приклади кращих для насіння промоторів включають без обмежень такі целюлозасинтази (ee1), Сіm1, гамма-зеїну, глобуліну1, зеїну 19 кД кукурудзи (cZ19B1), тощо. Інші прийнятні бажані для тканини або бажані для органа промотори включають промотор напінового гена з насіння рапсу (патент США № 5,608,152), USP-промотор з Vicia faba (Baeumlein та ін., 1991, Моl. Gen Genet. 225(3):459-67), олеозиновий промотор з Arabidopsis (заявка РСТ WO 98/45461), фазеоліновий промотор з Phaseolus vulgaris (патент США № 5,504,200), Все4-промотор з Brassica (заявка РСТ WO 91/13980), або легуміновий В4 промотор (Le4; Baeumlein та ін., 1992, Plant Journal, 2(2):233-9), а також промотори, що забезпечують специфічну для насіння експресію в однодольних рослинах, подібних кукурудзі, ячменю, пшениці, житу, рису тощо Прийнятні промотори, які слід зазначити, являють собою промотор Ipt2 або lpt1 генів з ячменю (Заявка РСТ WO 95/15389 та заявка РСТ WO 95/23230) або ті, які описані в заявці РСТ WO 99/16890 (промотори з гордеїнового гена ячменю, глутелінового гена рису, оризинового гена рису, проламінового гена рису, гліадинового гена пшениці, глутелінового гена пшениці, казеринового гена сорго та секалінового гена жита). Інші промотори, корисні в експресійних касетах згідно з винаходом, без обмеження включають промотор основного зв'язувально білка хлорофілу а/Ь, промотори гістону, Ар3 промотор, β-конгліциновий промотор, напіновий промотор, промотор лектину сої, промотор зеїну 15 кД кукурудзи, промотор зеїну 22 кД, промотор зеїну 27 кД, g-промотор зеїну, восковий промотор, промотори shrunken 1, shrunken 2 та бронзовий промотор, Zm13 промотор (патент США № 5,086,169), промотори полігалактуронази кукурудзи (PG) (патенти США №№ 5,412,085 та 5,545,546) та SGB6 промотор (патент США № 5,470,359), а також синтетичні або інші природні промотори. [0080] Додаткова гнучкість у контролі гетерологічної генної експресії в рослинах може бути отримана при використанні доменів, що зв'язують ДНК, та елементів відповіді, отриманих з гетерологічних джерел (тобто домени, що зв'язують ДНК, отримані з нерослинних джерел). Приклад такого домена, що зв'язує ДНК, являє собою LexA ДНКсполучний домен (Brent та Ptashne, 1985, Cell 43: 729-736). Даний винахід забезпечує експресійні касети для експресії молекул полінуклеотиду згідно з винаходом у рослинах, рослинних клітинах та інших хазяйських клітинах, відмінних від людських. Експресійні касети включають промотор, здатний до експресії в рослині, рослинній клітині, або інших хазяйських клітинах, що представляють інтерес, які є оперативно зв'язаним з ІМІ нуклеїновою кислотою. Якщо необхідно націлювання експресії на хлоропласт, то експресійна касета може також включати оперативно зв'язану націлюючу на хлоропласт послідовність, що кодує хлоропластний транзитний пептид, для направлення експресованого ІМІ білка в хлоропласт. В одному втіленні ІМІ нуклеїнові кислоти є націленими для експресії в хлоропластах. Таким чином, якщо ІМІ нуклеїнова кислота не є безпосередньо вбудованою в хлоропласт, те експресійна касета буде додатково містити націлюючу на хлоропласт послідовність, що включає нуклеотидну послідовність, яка кодує хлоропластний транзитний пептид для направлення генного продукту, що представляє інтерес, у хлоропласти. Такі транзитні пептиди 16 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 є відомими з рівня техніки. Відносно хлоропласт-націлюючих послідовностей термін "оперативно зв'язаний" означає, що послідовність нуклеїнової кислоти, яка кодує транзитний пептид (тобто, хлоропласт-націлююча послідовність), є зв'язаною з ІМІ нуклеїновою кислотою згідно з винаходом так, що дві послідовності є суміжними в одній та тій самій рамці зчитування. Дивися, наприклад, Von Heijne та ін. (1991) Plant Моl. Biol. Rep. 9:104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; та Shah та ін. (1986) Science 233:478481. Тоді як ІМІ білки згідно з винаходом можуть включати нативний хлоропластний транзитний пептид, будь-який хлоропластний транзитний пептид, відомий з рівня техніки, може бути злитий з амінокислотною послідовністю зрілого ІМІ білка згідно з винаходом шляхом оперативного зв'язування хлоропласт-націлюючої послідовності з 5'-кінцем нуклеотидної послідовності, що кодує зрілий ІМІ білок згідно з винаходом. Хлоропласт-націлюючі послідовності, є відомими з рівня техніки та включають хлоропластну малу субодиницю рибулозо-1, 5-біфосфаткарбоксилази (Rubisco ) (de Castro Silva Filho та ін. (1996) Plant Моl. Biol. 30:769-780; Schnell та ін. (1991) J. Вiol. Chem. 266(5):3335-3342); 5(енолпірувіл)шикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer та ін. (1990) J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); триптофансинтазу (Zhao та ін. (1995) J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); пластоцианін (Lawrence та ін. (1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt та ін. (1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457); та білок, що зв'язує хлорофіл a/b (LHBP) (Lamppa та ін. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999). Дивися також Von Heijne та ін. (1991) Plant Моl. Biol. Rep. 9:104-126; Clark та ін. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; DellaCioppa та ін. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer та ін. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; та Shah та ін. (1986) Science 233:478-481. ІМІ нуклеїнові кислоти або експресійна касета, що включає ІМІ нуклеїнові кислоти, може також бути введена в хлоропласт для експресії в ньому. Способи трансформації хлоропластів є відомими з рівня техніки. Дивися, наприклад, Svab та ін. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab та Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab та Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Спосіб ґрунтується на доставці за допомогою гармати для частинок ДНК, що містить селективний маркер, та націлюванні ДНК на пластидний геном за допомогою гомологічної рекомбінації. Крім того, пластидна трансформація може бути здійснена за допомогою трансактивації мовчазного трансгена, що походить від пластид, шляхом специфічної для тканини експресії РНК-полімерази, яка кодується ядром та є спрямованою на пластиди. Така система була описана в McBride та ін. (1994) Ρroc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301-7305. IMI нуклеїнові кислоти, націлені на хлоропласт, можуть бути оптимізовані для експресії в хлоропласті для підрахування відмінностей відносно використовуваності кодонів між ядром рослини та цієї органелою. Таким чином, нуклеїнові кислоти, що представляють інтерес, можуть бути синтезовані при використанні бажаних для хлоропласта кодонів. Дивися, наприклад, патент США № 5,380,831, що введений у дану заявку як посилання. Якщо це необхідно для хлоропластної експресії, то експресійна касета може додатково включати хлоропластний промотор, оперативно зв'язаний з ІМІ нуклеїновою кислотою. Такі хлоропластні промотори є добре відомими з рівня техніки. Інший аспект даного винаходу відноситься до хазяйських клітин, у які був введений рекомбінантний експресійний вектор згідно з винаходом. Терміни "хазяйська клітина" та "рекомбінантна хазяйська клітина" використовуються почергово в даній заявці. При цьому зрозуміло, що такі терміни відносяться не тільки до конкретної клітини, але вони також застосовні до потомства або потенційного потомства такої клітини. Оскільки певні модифікації можуть виникати в наступних генераціях завдяки або мутації, або впливу навколишнього середовища, таке потомство може фактично не бути ідентичним батьківській клітині, проте таке потомство все-таки включається в об'єм термінів, використовуваних у даній заявці. Хазяйська клітина може бути прокаріотичної або еукаріотичною клітиною. Наприклад, ІМІ полінуклеотид може експресуватися в бактеріальних клітинах, таких, як