Застосування 6,7-диметокси-4-n-(4-ціанофеніл)амінохіназоліну як інгібітора jnk-кіназ

Реферат: Застосування 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)амінохіназоліну формули: N N H3 C O O N N CH3 як інгібітора JNK-кіназ. UA 95387 U (12) UA 95387 U UA 95387 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до фармації та медицини, а саме до сполуки 6,7-диметокси-4-N(4-ціанофеніл)-амінохіназолін формули (І), або її фармацевтично прийнятних солей, які є корисними для інгібування JNK-кіназ. Значна кількість хвороб людини прямо або побічно пов'язана з аномальним функціонуванням кіназ. Порушення регуляції внутрішньоклітинних механізмів, до яких належать редокс-чутливі системи мітоген-активованих JNK кіназ - важлива ланка патогенезу багатьох захворювань. Отримані експериментальні докази підтверджують наявність тісного зв'язку між активацією JNK та розвитком патологічних станів, пов'язаних з інсулінорезистентністю клітин, таких як ожиріння, атеросклероз, цукровий діабет [1]. Фармакологічне втручання в JNK-кіназний каскад - перспективний метод корекції стану інсулінорезистентності, атеросклерозу, метаболічного синдрому і т.д. JNK-кінази - ферменти, що беруть участь у передачі сигналів від клітинної мембрани до ядра і апарату генної транскрипції, грають ключову роль у розвитку багатьох захворювань людини. Активація JNK спостерігається при токсичному ураженні клітин печінки, неалкогольному стеатозі, цирозі, діабеті 2-го типу, широкому спектрі онкологічних захворювань печінки та ін. JNK-кінази, або c-Jun N-кінцевих кінази - це група серин-треонінових кіназ, що являють собою клас ферментів, які каталізують перенесення фосфатної групи від АТФ на субстрати з сериновими і треоніновими залишками, і, таким чином, відповідають за регуляцію сигнальних внутрішньоклітинних механізмів. Як головні учасники внутрішньоклітинної мережі трансдукції поза- і внутрішньоклітинних сигналів, JNK-кінази є регуляторами багатьох клітинних процесів, у тому числі, процесу регулювання чутливості клітин до інсуліну. Пошук нових молекул та розробка фармацевтичних засобів, здатних діяти як інгібітори JNK, є надзвичайно актуальною проблемою, оскільки в сучасному суспільстві спостерігається значне зростання частки таких глобальних захворювань людини, як цукровий діабет 2-го типу і атеросклероз. Першим з таких інгібіторів був розроблений 1,3-бензотіазол-2-іл-(2-[[2-(3піридиніл)етил]аміно}-4-піримідиніл)ацетонітрил. Він інгібує JNK кінази та проявляє активність ІС50 150 нмоль/л проти JNK1, 220 нмоль/л проти JNK2 та 70 нмоль/л проти JNK3. При проведенні доклінічних досліджень на пацюках проти церебральної ішемії, він проявив нейропротекторну дію. AS601245 також демонструє протизапальну активність. Але недоліком AS601245 є слаба проникливість всередину клітини [2-5]. Задачею корисної моделі є розширення арсеналу засобів, які виявляють здатність інгібувати активність JNK-кіназ, які можна використовувати для профілактики та лікування патологічних станів, пов'язаних з інсулінорезистентністю клітин, а саме ожиріння, атеросклерозу, цукрового діабету 2-го типу. У науковій літературі [6-8] відомо, що похідні хіназоліну 4-N-арил заміщені хіназоліни загальної формули: (R2)n NH N (R1)m H 40 N мають здатність інгібувати тирозинкінази та мають добру проникливість всередину клітини. Проте, аналіз зазначених джерел не виявив відомостей про дослідження 4-N-арил-заміщених хіназолінів, як інгібіторів JNK-кіназ. Поставлена задача вирішується шляхом застосування 6,7-диметокси-4-N-(4ціанофеніл)амінохіназоліну формули: 1 UA 95387 U N N H3 C O N O N CH3 5 10 15 20 25 30 як інгібітора JNK-кіназ. Авторами вперше було виявлено невідомий раніше спектр фармакологічної дії 6,7диметокси-4-N[-(4-ціанофеніл)-амінохіназоліну, як похідного 4-N-арил заміщених хінозолінів, що дозволяє використовувати цю сполуку та її фармацевтично прийнятні солі як інгібітор JNK-кіназ. Одержані результати свідчать, що заявлений засіб достовірно проявляє інгібіторну дію щодо JNK. Корисна модель ілюструється такими прикладами. Приклад 1. Дослідження проводили in vitro