Штам бактерій azotobaсter vinelandii для одержання бактерійного добрива під капусту

Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожайности овощных культур и касается получения нового штамма азотобактера для производства бактери Изобретение относится к микробиологическим средствам повышения урожайности овощных культур и касается получения нового штамма азотобактера для изготовления бактериального удобрения под капусту. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий рода Azotobacter, более эффективно повышающего урожай капусты и одновременно улучшающего ее качество. Штамм Azotobacter vinelandii ВНИИСХМ № 24 выделен из черноземной почвы. Штамм Azotobacter vinelandii депонирован и хранится в коллекции ВНИИсельскохозяйственной микробиоло24 -89 ального удобрения под капусту. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий рода Azotobacter^ более эффективно повышающего урожай капусты и одновременно улучшающего. ее качество. Штамм Azotobacter vineland іі ВНИИСХМ № 24 выделен из черноземной почвы. Штамм Azotobacter vineland і і депонирован и хранится в коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 24 и Институте микробиологии и вирусологии АН УССР под номером 56. При проведении» инокуляции капусты штамм Azotobacter vinelandii ВНИИСХМ 24 в сравнении с известным A. chroococcum К. дает прибавку в среднем на 100 ц/га (от 30-50 до 2279 ц/га) и повышает содержание аскорбиновой кислоты в листьях капусты на 81,5%. 3 табл. гни под номером 24 и коллекции Института микробиологии и вирусологии АН УССР под номером 56. Штамм идентифицирован по "Краткому определителю бактерий Берги . М.: Мир, 1980, с. 495. Кулътурально-морфологические признаки штамма Azotobacter vinelandii ВНИИСХМ 24. Azot. vinelandii ВНИИСХМ 24 культура неспороносная, аэробная, грамотрицательная, подвижная (перитрих). При выращивании на агаризованных средах Эшби (дистиллированная вода 1 л і маннит 20 г; К^НРО^ 0,2 г; MgS0 4 0,2 r; NaCl 0,2 г; K 2 S 0 4 0,1 г І СаСО, 5,0 г; агар 15 г, CD 00 00 1490887 4 pH 7,6) и Федорова (дистиллированная вода 1 л,1 маннит 20 г ; К г НР0 4 0,3 г(, СаНРО 4 '2Н 2 О 0,2 т\ MgSO 4 -7H i 0 0 , 3 ' г ; K z S04 0,2 г\ NaCl 0,5 г; 5 FeCly 6Н2О 0,05 r j CaCOs 5 г ; смесь микроэлементов 1 мл, рН 7,0) ;при 28°С культура образует влажные,блес-, тящие,слизистые беловатые колонии. На тех же средах с сахарозой вокруг fo клеток образуются капсулы. Длина клеток варьирует от 3,4 до 7„6 мкм, ширина - от 1,2 до 2,9 мкм. Клетки овальные, объем их колеблется от 12,4 до 15,9 м к м 3 . При выращивании tS на качалках на жидкой среде Эшби при 160-240 оборотах в минуту и температуре 28°С культура образует зеленый, слегка флуоресцирующий "пигмент и большое количество капсулярной слизи. 20 , . Физиолого-биохимические признаки , штамма Azotoba-cter v i n e l a n d i i ВНИИСХМ 24. Штамм в качестве источников у г лерода может использовать глюкозу, сахарозу, мальтозу, декстрин, маннит, мелассу, соли яблочной и л и монной кислот. Наряду с усвоением азота атмосферы может использовать аммонийный азот и азот мочевины. В стимуляторах роста предлагаемый штамм не нуждается. При выращивании на жидкой среде Эшби с маннитом в р е мя генерации не превышает 15-17 ч . Для получения титра 0,8-1 ,2 млрд. клеток/мл за 48 ч в жидкую питательную среду Эшби в качестве источника углеродного питания вместо манннта вносят мелассу в количестве 60 г на 1 л среды (так как содержание с а х а ра в мелассе не превышает 50%). Культура не растет на белковых средах, не разжижает желатин. Слабо пептонизирует молоко. Восстанавлив а е т нитраты до нитритов. Признаки штамма устойчивы. Штамм f не патогенен. Хранится на твердой среде Эшби при 5-7°С, пересевается 1 раз в 6 месяцев. Как видно из та'бл. 1 , штамм • Azotobacter v i n e l a n d i i ВНИКСХМ 24 обладает практически такой же скоростью размножения, как и'штамм A.chroococcum ( K., но отличается от него более высокой экономичностью фиксации атмосферного а з о т а : из