С. glutamicum, клітини комах, клітини грибів або клітини ссавців (такі, як клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) або COS клітини), водорості, інфузорії, клітини рослин, гриби або інші організми, подібні до С. glutamicum. Інші прийнятні хазяйські клітини є відомими фахівцеві в даній галузі техніки. Хазяйска клітина відповідно до винаходу, така як прокаріотична або еукаріотична хазяйська клітина в культурі, може використовуватися для одержання ІМІ полінуклеотиду. Відповідно, даний винахід додатково забезпечує способи для одержання ІМІ поліпептидів при використанні хазяйських клітин відповідно до винаходу. В одному втіленні спосіб включає культивування хазяйської клітини згідно з винаходом (клітини, в яку був введений рекомбінантний експресійний вектор, що кодує ІМІ поліпептид, або в геном якої був введений ген, що кодує ІМІ поліпептид 17 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дикого типу) у прийнятному середовищі до одержання ІМІ поліпептиду. В іншому втіленні спосіб додатково включає ізолювання ІМІ поліпептидів із середовища або хазяйської клітини. Інший аспект згідно з винаходом відноситься до ізольованих ІМІ поліпептидів та їх біологічно активних частин. "Ізольований" або "очищений" поліпептид або його біологічно активна частина є вільними від деякого клітинного матеріалу, коли вони отримані за допомогою способу рекомбінантної ДНК, або при використанні хімічних попередників або інших хімічних реактивів, коли вони синтезуються хімічно. Вираз "істотно вільний від клітинного матеріалу" включає препарати ІМІ поліпептиду, в яких поліпептид є відокремленим від деяких компонентів клітин, в яких він був природним або рекомбінантним способом отриманий. В одному втіленні вираз "істотно вільний від клітинного матеріалу" включає препарати ІМІ поліпептиду, що містять менше ніж приблизно 30% (від сухої ваги) матеріалу, відмінного від ІМІ (який також у даній заявці називається як "контамінуючий поліпептид"), більш переважно менше ніж приблизно 20% матеріалу, відмінного від ІМІ, ще більш переважно менше ніж приблизно 10% матеріалу, відмінного від ІМІ, та найбільш переважно менше ніж приблизно 5% матеріалу, відмінного від ІМІ. Коли ІМІ поліпептид або його біологічно активна частина є отриманим рекомбінантним способом, також є бажаним, щоб він був істотно вільним від культурального середовища, тобто культуральне середовище містить менше ніж приблизно 20%, більш переважно менше ніж приблизно 10% та найбільш переважно менше ніж приблизно 5% від об'єму препарату поліпептиду. Вираз "істотно вільний від хімічних попередників або інших хімічних агентів" включає препарати ІМІ поліпептиду, в яких поліпептид є відокремленим від хімічних попередник або інших хімічних агентів, які залучені у синтез поліпептиду. В одному втіленні вираз "істотно вільний від хімічних попередників або інших хімічних агентів" включає препарати ІМІ поліпептиду, що містять менше ніж приблизно 30% (від сухої ваги) хімічних попередників або хімічних агентів, більш переважно менше ніж приблизно 20% хімічних попередників та хімічних агентів, ще більш переважно менше ніж приблизно 10% хімічних попередників та хімічних агентів та найбільш бажано менше ніж приблизно 5% хімічних попередників та хімічних агентів. У кращих втіленнях ізольовані поліпептиди або їх біологічно активні частини не містять контамінуючих поліпептидів з того ж організму, з якого отриманий ІМІ поліпептид. Звичайно такі поліпептиди одержують за допомогою рекомбінантної експресії, наприклад, ІМІ поліпептиду Triticum aestivum у рослинах, відмінних від Triticum aestivum, або мікроорганізмах, таких як С. glutamicum, інфузорії, водорості або грибки. Полінуклеотидна та поліпептидна послідовності ІМІ згідно з винаходом мають безліч способів застосування. Послідовності нуклеїнової кислоти та амінокислотні послідовності згідно з даним винаходом можуть використовуватися для трансформації рослин, модулюючи, таким чином, толерантність рослин до імідазолінонових гербіцидів. Відповідно, винахід забезпечує спосіб одержання трансгенної рослини, що володіє підвищеною толерантністю до імідазолінонового гербіциду що включає (а) трансформацію рослинної клітини одним або більше експресійними векторами, що включають одну або більше ІМІ нуклеїнових кислот та (b) одержання з рослинної клітини трансгенної рослини з підвищеною толерантністю до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. В одному втіленні множинні ІМІ нуклеїнові кислоти мають походження від різних геномів. У даний винахід також включаються способи одержання трансгенної рослини, що володіє підвищеною толерантністю до імідазолінонового гербіциду, що включають (а) трансформацію рослинної клітини експресійним вектором, що включає ІМІ нуклеїнову кислоту, де нуклеїнова кислота є не -Imi1 нуклеїновою кислотою та (b) одержання з рослинної клітини трансгенної рослини з підвищеною толерантністю до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. Даний винахід включає способи модифікації рослинної толерантності до імідазолінонового гербіциду, що передбачають модифікацію експресії однієї або більше ІМІ нуклеїнових кислот. Толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду може бути підвищена або знижена, що досягається шляхом підвищення або зниження експресії ІМІ полінуклеотиду, відповідно. Переважно, толерантність рослин до імідазолінонового гербіциду підвищується шляхом підвищення експресії ІМІ полінуклеотиду. Експресія ІМІ полінуклеотиду може бути модифікована за допомогою будь-якого способу, відомого фахівцеві в даній галузі техніки. Способи підвищення експресії ІМІ полінуклеотидів можуть використовуватися, коли рослина є або трансгенною, або нетрансгенною. У випадках, коли рослина є трансгенною, рослина може бути трансформоване за допомогою вектора, що містить яку-небудь із нуклеїнових кислот, що кодують ІМІ, або рослина може бути трансформована за допомогою промотору, що, наприклад, направляє експресією ендогенних ІМІ полінуклеотидів у рослині. Даний винахід передбачає, що такий промотор може бути специфічним для тканин або таким, який регулюється розвитком. 18 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Альтернативно, нетрансгенна рослина може мати експресію ендогенного ІМІ полінуклеотиду, модифіковану шляхом індукції нативного промотора. Експресія полінуклеотидів, що включають полінуклеотидні послідовності, як визначено в SEQ ID NO:1, у рослинах, які представляють інтерес, може бути без обмеження здійснена, за допомогою одного з наступних прикладів: (а) конститутивного промотора, (b) промотора, здатного до хімічної індукції, та (с) сконструйованого промотора понадекспресії при використанні, наприклад, транскрипційних факторів, що мають походження від "цинкових пальців" (Greisman та Pabo, 1997, Science 275:657). У кращому втіленні транскрипція ІМІ полінуклеотиду модулюється при використанні транскрипційних факторів, що мають походження від "цинкових пальців" (ZFP), як описано в Greisman та Pabo, 1997, Science 275: 657 та застосовано на практиці Sangamo Biosciences, Inc. Такі ZFP включають як домен впізнання ДНК, так і функціональний домен, що викликає активацію або репресію цільової нуклеїнової кислоти, такої, як ІМІ нуклеїнова кислота. Таким чином, може бути здійснені активація та репресія ZFP при використанні специфічного впізнання ІМІ полінуклеотидних промоторів, описаних вище, це може бути використано для підвищення або зниження експресії ІМІ полінуклеотиду в рослині, що дає можливість, таким чином, модулювати гербіцидну толерантність рослини. Як описано більш докладно вище, рослини, отримані за допомогою способів відповідно до даного винаходу, можуть бути однодольними або дводольними. Рослини можуть бути вибрані, наприклад, з кукурудзи, пшениці, жита, вівса, тритікале, рису, ячменю, сої, бавовника, рапсу, каноли, маніока