Застосування кверцетину як інгібітора jnk-кіназ

Реферат: UA 101057 U UA 101057 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до фармації та медицини, а саме до застосування відомої сполуки кверцетину для інгібування JNK-кіназ. Значна кількість хвороб людини прямо або побічно пов'язана з аномальним функціонуванням кіназ. Порушення регуляції внутрішньоклітинних механізмів, до яких належать редокс-чутливі системи мітоген-активованих JNK-кіназ важлива ланка патогенезу багатьох захворювань. Отримані експериментальні докази підтверджують наявність тісного зв'язку між активацією JNK та розвитком патологічних станів [1]. Фармакологічне втручання в JNK-кіназний каскад - перспективний метод корекції стану інсулінорезистентності, атеросклерозу, метаболічного синдрому і т.д. JNK-кінази - ферменти, що беруть участь у передачі сигналів від клітинної мембрани до ядра і апарату генної транскрипції, грають ключову роль у розвитку багатьох захворювань людини. Активація JNK спостерігається при токсичному ураженні клітин печінки, неалкогольному стеатозі, цирозі, діабеті 2-го типу, широкому спектрі онкологічних захворювань печінки та ін. JNK-кінази, або c-Jun N-кінцевих кінази - це група серин -треонінових кіназ, що являють собою клас ферментів, які каталізують перенесення фосфатної групи від АТФ на субстрати з сериновими і треоніновими залишками, і, таким чином, відповідають за регуляцію сигнальних внутрішньоклітинних механізмів. Як головні учасники внутрішньоклітинної мережі трансдукції поза- і внутрішньо-клітинних сигналів, JNK-кінази є регуляторами багатьох клітинних процесів, у тому числі, процесу регулювання чутливості клітин до інсуліну. Окислювальний стрес є універсальним механізмом пошкодження клітини при патології різного ґенезу і характеризується підвищенням внутрішньоклітинної генерації активних форм кисню (АФК) внаслідок порушення - збалансованості антиоксидантної та прооксидантної систем. Нині концепція, що припускає виключно шкідливий вплив АФК на функціонування клітини, переглядається. Широку популярність набув термін "окислювальна регуляція", що відображає активну роль окислювально-відновлювальних модифікацій протеїнів у регуляції функцій клітин. Змінені в результаті впливу АФК молекули можна вважати сигналами, що несуть біологічну інформацію, необхідну для регуляції різних клітинних функцій, зокрема реалізації апоптозу. АФК можуть впливати на різні шляхи ініціації апоптичної програми через внутрішньоклітинні редоксзалежні системи передавання сигналу. Оксидант-активовані фосфоліпази стимулюють безліч кіназ, включаючи мітоген-активовані (МАР-кінази) сімейства JNK. Останні фосфорилюють білкимішені, пов'язані з регуляцією клітинної загибелі та функціонуванням відповідних факторів транскрепцій. Встановлено що редокс-залежна JNK-кіназа може індукувати апоптоз за рахунок участі в передачі ініціюючого сигналу з TNF-рецептора, шляхом фосфорилювання і актіваціі фактора транскрипції проапоптотических білків Вах і Bad (після транслокації в мітохондріях), фосфорилювання і інактивації антиапоптотических білків сімейства BCL2. Активація протеїнкінази також викликає фосфорилювання Bad і підвищує рівень експресії проапоптогенного білка. Однак є дані, що свідчать про антиапоптотичні функції JNK, що залежить від характеру стресових сигналів, варіантів поєднання шляхів їх передачі та типів клітин. У зв'язку з цим метою даного дослідження було вивчення впливу JNK-протеїнкіназ на реалізацію апоптозу, при окислювальному стресі, що є невід'ємним елементом патогенезу