расчета на 1 г потребленной с а х а розы он фиксирует в 1,8 раза больше а з о т а . В сравнении со штаммом Azotobact e r chroococcum К. штамм A . v i n e l a n dii В И С М 24 интенсивнее продуН ИХ цирует ауксины и витамины группы В и подавляет рост большего количества фитопатогенных микроорганизмов. П р и м е р 1. Получение препарата на основе штамма A z o t o b a c t e r vinelandii В И С М 24. Н ИХ Для получения бактериального удобрения штамм 24 выращивают на модифицированной среде Эшби следующего с о с т а в а : дистиллированная вода 1 л,' меласса 60 т\ К£НР04 0 , 2 ; MgSO* 0,2 г ; NaCl 0,2 г ; K 2 S 0 4 0 , 1 r;.CaC0 3 5,0 г ; агар 15,0 г , рН 7 , 6 . Среду стерилизуют при 0,75 атм в течение 30 мин. Посевной материал вносят стерильно в среду в количестве 5 10% по объему. Культуру выращивают 48 ч в колбах при скорости переме25 шивания 160-240 оборотов в минуту при 28°С. При этом титр а з о т о б а к т е ра "О,8-1 ,2 млрд. клеток/мл. Для бактеризации рассады можно 30 использовать жидкое бактериальное удобрение( культуру), а также т о р фяной препарат, который получают путем внесения стерильной 48-часовой культуры в стерильный торф из р а с ч е •$* та 300 мл культуры с титром 0 , 8 1,2 млрд.клеток/мл на 1 кг торфа. Торф стерилизуют в заводских условиях J -лучами в дозе 2,5 Мрад. После инокуляции пакеты с торфом 40 доращиваются при температуре 18-20 С в течение 10 сут. Методика проведения инокуляции штаммом A. v i n e l a n d i i В И С М 24 Н ИХ капусты. 45 Бактеризацию рассады капусты производят непосредственно перед высадкой растений в грунт методом обмакивания корней. При этом торфяной препарат после доращивания р а з 50 водится в 5 р а з . Корни рассады обмакивают в полученной суспензии, содержащей 60-70 млн.клеток а з о т о бактера в 1 мл. Можно производить бактеризацию ! рассады капусты методом полива р а с - , тений в прикорневую зону. При использовании жидкого препарата исходную культуру, содержащую 1490887 0 , 8 - 1 , 2 млрд. клеток/мл, разводят в Результаты применения для бактериза5 р а з . Под каждое растение вносят ции штамма 24 и К представлены в 3-5 мл полученной суспензии. табл. 2 . Итак, прибавка урожая капусты при П р и м е р 2. Конкретное приме5 сравнении штаммов азотобактера 24 и нение штамма Azotobacter v i n e l a n d i i К составляет в среднем 100 ц / г а . В И С М 24. Н ИХ Обработку рассады капусты произХарактеристика полученной продукводят методом обмакивания корней п е ред высадкой в почву. Прибавка уро10 ции представлена в табл. 3 . Таким образом, штамм A. v i n e l a n жая раннеспелой капусты сорта Июльd i i В И С М 24 по сравнению со штамН ИХ ская в Киевской области в результамом A. chroococcum К. повышает те бактеризации штаммом 24 состависодержание аскорбиновой кислоты в ла 227 и,/га\ позднеспелой сорта листьях капусты на 81,5%. Амогер 100 ц/га. В Донецкой области 15 прибавка урожая капусты сорта Амогер Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я от бактеризации колебались от 30 до Штамм бактерий Az otobacte r v i n e 50 ц/га по сравнению с известным штамl a n d i i В И С М № 24 для получения Н ИХ мом К. Бактеризованная штаммом № 24 бактериального удобрения под капусту. капуста созрела на 7 дней раньше. 20 Т а б л и ц а 1 Сравнительная характеристика штамма Azotobacter vinelandii ВНИИСХМ № 24 и известного - A.chroococcum К. Номер Показатели Az.chroococcum К. Э 1 Скорость размножения - определяют по методу Разумова А.С Для этого учитывают начальную концентрацию культуры при посеве на жидкую среду Эшби и конечную концентрацию культуры через 48 ч культирования. Затем рассчитывают по формуле flg2 8 ~ Az .vi ne lan— d i i В И С М 24 Н ИХ 4 16,5 17,5 ч 1,45 1 ,39 где g - время генерации, ч; t - длительность опыта,ч, Nj - количество бактерий в 1 мл в конце опыта; N^ - количество бактерий в 1 мл в начале опыта; . 