їстівного, перцю, соняшника, чорнобривців, пасльонових рослин, картоплі, тютюну, баклажанів та томатів, видів Vicia, гороху, люцерни, кави, какао, чаю, видів Salix, гвінейської олійної пальми, кокосової пальми, щетинника безбородого та фуражних культур. Фуражні культури без обмеження включають пирій повзучий, канареечник канарський, костер, волосянець сибірський, мятлик, їжу збірну, люцерну, Salfoin, лядвенець, шведську конюшину, червону конюшину та солодку конюшину. У кращому втіленні рослина представляє собою рослину пшениці або рослину тритікале. У кожному зі способів, описаних вище, рослинна клітина без обмеження включає протопласт, клітину, що виробляє гамету, клітину, яка регенерується в цільну рослину. Як використовується в даній заявці, термін "трансгенний" відноситься до будь-якої рослини, рослинної клітині, калусу, рослинної тканини або частини рослини, які містять весь або частину, принаймні, одного рекомбінантного полінуклеотиду. У багатьох випадках весь або частина рекомбінантного полінуклеотиду є стабільно інтегрованою в хромосому або стабільний екстрахромосомний елемент, так, що він передається наступним поколінням. Як описано вище, даний винахід забезпечує композиції та способи для та підвищення імідазолінонової толерантності рослини або насіння у порівнянні з рослиною або насінням дикого типу. У бажаному втіленні імідазолінонова толерантність рослини або насіння пшениці підвищується так, що рослина або насіння можуть протистояти застосуванню імідазолінонового гербіциду у дозі переважно приблизно 10-300 г/га, більш переважно 20-160 г/га та найбільш переважно 40-80 г/га. Як використовується в даній заявці, термін "протистояти" застосуванню імідазолінонового гербіциду означає, що рослина або не знищується, або не ушкоджується при такому застосуванні. Даний винахід забезпечує рослини, частини рослин, органи рослин, тканини рослин, клітини рослин, насіння та хазяйські клітини, що володіють підвищеною толерантністю, принаймні, до одного імідазолінонового гербіциду, коли порівняються з рослиною, частиною рослини, органом рослини, тканиною рослини, клітиною рослини, насіннями та хазяйською клітиною рослини дикого типу, відповідно. Під такими "рослиною, частиною рослини, органом рослини, тканиною рослини, клітиною рослини, насінням та хазяйською клітиною рослини дикого типу" розуміють, що рослина, частина рослини, орган рослини, тканина рослини, клітини рослини, насіння та хазяйська клітина рослини, відповідно, є такими дикого типу стосовно характеристик толерантності до гербіцидів рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС 5625 та/або не включають ІМІ нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом. Тобто, така рослина дикого типу, частина рослини, орган рослини, тканина рослини, клітина рослини, насіння або хазяйська клітина не має характеристик толерантності до гербіциду рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС 5625 та/або не включає ІМІ нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом. Застосування терміна "дикого типу" не є, таким чином, призначеним для того, щоб мати на увазі, щорослина, частина рослини, орган рослини, тканина рослини, клітини рослини, насіння та хазяйська клітина рослини не містять рекомбінантної ДНК у своєму геномі та/або, що вони не мають характеристики гербіцидної толерантності, та/або що ІМІ нуклеїнові кислоти відрізняються від таких для характеристик гербіцидної толерантності та ІМІ нуклеїнових кислот відповідно до даного винаходу. 19 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, в даній заявці забезпечується спосіб контролю бур'янів, що виростають поблизу рослини пшениці або тритікале, який включає застосування імідазолінонового гербіциду до бур'янів та до рослини пшениці або тритікале, при цьому рослина пшениці або тритікале має підвищену толерантність до імідазолінонового гербіциду в порівнянні з рослиною пшениці або тритікале дикого типу, та де толерантна до імідазолінону рослина пшениці або тритікале включає, принаймні, одну ІМІ нуклеїнову кислоту. В одному втіленні рослина включає множинні ІМІ нуклеїнові кислоти. В іншому втіленні рослина включає Imi1 нуклеїнову кислоту. Шляхом забезпечення рослин пшениці та тритікале, що володіють підвищеною толерантністю до імідазолінону, може використовуватися широка різноманітність композицій для захисту рослин пшениці та тритікале від бур'янів, для того, щоб поліпшити ріст рослин та знизити конкуренцію за поживні речовини. Імідазоліноновий гербіцид може використовуватися сам по собі для контролю бур'янів перед проростанням, після проростання, допосадкового, післяпосадкового контролю бур'янів на ділянках, які оточують рослини пшениці, описані в даній заявці, або може використовуватися композиція імідазолінонового гербіциду, що містить добавки. Імідазоліноновий гербіцид може також використовуватися для обробки насіння. Добавки, використовувані в композиції імідазолінонового гербіциду, включають інші гербіциди, детергенти, допоміжні речовини, агенти для розпилення, агенти для склеювання, стабілізуючі агенти або подібні до них. Композиція імідазолінонового гербіциду може представляти собою вологий або сухий препарат та може без обмеження являти собою текучі порошки, здатні до емульгування концентрати та рідкі концентрати. Імідазоліноновий гербіцид та гербіцидні композиції можуть застосовуватися відповідно до традиційних способів, наприклад, шляхом розбризкування, зрошення, розпилення або подібних способів. Даний винахід додатково забезпечує вектори трансформації, що включають ген селективного маркера відповідно до винаходу. Ген селективного маркера включає промотор, що управляє експресією в хазяйській клітині, оперативно зв'язаний з ІМІ нуклеїновою кислотою згідно з винаходом. Вектор трансформації може додатково включати ген, що представляє інтерес, який піддають експресії в хазяйській клітині, та може також, якщо це є бажаним, включати хлоропласт-націлюючу послідовність, оперативно зв'язану з полінуклеотидом згідно з винаходом. Даний винахід також забезпечує способи застосування векторів трансформації згідно з винаходом для відбору клітин, трансформованих геном, що представляє інтерес. Такі способи передбачають трансформацію хазяйської клітини за допомогою вектора трансформації, обробку клітини таким рівнем імідазолінонового гербіциду або гербіциду на основі сульфонілсечовини, що буде знищувати або інгібувати ріст нетрансформованої хазяйської клітини, а також ідентифікацію трансформованої хазяйської клітини на її здатність до росту в присутності гербіциду. В одному втіленні згідно з винаходом хазяйська клітина являє собою клітину рослини, а ген селективного маркерного гена включає промотор, що управляє експресією в рослинній клітині. Вектори трансформації згідно з винаходом можуть використовуватися для одержання рослин, трансформованих за допомогою гена, що представляє інтерес. Вектор трансформації буде включати ген селективного маркерного гена згідно з винаходом та ген, що представляє інтерес, який вбудовується та типово експресується в трансформованій рослині. Такий селективний маркерний ген включає ІМІ нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, оперативно зв'язану з промотором , що управляє експресією в хазяйській клітині. ІМІ нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, полінуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, функціональні фрагменти та варіанти кожної з цих полінуклеотидних послідовностей, де фрагмент або варіант кодує поліпептид, що включає заміну аланіну на треонін у положенні 96, що відповідає AHAS поліпептиду дикого типу. Для використання в рослинах та рослинних клітинах вектор трансформації включає селективний маркерний ген, що містить ІМІ нуклеїнову кислоту згідно з винаходом, оперативно зв'язану з промотором, що управляє експресією в рослинній клітині. Винахід також відноситься