широкого спектра захворювання (онкологічних, серцево-судинних, запальних). В даний час виявлено велику кількість сигнальних шляхів, регульованих АФК. Серед них найбільшою мірою вивчені механізми, засновані на фосфорилюванні і дефосфорилюванні білків специфічними кіназами і фосфатазами. Зокрема, універсальними трансмітерами сигналів від безлічі поверхневих трансмембранних рецепторів і позаклітинних стимуляторів до внутрішньоклітинних компартментів є МАР-кінази. Відомо що після активації МАР-кінази можуть брати участь у процесах клітинної проліферації, диференціювання та апоптозу. Отримані результати свідчать про проапоптогенну роль даних кіназ в умовах окислювального стресу, так як використання їх селективних інгібіторів блокує запуск летальної програми інсулінових клітин. Таким чином, пошук нових молекул та розробка фармацевтичних засобів, здатних діяти як інгібітори JNK, є надзвичайно актуальною проблемою. Першим з таких інгібіторів був розроблений 1,3-бензотіазол-2-іл-(2-[[2-(3піридиніл)етил]аміно}-4-піримідиніл)ацетонітрил. Він інгібірує JNK-кінази та проявляє активність ІС50 150 нмоль/л проти JNK1, 220 нмоль/л проти JNK2 та 70 нмоль/л проти JNK3. При проведенні доклінічних досліджень на пацюках проти церебральної ішемії, він проявив нейропротекторну дію. AS601245 також демонструє протизапальну активність. Але недоліком AS601245 є слаба проникливість всередину клітини [2-5]. 1 UA 101057 U 5 Задачею корисної моделі є розширення арсеналу засобів, які виявляють здатність інгібувати активність JNK-кіназ, які можна використовувати для профілактики та лікування патологічних станів, пов'язаних з інсулінорезистентністю клітин, а саме ожиріння, атеросклерозу, цукрового діабету 2-го типу. Поставлена задача вирішується шляхом застосування кверцетину формули OH OH HO O OH OH 10 15 20 25 30 O як інгібітора JNK-кіназ. Авторами вперше було виявлено невідомий раніше спектр фармакологічної дії кверцетину, що дозволяє використовувати цю сполуку та як інгібітор JNK-кіназ. Одержані результати свідчать, що заявлений засіб достовірно проявляє інгібіторну дію щодо JNK. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1 Дослідження проводили in vitro на гепатоцитах самців щурів лінії Wistar масою 180-220 г, яких утримували на стандартному раціоні. Виділення гепатоцитів проводили за модифікованим методом Seglen [6] із печінки щурів лінії Wistar. Печінку подрібнювали, суспензію з фрагментами печінки інкубували 1-2 хв, клітини фільтрували крізь нейлоновий сітчастий фільтр із діаметром пор 100 мкм. Гепатоцити витримували на льоду впродовж всього процесу. Кінцевий осад клітин переважно містив 90 % гепатоцитів. Надалі клітини інкубували в присутності досліджуваних інгібіторів (001, 002, 003) і кверцетину (KB) в концентрації 50 μΜ. Суспензії досліджуваних речовин готували з додаванням Твін-80. Суспензія контрольних клітин містила Твін-80 відповідної концентрації. Визначали активність аланінамінотрансферази (АЛТ), глікогенсинтетази (ГС), вміст у клітинах триацилгліцеринів (ТГ) з використанням стандартних наборів реактивів фірми Феліс-Діагностика (м. Дніпропетровськ, Україна). Антиоксидантну активність оцінювали за освітою забарвлених комплексів з тіобарбітурової кислотою (ТБК). Отримані результати представлені в Таблиці. Як видно з представлених результатів, речовина 001 і кверцетин достовірно знижували активність АЛТ, тоді як інші сполуки не змінювали даний показник. Також слід зазначити, що КB зменшував вміст ТБК-РП в культивованих гепатоцитах, в той час, як інші досліджувані