2 - коэффициент геометрической прогрессии, по которой возрастает численность размножения бактерий. На основании определения времени генерации рассчитывают количество поколений в сутки: 24 ч:g= количество поколений/сутки 1490887 Продолжение табл.1 4 Аэотфиксацию - определяют в шестисуточных культурах азотобактера, выращенных на жидкой среде Эшби с сахарозой. Количество фиксированного азота учитывают по методу Кьельдаля и выражают в мг. Параллельно с этим в исходной среде при засеве!и при снятии опыта определяют содержание сахара фенол-серным методом Дюбуа и выражают в г/л среды или в мг/мл среды. По разнице между исходным и конечным содержанием сахарозы рассчиты- . вают количество потребленного культурой сахара. Отношение фиксированного азота к количеству потребленной сахарозы, выраженное в мг N на 1 г сахарозы, характеризует экономичность потребления углеводов. Количество потребленного сахара (сахарозы) при одинаковых условиях культивирования - устанавливают у шестисуточных культур по разности исходного содержанип(20 г/л) и конечного и выражают в процентах (при этом исходное количество сахара принимают за 100%)-. Концентрацию сахарозы определяют фенол-серным методом Дюбуа. Образование ауксинов - определяют методом биотестов на колеоптелях пшеницы и растениях фасоли. Колеоптели пшеницы и проростки фасоли обрабатывают раствором ауксина разной концентрации и параллельно культуральной жидкостью азотобактера при плотности культуры 50 млн/мл. Основной раствор ауксина содержит 9,3 мг ауксина в 50 мл воды. Рабочие растворы ауксина готовят по убывающей концентрации в буферном растворе. Содержание ауксина в культуральной жидкости азотобактера устанавливают методом сравнения и выражают в мг на 1 л среды. 5,4 мг/г потребленной сахарозы 91% Следы 9,8 мг/г потребленной сахарозы 84% 3,6 мг/л 10 1490887 Продолжение табл.1 Образование витамина В - опре< деляют по Одинцовой (1959) в двухсуточных культурах азотобактера, выращенных на жидкой среде Эшби, с использованием двухсуточной индикаторной культуры Debaryomyces disporus. Выражают в мкг на 1 г сухой биомассы Образование витамина В6 - определяют аналогично В ^ Способность сдерживать или подавлять рост и развитие фитопатогенных грибов - определяют методом блоков или цилиндров, помещаемых на газоны тест-культур, выращенных на сусло-агаре. Стерильные блоки фильтровальной бумаги d = 0,5 см пропитывают, а стерильные стеклянные цилиндры V • 0,2 мл заполняют трехсуточными культурами азотобактера Способ сдерживать или подавлять рост и развитие фитопатогенных бактерий - определяют аналогично методом блоков или цилиндров. Показателем подавления роста и развития фитопатогенов является образование зон просветления 2,76 мкг/г 9,36 мкг/г 3,72 мкг/г 11 ,92 мкг/г Fusarium gibbosum Fusarium avenaceum Fusarium oxysporum Fusarium sambucinum Fusarium gibbosum Agrobact e r tumefaciens Xanthomonas campestris Corynebact. michiganense Pseudotn. syringae F.rwinia carotovora Xanthomonas campestris Corynebact. michiganense Pseudomonas syringae Т а б л и ц а 2 Влияние бактеризации на урожай капусты штаммами Azotobacter vinelandii В И С М 24 и A.chrooН ИХ , coccura K.i Штаммы, использованные для бактеризации Урожай, ц/га, пример : : • і • • Контроль без бактеризации 187 | Az.chroococcum 339 A . v i n e l a n d i i ВНИИСХМ-24 ! 443 m = +15,0 ц / г а ; Р Д = 4 , 7 ; HCPQ5 - 51,7 ц/га Прибавка к контролю без б а к т е - ' ризации при использовании штамма 24 136,9 181 333 430 і 173 328 412 Г ' 195 346 463 142 138,1 137,5 Средняя прибавка 138 I I 12 490887 Т а б л и ц а 3 A.chroococ- A.vinecus К. land і і Показатель ВНИИСХМ 24 Содержание суммы Сахаров (глюкозы, фруктозы, сахарозы) в листьях бактеризованной капусты сорта Амогёр (X на глюкозу) определяют по методу Бертрана Содержание аскорбиновой кислоты в листьях бактеризованной капусты сорта Амогер (мг X) определяют по методу И.Мурри Редактор Л. Павлова 4,8 4,3 18,4 33,4 Составитель А. Кураков Техред Л.Олийнык Корректор М. Самборская Заказ II02/ДСП . Тираж 223 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г,Ужгород, ул. Гагарина,101