до рослинного експресійного вектора, що включає промотор, який управляє експресією в рослині, оперативно зв'язаний з ІМІ нуклеїновою кислотою згідно з винаходом. ІМІ нуклеїнова кислота включає полінуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO:1, полінуклеотидну послідовність, що кодує амінокислотну послідовність, представлену в SEQ ID NO:2, та функціональні фрагменти та варіанти кожної з цих полінуклеотидних послідовностей, де фрагмент або варіант кодує поліпептид, що включає заміну аланіну на треонін у положенні 96, що відповідає AHAS поліпептиду дикого типу. Рослинний експресійний вектор згідно з винаходом не залежить від конкретного промотору, за 20 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винятком того, що такий промотор є здатним направляти експресію в рослинній клітині. Кращі промотори включають конститутивні промотори та специфічні для тканини промотори. Гени згідно з винаходом, що представляють інтерес, будуть варіювати в залежності від бажаного результату. Наприклад, різні зміни у фенотипі можуть бути такими, які представляють інтерес, включаючи модифікацію складу жирних кислот у рослині, зміну вмісту амінокислот рослини, зміну рослинних механізмів захисту від комах та/або патогенів, тощо. Ці результати можуть бути досягнуті шляхом забезпечення експресії гетерологічних продуктів або підвищеної експресії ендогенних продуктів у рослинах. Альтернативно, результати можуть бути досягнуті шляхом забезпечення зниження експресії одного або більше ендогенних продуктів, зокрема, ферментів або кофакторів, у рослині. Такі зміни приводять до зміни фенотипу трансформованої рослини. В одному втіленні згідно з винаходом гени, що представляють інтерес, включають гени резистентності до комах, такі, як, наприклад, гени білка токсину Bacillus thuringiensis (патенти США №№ 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; та Geiser та ін. (1986) Gene 48:109). ІМІ білки або поліпептиди згідно з винаходом можуть бути отримані, наприклад, від рослин каноли та можуть використовуватися в складі композицій. Крім того, ІМІ нуклеїнова кислота, що кодує ІМІ білок згідно з винаходом, може використовуватися для експресії ІМІ білка згідно з винаходом в мікроорганізмі, такому, як Е. соli або дріжджі. Експресований ІМІ білок може бути очищений від екстрактів Е. соli або дріжджів за допомогою будь-якого зі способів, відомих середньому фахівцеві в даній галузі техніки. В деяких втіленнях згідно з винаходом способи передбачають застосування гербіцидтолерантних рослин або гербіцид-резистентних рослин. Під "гербіцид-толерантною" або "гербіцид-резистентною" рослиною розуміють, що рослина є толерантною або резистентною, принаймні, до одного гербіциду при рівні, що у нормі приводить до загибелі або інгібує ріст звичайної рослини або рослини дикого типу. В одному втіленні згідно з винаходом, толерантні до гербіциду рослини згідно з винаходом включають ІМІ нуклеїнову кислоту, що кодує ІМІ білок. Для цілей даного винаходу терміни "гербіцид-толерантний" та "гербіцид-резистентний" використовуються почергово та мають еквівалентне значення та еквівалентний об'єм. Подібно до цього, терміни "толерантність до гербіциду" та "резистентність до гербіциду" використовуються почергово та призначені для позначення еквівалентних понять та еквівалентного об'єму. Крім того, "імідазолінон-резистентний" та "імідазолінон-резистентність" використовуються почергово та призначені бути еквівалентними поняттями та мають еквівалентний об'єм, що й терміни "імідазолінон-толерантний" та "імідазолінон-толерантність", відповідно. Даний винахід забезпечує рослини, тканини рослин, рослинні клітини та хазяйські клітини з підвищеною резистентністю або толерантністю, принаймні, до одного гербіциду, зокрема, гербіциду, що перешкоджає активності AHAS ферменту, особливо імідазолінонового гербіциду або гербіциду на основі сульфонілсечовини. Бажана кількість або концентрація гербіциду є "ефективною кількістю" або "ефективною концентрацією". Під "ефективною кількістю" та "ефективною концентрацією" розуміють кількість та концентрацію, відповідно, які є достатніми для того, щоб знищити або інгібувати ріст подібної рослини, рослинної тканини, рослинної клітини, мікроспори дикого типу або хазяйської клітини, але ця зазначена кількість не призводить до загибелі або не інгібує так сильно резистентні до гербіциду рослини, рослинні тканини, рослинні клітини, мікроспори та хазяйські клітини згідно з даним винаходом. Типово, ефективна кількість гербіциду являє собою кількість, що звичайно використовується в системах виробництва сільськогосподарської продукції для знищення бур'янів. Така кількість є відомою середньому фахівцеві в даній галузі техніки або може бути легко визначене при використанні способів, відомих в області техніки. Крім того, визнається, що ефективна кількість гербіциду в системі виробництва сільськогосподарської продукції може істотно відрізнятися від ефективної кількості гербіциду в системі рослинної культури in vitro. ІМІ нуклеїнові кислоти згідно з даним винаходом можуть використовуватися для трансформації будь-якого виду рослин, які представляють інтерес, включаючи без обмеження кукурудзу або маїс (Zea mays), Brassica sp. (наприклад, В. napus, В. rapa, B. juncea), зокрема, ті види Brassica, які є корисними як джерела олії, одержуваної з насіння, люцерну (Medicago sativa), рис (Oryza sativa), жито (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (наприклад, пеннісету рогозовидну (Pennisetum glaucum), просо звичайне (Рапісит miliaceum), італійське просо (Setaria italica), елевзіне (Eleusine coracana)), соняшник (Helianthus annuus), сафлор красильний (Carthamus tinctorius), пшеницю (Triticum aestivum, Т. Turgidum ssp. durum), сою (Glycine max), тютюн (Nicotiana tabacum), картоплю (Solanum tuberosum), земляний горіх 21 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Arachis hypogaea), бавовник (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), солодку картоплю (Іротоеа batatus), маніоку (Manihot esculenta), каву (Coffea spp.), кокос (Cocos nucifera), ананас (Ananas comosus), цитрусові рослини (Citrus spp.), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia sinensis), банани (Musa spp.), авокадо (Persea americana), інжир (Ficus casica), гуайяву (Psidium guajava), манго (Mangifera indica), маслини (Olea europaea), папайю (Caricapapaya), горіх кеш'ю (Anacardium occidentale), макадамію (Macadamia integrifolia), мигдаль (Prumis amygdalus), цукровий буряк (Beta vulgaris), цукрову тростину (Saccharum spp.), овес, ячмінь, овочеві культури, декоративні рослини та хвойні рослини. Бажано, коли рослини згідно з даним винаходом представляють собою вирощувані культурні рослини (наприклад, соняшник, Brassica sp., бавовник, цукровий буряк, соя, земляний горіх, люцерна, сафлор, тютюн, кукурудза, рис, пшениця, жито, ячмінь, тритікале, сорго, просо, тощо). Резистентні до гербіциду рослини згідно з винаходом знаходять своє застосування в способах контролю бур'янів. Таким чином, даний винахід також забезпечує спосіб контролю бур'янів, що виростають поблизу з резистентними до гербіциду рослинами згідно з винаходом. Спосіб включає застосування ефективної кількості гербіциду до бур'янів та до гербіцидрезистентних рослин, де рослина має підвищену резистентність, принаймні, до одного гербіциду, зокрема, до імідазолінонового або сульфонілсечовинного гербіциду в порівнянні з рослиною дикого типу. У такому способі для контролю бур'янів гербіцид-резистентні рослини згідно з винаходом являють собою переважно оброблювані рослини, включаючи без обмеження, соняшник, люцерну, Brassica sp., сою, бавовник, сафлор, земляний горіх, тютюн, томати, картоплю, пшеницю, рис, кукурудзу, сорго, ячмінь, рис, просо та сорго. Шляхом забезпечення рослин, що володіють підвищеною резистентністю до імідазолінонових та