речовини таку активність не проявляли. Подібна дія КB є його перевагою в порівнянні з іншими речовинами, оскільки він гальмує розвиток оксидативного стресу, який, у свою чергу, активує JNK-кіназу. Показано, що речовина 003 стимулювала накопичення ТГ в клітинах, що, можливо, спричинило збільшення рівня ТБК-РП. Таблиця Вплив інгібіторів JNK на активність АЛТ, ГС, вміст ТГ і ТБК реактивних продуктів (ТБК-РП) в ізольованих гепатоцитах (Μ±s, n=6) АЛТ, Кмоль/ч*мл Интакт Контроль 001 002 003 кв гс, нмоль/хв/мг білка 0,0389±0,0017 0,0387±0,0006 0,0356±0,0012 0,0361±0,0003 0,0366±0,0006 0,0321±0,0011 1,7±0,04 1,4±0,05 2,4±0,08 2,4±0,06 2,4±0,04 2,9±0,04 35 2 ТГ, 6 Ммоль/7,8*10 клітин 1,547±0,071 1,491±0,025 1,781±0,149 2,301±0,928 0,951±0,157 0,951±0,158 ТБК-РП, нмоль/мг білка 0,470,07 0,490,03 0,320,04 0,460,02 0,590,03 0,300,01 UA 101057 U 5 Вивчено також вплив речовин на рівні тригліцеридів на сироватці крові білих щурів під 2 експериментальної дм (ммоль/л, n=6) (див. фіг.). Як видно з фігури, перший інгібітор JNK-кінази (G0001) вміст Тг підвищується в 2 рази. Підвищений вміст ТГ говорити про те, що активність INK кінази підвищується. G0001 містить у складі N- (3-ціано-4,5,6,7-тетрагідро-1-бензотін-2-у1)-1нафтамід, який має дуже високу інгібуючу активність. Таким чином, проведені дослідження показали, що кверцетин дозозалежно зменшує активність аланінамінотрансферази (АЛТ), глікогенсинтетази (ГС) в інкубаційному середовищі гепатоцитів та зменшує вміст у клітинах триацилгліцеридів (ТГ), тобто виявляє інгібуючу дію щодо JNK. 10 15 20 25 30 Джерела інформації: 1. Vlahopoulos S., Zoumpourlis V.C JNK: a key modulator of intracellular signaling. //Biochemistry Mosc. 2004, 69 (8), p. 844-54. 2. Carboni S., Hiver Α., Szyndralewiez C, Gaillard P., Gotteland J.P., Vitte P.A. AS601245 (1,3benzothiazol-2-yl-(2-[[2-(3-pyridinyl)ethyl]amino}-4-pyrimidinyl)acetonitrile): a c-Jun NH2-terminal protein kinase inhibitor with neuroprotective properties: //J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 310, (1), p. 25-32, PMID: 14988419 3. Carboni S., Boschert U., Gaillard P., Gotteland J. P., Gillon J., Vitte P. A. AS601245, a c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) inhibitor, reduces axon/dendrite damage and cognitive deficits after global cerebral ischaemia in gerbils. //Br J Pharmacol., 2008; 153, (1) p. 157-163, doi: 10.1038/sj.bjp.0707574. 4. Cerbone, Α., Toaldo C, Pizzimenti S., Pettazzoni P., Dianzani C, Minelli R., Ciamporcero E., Roma G., Dianzani M., Canaparo R., Ferretti C, Barrera G. AS601245, an Anti-Inflammatory JNK Inhibitor, and Clofibrate Have a Synergistic Effect in Inducing Cell Responses and in Affecting the Gene Expression Profile in CaCo-2 Colon CancerCells. //PPAR Research 2012, Article ID 269751, 16 pages doi: 10.1155/2012/269751 5. Gaillard P., Jeanclaude-Etter I., Ardissone V., Arkinstall S., Cambet Y., Camps M, Chabert C, Church D., Cirillo R., and Gretener D., Design and synthesis of the first generation of novel potent, selective, and in vivo active (benzothiazol-2-yl)acetonitrile inhibitors of the c-Jun N-terminal kinase. //Med. Chem. 2005, 48, p. 4596-4607 6. Solheim A.E. Subcellular distribution of proteolytically generated valine in isolated rat hepatocytes /A.E. Solheim, P.O. Seglen /Eur J Biochem. - 1980. Vol. 107, N 2. P. 587-596. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Застосування кверцетину формули OH OH HO O OH OH O як інгібітора JNK-кіназ. 3 UA 101057 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4