на гепатоцитах самців щурів лінії Wistar масою 180-220 г, яких утримували на стандартному раціоні. Виділення гепатоцитів проводили за модифікованим методом Seglen [9] із печінки щурів лінії Wistar. Печінку подрібнювали, суспензію з фрагментами печінки інкубували 1-2 хв, клітини фільтрували крізь нейлоновий сітчастий фільтр із діаметром пор 100 мкм. Гепатоцити витримували на льоду впродовж всього процесу. Кінцевий осад клітин переважно містив 90 % гепатоцитів. Далі клітини інкубували в середовищі Кребса-Хенселейта впродовж 20 год. при 37 °C в атмосфері О2/СО2 (95:5). Властивості заявленої речовини досліджувалися на фоні інкубування клітин з гепатотоксином ацетамінофеном, для механізму дії якого невід'ємним є фосфорилювання й транслокація JNK, тобто активація цього сигнального шляху [10]. Середовище інкубації гепатоцитів містило ацетамінофен (АРАР) у концентрації 2,5 мМ та заявлену сполуку в концентраціях 25, 50 або 100 мкМ або тільки досліджувану речовину. В інкубаційному середовищі визначали активність аланінамінотрансферази (АЛТ) із використанням стандартних наборів реактивів фірми "Філісіт-Діагностика" (Дніпропетровськ, Україна) і фірми "Lachema" (Чехія). Вміст ТБК-реактивних продуктів визначали спектрофотометрично за допомогою реакції з тіобарбітуровою кислотою. Для визначення рівня загальної JNK використовували набір реактивів (Total JNK Pan Specific DuoSet IС ELISA (R & D Systems, Inc., USA), для визначення фосфорильованої JNK (pJNK) - набір реактивів [pThr183/Tyr185] JNK1 / 2 EIA kit (Enzo Life Sciencies). На першому етапі досліджень визначали вплив заявленої речовини на активність АЛТ, гепатоспецифічного маркеру цитолізу, у культуральному середовищі гепатоцитів, а також її дію на досліджуваний показник у присутності гепатотоксину АРАР. Отримані результати наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Вплив 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)-амінохіназоліну і ацетамінофену на активність АЛТ в інкубаційному середовищі гепатоцитів 6 (М±m, n=6, мкмоль\год.*мл у перерахунку на 1*10 клітин) Речовина Інтакт Контроль (твін) АРАР Заявлена речовина Концентрація Речовина АРАР + речовина 25 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 0,0537±0,0006 0,0535±0,0015 0,0541±0,0011 0,0896±0,011* 0,0673±0,017* 0,0589±0,009* 0,0542±0,0017 0,0539±0,0032 0,126±0,024* 2 UA 95387 U 5 * - відхилення достовірне щодо інтакту (р≤0,05) Було встановлено, що при інкубації ізольованих гепатоцитів у присутності досліджуваної речовини активність АЛТ достовірно не змінюється. Більш того, заявлена речовина надає нормалізуючого впливу щодо токсичної дії АРАР. Отримані дані також можуть бути підтверджені даними щодо забарвлення ізольованих гепатоцитів. Результати наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Вплив 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)-амінохіназоліну й ацетамінофену на кількість ізольованих гепатоцитів, забарвлених трипановим синім (М±m, n=6, у % від загальної кількості клітин) Речовина Концентрація Речовина АРАР + речовина Інтакт 97±3 Контроль 96±2 (твін) АРАР 74±8* 25 мкМ 94±7 83±7* Заявлена 50 мкМ 95±8 88±6* речовина 100 мкМ 98±2 91±8* * - відхилення достовірне щодо інтакту (р≤0,05) 10 15 Приклад 2. Зниження активності АЛТ у культуральному середовищі може свідчити про те, що досліджувана речовина гальмує токсичну дію АРАР, можливо завдяки інгібуванню сигнального шляху, пов'язаного з JNK. У той же час, зменшення активності АЛТ може бути пов'язане з безпосередньою дією досліджуваної речовини на плазматичну мембрану клітин, а саме, з її стабілізацією. Оскільки, відомо, що активація JNK (в тому числі при інкубації з АРАР) супроводжується розвитком оксидативного стресу і, у подальшому, активацією перекисного окислення ліпідів, наступним етапом досліджень було вивчення антиоксидантної активності заявленої речовини. Отримані результати наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Дослідження антиоксидантної активності 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)-амінохіназоліну щодо утворення ТБК-реактивних продуктів (М±m, n=6, нмоль/мг білка) Інтакт Концентрації заявленої речовини 25 мкМ 50 мкМ 100 мкМ 20 25 0,371±0,012 0,393±0,024 0,410±0,018 0,393±0,017 Отримані дані свідчать про те, що досліджувана речовина не виявляє антиоксидантних властивостей. Приклад 3. Визначення загального рівня JNK та рівня фосфорильованої JNK. Як видно з таблиці 4, 6,7диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)-амінохіназолін не впливає на вміст загальної JNK в клітинах печінки та зменшує зростання вмісту p-JNK, спричинене ацетамінофеном, що свідчить про інгібування JNK. 3 UA 95387 U Таблиця 4 Вплив 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)-амінохіназоліну і АРАР на рівень загального та p-JNK в ізольованих гепатоцитах щурів (М±m, n=6, нмоль/мг білка) Речовина Інтакт Контроль (твін) АРАР Заявлена речовина Загальна JNK p-JNK Загальна JNK p-JNK Загальна JNK p-JNK Загальна JNK p-JNK Загальна JNK p-JNK Концентрація Речовина АРАР + речовина 50 мкМ 286±12 93±7 283±8 89±8 294±11 154±14* 291±11 88±6 286±8 89±7 290±13 # 129±9* 284±14 # 119±7* 100 мкM * - відхилення достовірне щодо інтакту (р≤0,05), # - відхилення достовірне щодо АРАР (р≤0,05) 5 10 15 20 25 30 35 Таким чином, проведені дослідження показали, що 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)амінохіназолін дозозалежно зменшує активність АЛТ в інкубаційному середовищі гепатоцитів та зменшує вміст фосфорильованої JNK на фоні введення активатору JNK ацетамінофену, тобто виявляє інгібуючу дію щодо JNK. Джерела інформації: 1. Vlahopoulos S., Zoumpourlis V.C JNK: a key modulator of intracellular signaling. // Biochemistry Mosc. 2004, 69 (8), p. 844-54. 2. Carboni S., Hiver A., Szyndralewiez C, Gaillard P., Gotteland J.P., Vitte P.A. AS601245 (l, 3benzothiazol-2-yl-(2-[[2-(3-pyridinyl)ethyl]amino}-4-pyrimidinyl)acetonitrile): a c-Jun NH2-terminal protein kinase inhibitor with neuroprotective properties:.// J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 310, (1), p. 25-32, PMID: 14988419 3. Carboni S., Boschert U., Gaillard P., Gotteland J.P., Gillon J., Vitte P.A. AS601245, a c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) inhibitor, reduces axon/dendrite damage and cognitive deficits after global cerebral ischaemia in gerbils.// Br J Pharmacol., 2008; 153, (1) p. 157-163, doi: 10.1038/sj.bjp.0707574 4. Cerbone, A., Toaldo C, Pizzimenti S., Pettazzoni P., Dianzani C, Minelli R., Ciamporcero E., Roma G., Dianzani M., Canaparo R., Ferretti C, Barrera G. AS601245, an Anti-Inflammatory JNK Inhibitor, and Clofibrate Have a Synergistic Effect in Inducing Cell Responses and in Affecting the Gene Expression Profile in CaCo-2 Colon Cancer Cells.// PPAR Research 2012, Article ID 269751, 16 pages doi:10.1155/2012/269751 5. Gaillard P., Jeanclaude-Etter I., Ardissone V., Arkinstall S., Cambet Y., Camps M., Chabert C, Church D., Cirillo R., and Gretener D., Design and synthesis of the first generation of novel potent, selective, and in vivo active (benzothiazol-2-yl)acetonitrile inhibitors of the c-Jun N-terminal kinase.// Med. Chem. 2005, 48, p. 4596-4607 6. Barker A J. Quinazoline derivatives. EP 0566226 A1, 20.10.1993. 7. Barker A.J., Brown D.S. Quinazoline derivatives. EP 0602851 A1, 22.06.1994. 8. Barker A.J., Davies D.H. Therapeutic Preparations Containing Quinazoline Derivatives. EP 0520722 A1, 30.12.1992. 9. Solheim A.E. Subcellular distribution of proteolytically generated valine in isolated rat hepatocytes / A.E. Solheim, P.O. Seglen / Eur J Biochem. - 1980. - Vol. 107, N 2. - P. 587-596. 10. The gap junction inhibitor 2-aminoethoxy-diphenyl-borate protects against acetaminophen hepatotoxicity by inhibiting cytochrome P450 enzymes and c-jun N-terminal kinase activation / K. Du, C.D. Williams, M.R. McGill et al. // Toxicol Appl Pharmacol. - 2013-Vol. 273, N 3. - P. 484-491. 4 UA 95387 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Застосування 6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)амінохіназоліну формули: 5 N N H3 C O O N N CH3 як інгібітора JNK-кіназ. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5