сульфонілсечовинних гербіцидів, може використовуватися широка різноманітність композицій для захисту рослин від бур'янів, для того, щоб поліпшити ріст рослин та знизити конкуренцію за поживні речовини. Гербіцид може використовуватися сам по собі для контролю бур'янів перед проростанням, після проростання, передпосадкового, посадкового контролю бур'янів на ділянках, які оточують рослини, описані в даній заявці, або може використовуватися композиція імідазолінонового гербіциду, що містить інші добавки. Гербіцид може також використовуватися для обробки насіння. Тобто ефективна концентрація або ефективна кількість гербіциду може застосовуватися безпосередньо до насіння перед посівом або під час посіву насіння. Добавки, використовувані в композиції імідазолінонового гербіциду або сульфонілсечовинного гербіциду, включають інші гербіциди, детергенти, допоміжні речовини, агенти для розпилення, склеювальні агентип, стабілізуючі агенти або подібні. Гербіцидна композиція може представляти собою вологий або сухий препарат та може без обмеження являти собою текучі порошки, здатні до емульгування концентрати та рідкі концентрати. Гербіцид та гербіцидні композиції можуть застосовуватися відповідно до традиційних способів, наприклад, шляхом розбризкування, зрошення, розпилення або подібних способів. Даний винахід забезпечує нетрансгенне та трансгенне насіння з підвищеною толерантністю, принаймні, до одного гербіциду, зокрема, гербіциду, що інгібує AHAS, особливо імідазолінонового гербіциду. Таке насіння включає, наприклад, нетрансгенне насіння пшениці, що володіє характеристиками толерантності до гербіцидів рослини з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС 5625, та трансгенне насіння, що включає молекулу ІМІ нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, що кодує ІМІ білок. Даний винахід забезпечує способи одержання резистентної до гербіциду рослини, зокрема, резистентної до гербіциду рослини пшениці або тритікале, за допомогою традиційного розведення рослин, що передбачає статеве розмноження. Спосіб включає схрещування першої рослини, що є резистентною до гербіциду, з другою рослиною, що є резистентною до другого гербіциду. Перша рослина може представляти собою будь-яку гербіцид-резистентну рослину згідно з даним винаходом, включаючи, наприклад, трансгенні рослини, що містять, принаймні, один з полінуклеотидів згідно з даним винаходом, який кодує резистентний до гербіциду ІМІ білок, та нетрансгенні рослини пшениці, які мають характеристики резистентності до гербіциду рослини пшениці з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС 5625. Друга рослина може бути будь-якою рослиною, що є здатною утворювати життєздатні рослини потомства (тобто, насіння), коли схрещується з першою рослиною. Типово, але не необхідно, коли перша та друга рослини належать до того самого виду. Способи згідно з винаходом можуть також включати одне або більше поколінь зворотного схрещування потомства рослин першого схрещування з рослиною тієї ж лінії генотипу, що й або перша, або друга рослина. Альтернативно, потомство першого схрещування або якогось наступного схрещування може бути схрещене із третьою рослиною, що являє собою таку, відмінну від першої або другої 22 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рослини лінії або генотипу. Способи згідно з винаходом можуть додатково включати відбір рослин, які мають характеристики толерантності до гербіциду першої рослини. Даний винахід додатково забезпечує способи підвищення гербіцид-резистентності рослини, зокрема, резистентної до гербіциду рослини пшениці, за допомогою традиційного розведення рослин, що передбачає статеве розмноження. Способи включають схрещування першої рослини, що є резистентною до гербіциду, із другою рослиною, що може бути або може не бути резистентною до гербіциду, або може бути резистентною до гербіциду або гербіцидів, відмінних від таких для першої рослини. Перша рослина може являти собою будь-яку резистентну до гербіциду рослину згідно з даним винаходом, включаючи, наприклад, трансгенні рослини, що містять, принаймні, одну з ІМІ нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом, які кодують ІМІ білок, та нетрансгенною рослиною пшениці та тритікале, що мають характеристики толерантності до гербіциду рослини пшениці з номером депонування для цілей патентної процедури в АТСС 5625. Друга рослина може бути будь-якою рослиною, здатним утворювати життєздатні рослини потомства (тобто, насіння), коли схрещується з першою рослиною. Типово, але не необхідно, коли перша та друга рослина належать до того самого виду. Рослини потомства, отримані за допомогою способу згідно з даним винаходом, мають підвищену резистентність до гербіциду в порівнянні або з першою рослиною, або із другою, або з обома. Коли перша та друга рослини є резистентними до різних гербіцидів, то рослини потомства будуть мати комбіновані характеристики толерантності до гербіциду першої та другої рослин. Способи згідно з винаходом можуть також включати одне або більше поколінь зворотного схрещування потомства рослин першого схрещування з рослиною тієї ж лінії або генотипу, що й перша рослина, або друга. Альтернативно, потомство першого схрещування або будь-якого наступного схрещування може бути схрещене із третьою рослиною, що являє собою таку, відмінну від першої або другої рослини лінії або генотипу. Способи згідно з винаходом можуть додатково передбачати відбір рослин, які мають характеристики толерантності до гербіциду першої рослини, другої рослини, або і першої, і другої рослин. Рослини згідно з даним винаходом можуть бути трансгенними або нетрансгенними. Приклад нетрансгенної рослини пшениці, що володіє підвищеною резистентністю до імідазолінону, являє собою рослину пшениці (Shiloh-8), що має номер депонування для цілей патентної процедури АТСС 5625; або мутант, рекомбінант, або генетично сконструйовану похідну рослини, що має номер депонування АТСС 5625, або будь-яке потомство рослини, що має номер депонування АТСС 5625; або рослину, що є потомством якої-небудь із цих рослин; або рослину, що має характеристики толерантності до гербіциду рослини з номером депонування АТСС 5625. Даний винахід також забезпечує рослини, органи рослин, тканини рослин, рослинні клітини, насіння та хазяйські клітини, відмінні від людських, які є трансформованими за допомогою, принаймні, однієї молекули полінуклеотиду, експресійної касети або вектора трансформації згідно з винаходом. Такі трансформовані рослини, органи рослин, тканини рослин, рослинні клітини, насіння та хазяйські клітини, відмінні від людських, мають підвищену толерантність або резистентністю, принаймні, до одного гербіциду, при рівнях гербіциду, які призводять до загибелі або інгібують ріст нетрансформованої рослини, органів рослин, тканин рослин, рослинних клітин, насіння та хазяйських клітин, відмінних від людських, відповідно. Бажано, коли трансформована рослина, органи рослин, тканини рослин, рослинні клітини та насіння згідно з винаходом є такими Arabidopsis thaliana та оброблюваних рослин. Даний винахід забезпечує способи, які передбачають застосування, принаймні, одного гербіциду, що інгібує AHAS, вибраного з групи, що складається з імідазолінонових гербіцидів, сульфонілсечовинних гербіцидів, триазолпіримідинових гербіцидів, гербіцидів на основі піримідинілоксибензоату, гербіцидів на основі сульфоніламінокарбонілтриазолінону та на основі їх сумішей. У цих способах гербіцид, що інгібує AHAS, може застосовуватися за допомогою будь-якого способу, відомого з рівня техніки, що включає без обмеження обробку насіння, обробку ґрунту та обробку листя. Перед застосуванням гербіцид, що інгібує AHAS, може бути переведений у звичайні композиції, наприклад, розчини, емульсії, суспензії, пудру, порошки, пасти та гранули. Форма застосування залежить від конкретної мети; у кожному випадку вона повинна забезпечувати точний та рівномірний розподіл сполуки згідно з винаходом. Композиції готують при використанні відомого способу (дивися, наприклад, для огляду US 3,060,084, ЕР-А 707 445 (для рідких концентратів), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4-е вид., McGraw-Hill, New York, 1963, стор. 8-57 та всі наступні. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley та Sons, Inc., New York, 1961, Hance та ін., Weed Control 23 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Handbook, 8-е вид., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 та Mollet, H., Grubemann, Α., Formulation technology, Wiley VCH Verlag Gmb, Weinheim (Germany), 2001, 2. D. A. Knowles, Chemistry та Technology of Agrochemical Formulations, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1998 (ISBN 0-7514-0443-8), наприклад, шляхом доповнення активної сполуки допоміжними речовинами, прийнятними для композиції агрохімічних засобів, такими як розчинники та/або носії, якщо це є бажаним, то емульгаторами, сурфактантами та диспергувальними агентами, консервантами, противпінювальними агентами, агентами проти замерзання, для композицій, призначених для обробки насіння також необов'язково можуть використовуватися барвники та/або сполучні речовини та/або гелеутворювальні агенти. Приклади прийнятних розчинників являють собою воду, ароматичні розчинники (наприклад, продукти Solvesso, ксилен), парафіни (наприклад, фракції мінерального масла), спирти (наприклад, метанол, бутанол, пентанол, бензиловий спирт), кетони (наприклад, циклогексанон, гамма-бутирлактон), піролідони (NMP, NOP), ацетати (глікольдіацетат), гліколі, диметиламіди жирних кислот, жирні кислоти та естери жирних кислот. У принципі, також можуть використовуватися суміші розчинників. Приклади прийнятних носіїв являють собою природні мінерали (наприклад, каоліни, глину, тальк, крейду), та синтетичні мінерали (наприклад, високо дисперсний кремнезем, силікати). Прийнятні емульгатори являють собою неіонні та аніонні емульгатори (наприклад, жирні спиртові естери поліоксіетилену, алкілсульфонати та арилсульфонати). Приклади диспергувальних агентів являють собою рідкі відходи лігнінсульфіту та метилцелюлози. Прийнятні сурфактанти, що використовуються, являють собою, лужні метали, лужноземельні метали та солі амонію лігносульфонової кислоти, нафталінсульфонової кислоти, фенолсульфонової кислоти, дибутилнафталінсульфонової кислоти, алкіларилсульфонати, алкілсульфати, алкілсульфонати, сульфати жирних спиртів, жирні кислоти та сульфатовані гліколеві етери жирного спирту, а також конденсати сульфованого нафталіну та похіднихнафталіну з формальдегідом, конденсати нафталіну або нафталінсульфонової кислоти з фенолом та формальдегідом, поліоксіетиленоктилфеноловий етер, етоксильований ізооктилфенол, октилфенол, нонілфенол, полігліколеві етери поліоксіетилену, полігліколевий етер трибутилфенілу, полігліколевий етер тристеарилфенілу, алкіларилполіефірні спирти, конденсати етиленоксиду та спирту та жирного спирту, етоксильоване касторове масло, алкілові етери поліоксіетилену, етоксильований поліоксипропілен, поліглікольетерацеталь лаурилового спирту, естери сорбіту, рідкі відходи лігносульфіту та метилцелюлози. Речовини, які є прийнятними для приготування розчинів, що безпосередньо розприскують, емульсій, паст або масляних дисперсій являють собою фракції мінерального масла від середньої до високої точки кипіння, такі, як гас або дизельне паливо, а також кам'яновугільний дьоготь та масла рослинного або тваринного походження, аліфатичні, циклічні та ароматичні вуглеводні, наприклад, толуол, ксилен, парафін, тетрагідронафталін, алкіловані нафталіні або їх похідні, метанол, етанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, ізофорон, високо полярні розчинники, наприклад, диметилсульфоксид, N-метилпіролідон або воду. До композиції також можуть додаватися такі речовини, як агенти проти замерзання, такі, як гліцерин, етиленгліколь, пропіленгліколь та бактерициди. Прийнятні протиспінювальні агенти являють собою, наприклад, антиспінювальні агенти на основі кремнію або стеарату магнію. Прийнятні консерванти являють собою, наприклад, дихлорофен та бензилалкогольгеміформаль. Композиції для обробки насіння можуть додатково включати зв'язувальну речовину та необов'язково барвники. Зв'язувальні агенти можуть додаватися для підвищення адгезії активних матеріалів на насіннях після обробки. Прийнятні зв'язувальні агенти представляють собой блок-співполімери ЕО/РО сурфактантів, а також полівінілові спирти, полівінілпіролідони, поліакрилати, поліметакрилати, полібутени, поліізобутилени, полістирени, поліетиленаміни, поліетиленаміди, поліетиленіміцни (Lupasol®, Polymin®), поліетери, поліуретани, полівінілацетати, тилозу та співполімери, які мають походження від цих полімерів. У композицію також необов'язково можуть включатися барвники. Прийнятні барвні речовини або барвники для композицій, призначених для обробки насіння, являють собою родамін В, С.І. Червоний пігмент 112, С.І. розчинник червоний 1, блакитний пігмент 15:4, блакитний пігмент 15:3, блакитний пігмент 15:2, блакитний пігмент 15:1, блакитний пігмент 80, жовтий пігмент 1, жовтий пігмент 13, червоний пігмент 112, червоний пігмент 48:2, червоний пігмент 48:1, червоний пігмент 57:1, червоний пігмент 53:1, жовтогарячий пігмент 43, жовтогарячий пігмент 24 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 34, жовтогарячий пігмент 5, зелений пігмент 36, зелений пігмент 7, білий пігмент 6, коричневий пігмент 25, основний фіолетовий 10, основний фіолетовий 49, кислий червоний 51, кислий червоний 52, кислий червоний 14, кислий блакитний 9, кислий жовтий 23, основний червоний 10, основний червоний 108. Приклади прийнятних гелеутворювальних агентів являють собою ірландський мох (Satiagel). Порошки, матеріали для розсіювання та продукти, здатні до розпилення, можуть бути отримані шляхом змішування або паралельного подрібнювання активних речовин із твердим носієм. Гранули, наприклад, покриті оболонкою гранули, імпрегновані гранули та гомогенні гранули можуть бути отримані шляхом зв'язування активних сполук із твердими носіями. Приклади твердих носіїв являють собою мінерали, такі, як силікагелі, силікати, тальк, каолін, атапульгіт, вапняк, вапно, крейда, залізовмісну вапняну глину, лес, глину, доломіт, діатомову землю, сульфат кальцію, сульфат магнію, оксид магнію, синтетичні мінеральні матеріали, добрива, такі, як, наприклад, сульфат амонію, фосфат амонію, нітрат амонію, сечовини та продукти рослинного походження, такі, як зернове борошно, борошно з деревної кори, деревне борошно та борошно з горіхової шкарлупи, порошки целюлози та інші тверді носії. У загальному випадку композиції включають від 0,01 до 95 ваг.%, переважно від 0,1 до 90 ваг. %, гербіциду, що інгібує AHAS. У цьому випадку гербіциди, що інгібують AHAS, використовуються при чистоті від 90 ваг. % до 100 ваг. %, переважно від 95 ваг. % до 100 ваг. % (відповідно до спектру ЯМР). Для цілей обробки насіння відповідні композиції можуть бути розведені в 2-10 разів, що приводить до одержання концентрації в готових до застосування препаратах від 0,01 до 60 ваг. % активної сполуки, переважно від 0,1 до 40 ваг. %. Гербіцид, що інгібує AHAS, може використовуватися як такий, у формі своїх композицій або форм, які з нього готують, наприклад, у формі розчинів, що розприскують безпосередньо, порошків, суспензій або дисперсій, емульсій, масляних дисперсій, паст, продуктів, які піддають розпорошуванню, матеріалів для розпилення або гранул, які використовуються шляхом розбризкування, атомізації, розпилення, розкидання або розливання. Застосування форм повністю залежить від переслідуваних цілей; вони призначені для забезпечення в коленому випадку, по можливості, більш тонкого розподілу гербіциду, який інгібує AHAS, згідно з винаходом. Використовувані водні форми можуть бути отримані з емульсійних концентратів, паст та змочувальних порошків (здатні до розбризкування порошки, масляні дисперсії) шляхом додання води. Для готування емульсій, паст або масляних дисперсій речовини безпосередньо або у розчиненому в маслі або розчиннику вигляді можуть бути гомогенізовані у воді при використанні змочувального агента, речовини для підвищення клейкості, диспергувального агента або емульгатора, якщо це є прийнятним, розчинника або масла, такі концентрати є прийнятними для розведення водою. Концентрації активних сполук у готових до використання препаратах можуть варіювати у відносно широких межах. У загальному випадку вони становлять від 0,0001 до 10 ваг. %, переважно від 0,01 до 1 ваг.%. Гербіцид, що інгібує AHAS, може також успішно використовуватися в ультра дрібносерійному процесі (ULV), є можливим застосовувати композиції, що містять більше 95 ваг. % активної сполуки, або навіть застосовувати активну сполуку без добавок. Нижче наведені приклади композицій: 1. Продукти, призначені для розведення водою при застосуванні для обробки листя. Для обробки насіння такі продукти можуть застосовуватися до насіння у розведеному або нерозведеному вигляді. А) Водорозчинні концентрати (SL, LS) Десять вагових частин гербіциду, що інгібує AH AS, розчиняли в 90 вагових частинах води або водорозчинного розчинника. Як альтернативний варіант, додавали змочувальні агенти або інші допоміжні речовини. Гербіцид, що інгібує AHAS, розчинявся при розведенні за допомогою води, що забезпечувало одержання композиції гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 10 % (ваг./ваг.) В) Здатні до диспергування концентрати (DC) Двадцять вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, розчиняли в 70 вагових частинах циклогексанону з доданням 10 вагових частин диспергувального агенту, наприклад полівінілпіролідону. Розведення водою забезпечувало одержання дисперсії, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 20% (ваг./ваг.). 60 25 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 С) Здатні до емульгування концентрати (EC) П'ятнадцять вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, розчиняли в 7 вагових частинах ксилену з доданням додецилбензолсульфонату кальцію та етосилату касторової олії (у кожному випадку 5 вагових частин). Розведення водою забезпечувало одержання емульсії, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 15% (ваг./ваг.). D) Емульсії (EW, ЕО, ES) Двадцять п'ять вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, розчиняли в 35 вагових частинах ксилену з доданням додецилбензолсульфонату кальцію та етоксилату касторової олії (у кожному випадку 5 вагових частин). Суміш вносили в 30 вагових частин за допомогою пристрою для емульгування (наприклад, Ultraturrax), та суміш перетворювали на гомогенну емульсію. Розведення водою забезпечувало одержання емульсії, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 25% (ваг./ваг.). Е) Суспензії (SC, OD, FS) У кульовому млині з перемішуванням поєднували 20 вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, з доданими 10 ваговими частинами диспергувальних агентів, змочувальних агентів та 70 ваговими частинами води або органічного розчинника для одержання тонкої суспензії гербіциду, що інгібує AHAS. Розведення водою забезпечувало одержання стабільної суспензії гербіциду, що інгібує AHAS, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 20% (ваг./ваг.). F) Здатні до дисперсії у воді гранули та водорозчинні гранули (WG, SG) П'ятдесят вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, тонко подрібнювали з доданням 50 вагових частин диспергувальних агентів та змочувальних агентів та готували здатні до дисперсії у воді гранули та водорозчинні гранули при використанні технічних засобів (наприклад, при використанні екструзії, колони з розпилювальним зрошенням, псевдозрідженого шару). Розведення водою забезпечувало одержання стабільної дисперсії або розчину гербіциду, що інгібує AHAS, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 50% (ваг./ваг.). G) Здатні до дисперсії у воді порошки та водорозчинні порошки (WP, SP, SS, WS) Сімдесят вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, подрібнювали в роторно-статорному млині з доданням 25 вагових частин диспергувальних агентів, змочувальних агентів та силікагелю. Розведення водою забезпечувало одержання стабільної дисперсії або розчину гербіциду, що інгібує AHAS, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 75% (ваг ./ваг.). І) Гелева композиція (GF) У кульовому млині з перемішуванням поєднували 20 вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, з доданими 10 ваговими частинами диспергувальних агентів, 1 частиною гелеутворювального агенту, змочувального агенту та 70 ваговими частинами води або органічного розчинника для одержання тонкої суспензії гербіциду, що інгібує AHAS. Розведення водою забезпечувало одержання стабільної суспензії гербіциду, що інгібує AHAS, при цьому одержували композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 20% (ваг./ваг.). Ця гелева композиція є прийнятною для обробки насіння. 2. Продукти, які застосовуються в нерозведеному вигляді для обробки листя. Для обробки насіння такі продукти можуть застосовуватися до насіння у розведеному виді. А) Порошки, здатні до розпилення (DP, DS) П'ять вагових частин гербіциду, що інгібує AHAS, тонко подрібнювали та ретельно змішували з 95 ваговими частинами тонко здрібненого каоліну. Це забезпечувало одержання здатного до розпилення продукту, що містить 5% (ваг./ваг.) гербіциду, що інгібує AHAS. В) Гранули (GR, FG, GG, MG) Половину вагової частини гербіциду, що інгібує AHAS, тонко подрібнювали та поєднували з 95,5 ваговими частинами носіїв, одержуючи в такий спосіб композицію гербіциду, що інгібує AHAS, з концентрацією 0,5% (ваг./ваг.). Сучасними способами є використанні екструзії, використання колони з розпилювальним зрошенням, псевдозрідженого шару. Це забезпечує одержання гранул, які використовуються в нерозведеному вигляді для обробки листя. Традиційні композиції для обробки насіння включають, наприклад, текучі концентрати FS, розчини LS, порошки для сухої обробки DS, здатні до дисперсії у воді порошки для обробки глинистою суспензією WS, водорозчинні порошки SS та емульсії ES, а також ЕС та гелеві композиції GF. Ці композиції можуть використовуватися для обробки насіння розведеними або нерозведеними. Застосування для обробки насіння здійснюють перед посівом, або безпосередньо наносять на насіння. 26 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У кращому втіленні FS композиція використовується для обробки насіння. Типово, FS композиція може включати 1-800 г/л активного інгредієнта, 1-200 г/л сурфактанта, від 0 до 200 г/л агенту проти замерзання, від 0 до 400 г/л зв'язувального агента, від 0 до 200 г/л пігменту та розчинник до 1 літра, переважно води. Даний винахід відноситься до нетрансгенного та трангенного насіння резистентних до гербіциду рослин згідно з даним винаходом. Таке насіння включає, наприклад, нетрансгенне насіння пшениці, що володіє характеристиками толерантності до гербіциду рослини, що має номер депонування для цілей патентної процедури 5625, та трансгенне насіння, що включає молекулу полінуклеотиду згідно з винаходом, що кодує ІМІ білок. Для обробки насіння таке резистентних до гербіциду рослин згідно з даним винаходом обробляють гербіцидами, переважно гербіцидами, вибраними із групи, що складається з гербіцидів, які інгібують AHAS, таких, як амідосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, нікосульфурон, оксасульфурон, примісульфурон, просульфурон, піразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, клорамсулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, біспірибак, піримінобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пірибензоксим, пірифталід, піритіобак та їх суміші, або з композицією, що включає гербіцид, який інгібує AHAS. Термін "обробка насіння" включає всі прийнятні методики обробки насіння, відомі в області техніки, такі, як протравлювання насіння, нанесення речовин на насіння, опудрювання посівного матеріалу, замочування насіння та дражирування насіння. Відповідно до варіанта даного винаходу додатковий об'єкт даного винаходу представляє собою спосіб обробки ґрунту шляхом застосування, зокрема, у машині для висівання насіння, або гранулярної препаративної форми, що містить гербіцид, який інгібує AHAS, у вигляді композиції/препарату (наприклад, гранулярної композиції необов'язково з одним або більше твердими або рідкими прийнятними для сільського господарства носіями та/або необов'язково з одним або більше прийнятними для сільського господарства поверхнево-активними речовинами. Цей спосіб переважно використовується, наприклад, при підготовці ґрунту до посіву зернових культур, кукурудзи, бавовника та соняшника. Даний винахід також включає насіння, покрите композицією для обробки насіння, або таке, що містить цю композицію, яка містить, принаймні, один гербіцид, який інгібує AHAS, вибраний із групи, що включає амідосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфурон, етаметсульфурон, етоксисульфурон, флазасульфурон, флупірсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, імазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, нікосульфурон, оксасульфурон, примісульфурон, просульфурон, піразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, імазаметабенз, імазамокс, імазапік, імазапир, імазаквін, імазетапір, клорамсулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, біспірибак, піримінобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пірибензоксим, пірифталід, піритіобак. Термін "насіння" охоплює насіння та паростки всіх видів, включаючи без обмеження, справжнє насіння, частини насіння, відростки, бульбоцибулину, цибулини, плоди, бульби, зерно, черешки, пагони тощо та означає в кращому втіленні справжнє насіння. Термін "покритий та/або такий, що містить" у загальному випадку означає, що активний інгредієнт перебуває для більшої частини на поверхні продукту розмноження під час застосування, незважаючи на те, що більша або менша частина інгредієнта може проникати в продукт розмноження, залежно від способу застосування. Коли зазначений продукт розмноження піддається висаджуванню або пересаджуванню, то він може абсорбувати цей активний інгредієнт. Застосування обробки насіння за допомогою гербіциду, що інгібує AHAS, або за допомогою композиції, що містить гербіцид, який інгібує AHAS, здійснюють шляхом розбризкування або розпилення на насіння перед висівом рослин або перед появою сходів рослин. При обробці насіння відповідні композиції застосовуються за допомогою обробки насіння ефективною кількістю гербіциду, що інгібує AHAS, або композицією, що містить гербіцид, що інгібує AHAS. У даній заявці норми застосування в загальному випадку становлять від 0,1 г до 10 кг активного інгредієнта (або суміші активного інгредієнта або композиції) на 100 кг насіння, 27 UA 97623 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно від 1 г до 5 кг на 100 кг насіння, зокрема, від 1 г до 2.5 кг на 100 кг насіння. Для специфічних культур, таких, як салат-латук, норма може бути вищою. Даний винахід забезпечує спосіб боротьби з небажаною рослинністю або контролю бур'янів, що включає контакт насіння стійких рослин відповідно до даного винаходу перед висівом та/або після попереднього пророщення з гербіцидом, який інгібує AHAS. Спосіб також включає висівання насіння, наприклад, у ґрунт на поле або в середовище, що міститься в горщиках у теплиці. Спосіб знаходить, зокрема, своє застосування при боротьбі з небажаною рослинністю або контролю бур'янів, що виростають у безпосередній близькості з насінням. Контроль небажаної рослинності розуміють у значенні знищення бур'янів та/або пригнічення іншим способом або інгібування нормального росту бур'янів. Бур'яни в широкому змісті розуміють у значенні всіх тих рослин, які виростають у місцях, де вони є небажаними. Бур'яни згідно з даним винаходом включають, наприклад, дводольні та однодольні бур'яни. Дводольні бур'яни включають без обмеження бур'яни родів: Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Chenopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xanthium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solatium, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus та Taraxacum. Однодольні бур'яни включають без обмеження бур'яни родів: Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorghum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus, Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus та Apera. Крім того, бур'яни згідно з даним винаходом можуть включати, наприклад, культурні рослини, які вирощуються в небажаних місцях. Наприклад, самовисівна рослина кукурудзи, що перебуває на полі, що переважно включає рослини сої, може вважатися бур'яном, якщо рослина кукурудзи є небажаною на полі, де виростають рослини сої. Невизначені артиклі використовуються в даній заявці для позначення одного або більше (тобто, принаймні, одного) об'єктів. Як приклад, вказівка на елемент означає один або більше елементів. Як використовується в даній заявці, слово "такий, що включає" або варіації цього слова, такі, як "включає" або "містить" будуть розумітися для того, щоб мати на увазі включення зазначеного елемента, чогось цільного або дії, групи елементів, безлічі цільних об'єктів або дій. Наступні приклади пропонуються для ілюстрації, але не для обмеження даного винаходу. ПРИКЛАД 1 Мутагенез та селекція ліній толерантної пшениці Зразки насіння сорту 1,500 Shiloh кожний поміщали в 1000 мл лабораторну склянку та заповнювали склянку водою, принаймні, на 1 дюйм вище рівня насіння. Склянки потім поміщали в холодильник при 4°С на15-20 годин. Зразки насіння виймали з холодильника та переносили в умови кімнатної температури на період приблизно 3 годин шляхом переносу лабораторної склянки в зазначені умови. У деяких випадках процес нагрівання прискорювали шляхом додання деіонізованої води до вмісту склянок. Зливали деіонізовану воду та осушували насіння, а лабораторну склянка заповнювали розчином азиду натрію, принаймні, на 1 дюйм вище рівня насіння. Розчин азиду натрію готували шляхом додання 27,218 г KН2РО4 до 1500 мл деіонізованої води, доводили значення рН розчину до рН 3 за допомогою концентрованої Н3РО4 та доводили отриманий розчин до об'єму 2 л при використанні деіонізованої води. Безпосередньо перед застосуванням додавали 0,2604 г NaN3, та розчин витримували в темряві. Після додання розчину азиду натрію до насіння, вміст склянок інкубували в темряві при кімнатній температурі протягом 2 годин при нерегулярному перемішуванні. Розчин для обробки, що містить азид натрію, декантували, та зразки насіння двічі промивали деіонізованою водою. Потім зразки насіння покривали водою, принаймні, на 1 дюйм вище рівня насіння, та піддавали замочуванню при кімнатній температурі протягом періоду 1 години при нерегулярному перемішуванні. Деіонізовану воду декантували, та насіння рівномірно розподіляли на паперовому рушнику для осушення. Насіння висівали в поле, поблизу Бертуда, Колорадо, на шести ділянках розміром 5 футів на 40 футів. Збирали приблизно 15 фунтів М2 насіння, та приблизно 466000 насінин висівали поблизу Платтевілля, Колорадо. Поля обприскували за допомогою 1 × (40 г/га (імазамокс)) або 2 × (80 г/га (імазамокс)). Рослини, толерантні до гербіциду, ідентифікували та висаджували в горщики об'ємом 1 галон, після чого піддавали яровизації протягом 4 тижнів при 45°F. Одержували чотирнадцять вибірок по одній рослині для 2 × норми площі. Толерантні М2 рослини забирали для яровизації, 28