Спосіб отримання еквівалента строми рогівки для кератопластики

Реферат: Спосіб отримання еквівалента строми рогівки для кератопластики, за яким рогівкову оболонку, отриману з видалених очей свиней, розміщують в середовищі для культивування тканини. Проводять децелюляризацію наступним чином: обробляють 0,5 % розчином додецилсульфату натрію в умовах постійного струшування при температурі не вище 4 °C, потім оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин. Здійснюють інкубацію в присутності ферментного 0,1 % розчину папаїну (рН 6,5) протягом 2,5 годин при 30 °C, промивають в калійфосфатному 0,1 м буфері (рН 6,5) трьохкратно по 5 хвили. Оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, знову оброблюють 0,5 % розчином додецилсульфату натрію двічі протягом 3 годин, промивають в калій-фосфатному 0,1 м буфері (рН 6,5) трикратно по 5 хвилин. Знову оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, промивають в калій-фосфатному буфері (рН 6,5) п'ятикратно по 5 хвилин, центрифугують при 3000 g 15 хвилин з декантацією трикратно і переносять в середовище для зберігання - у 2 % розчин полівінілпіролідону при температурі 0 °C. UA 101707 U (12) UA 101707 U UA 101707 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме офтальмології, і може бути використана для лікування дистрофії рогівки. В багатьох випадках при тяжких клінічних формах ураження рогівки хірургічний метод лікування, а саме кератопластика, є на сьогодні єдиним ефективним методом лікування (Сох А & R Zhong. Current advances in xenotransplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int.2005, 4, 490494). За нашого часу при кератопластиці за умови патології рогівки (опіки, при виразках та запаленні у випадку глибоких дефектів при спадкових дистрофіях рогівки, епітеліальних та ендотеліальних дистрофіях після хірургічного втручання) використовують амніотичну мембрану, особливо людську нативну та ліофілізовану рогівку і т. п. (John P. Whitcher, M. Srinivasan, Madan P. Upadhyay. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization.2001. - V. 79. - P. 214-221). Треба зауважити, що застосування людської рогівки як донорського трансплантата при кератопластиці спричинює деякі труднощі, пов'язані, по-перше, з нестачею придатного матеріалу та правовими аспектами, а по-друге, з умовами, які були затверджені Європейською конференцією по банках рогівки в 1990 році, при яких не можливо її використовувати, тобто наявність ризику інфікування (гепатит, ВІЧ, венеричні захворювання тощо) та інші причини (Душин Н.В., Фролов М.А., Гончар П.А. Кератопластика в лечении заболеваний глаз (оптическая, рефракционная, лечебная, косметическая): Учеб. пособие. - М: РУДН, 2008.-168 с). Крім того, випадки негативних наслідків після проведення трансплантації людської нативної рогівки, пов'язані з приживлюванністю, особливо низькою при повторних пересадках (Thompson R.W.Jr., Price M.O., Bowers P.J., Price F.W. Long-term graft survival after penetrating keratoplasty. Ophthalmology. - 2003. - V. 110. - p. 1396-1402; Kaminsky S.L., Biowski R., Lucas J.R., Koyuncu D., grabner G. Comeal sensitivity 10 years after epikeratoplasty. J. Refract. Surg.-2002. - V. 18. - P. 731736), які можуть бути обумовлені загрозою відторгнення трансплантата за умови антигенної несумісності, спонукають до пошуку і розробки альтернативних варіантів донорської рогівки (Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularizationoftissuesandorgans. Biomaterials.2006; 27:3675-3683). Отримання модуля рогівки шляхом ліофілізації має такі ж недоліки, в першу чергу недостатня кількість людської рогівки та певна ймовірність виникнення імунної відповіді. Найбільш перспективним напрямком розробки альтернативних варіантів донорської рогівки сьогодення є створення колагенових модулів за рахунок полімеризації ателоколагену (Yuwen Liu, Lisha Gan, David J. Carlsson, Per Fagerholm, Neil Lagali, Mitchel A. Watsky, Rejcan Munger, William G. Hodge, David Priest, and May. A Simple, Cross-linked Collagen Tissue Substitute for Corneal Implantation. Grifeth Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.-2006. - V. 47. - P. 1869-1875; Пасечникова Н.В., Вит В.В., Леус Н.Ф. и др. Результаты клинико-морфологического применения имплантов на основе поперечно-сшитого коллагена в качестве аналога донорской роговицы. Офтальмол. журнал.-2011. - № 4. - С. 58-60; Pasyechnikova N., Vit V., Leus N. et al. CollagenBased Bioengineered Substitutes of Donor Corneal Allograft Implantation: Assessment and Hypotheses. MENDI Ophthalmology Journal.-2012. - V. 1, № 1. - P. 10-13). Але, висока вартість ателоколагену, а також особливості полімеризації та невирішені ще питання щодо підвищення міцності колагенового модуля, тобто за біомеханічними властивостями штучний модуль поступається перед нативною рогівкою, в значній мірі обмежують його використання (Duan X., Sheardown H. Dendrimer crosslinked collagen as a corneal tissue engineering scaffold: mechanical properties and corneal epithelial cell interaction. Biomaterials.-2006. - V. 27. - P. 4608-4617; Rafat M., Li F., Fagerholm P. et al. PEG-stabilized carbodiimide crosslinked collagen-chitosanhydrogels for corneal tissue engineering. Biomaterials.-2008. -V. 29. - P. 3960-3972). Тому, на сьогоднішній день певні досягнення ксенотрансплантації дають можливість вирішити актуальне питання трансплантології - отримання донорського матеріалу для проведення пошарової та інтраламелярної кератопластики. Враховуючи, що антигенний склад і структурно-функціональні властивості рогівки свиней найбільш близькі до людського організму, їх використання як трансплантата при кератопластиці у людини є перспективним напрямком (Griffith М, Osborne R, Munger R, et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science 1999; 286(5447):2169e72.Kruse FE, Cursiefen С Surgery of the cornea: corneal, limbal stem cell and amniotic membrane transplantation. Dev.Ophthalmol.2008;41:159-170). Зупиняючись на структурних властивостях рогівки, слід зазначити, що рогівкова оболонка складається з п'яти шарів - переднього епітелію, передньої прикордонної пластинки, строми, задньої прикордонної пластинки і заднього епітелію рогівки. Передній епітелій рогівкової оболонки являє собою багатошаровий плоский неорогіваючий епітелій. Боуменова оболонка 1 UA 101707 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 складається з колагенових фібрил діаметром 14-27 нм і довжиною 240-270 нм І типу, який є основним структурним компонентом рогівки та склери, V, VI, III і VII типів. Основний шар - це строма (90 % товщини рогівкової оболонки, приблизно 450 нм), яка складається з колагенових пластин, клітин і основної речовини. Керацити складають 2,4-5,0 % від загального об'єму строми. Стромальні пластини складаються з пучка паралельних колагенових волокон, які належать в першу чергу до колагену І типу. Стромальні пластини знаходяться в основній речовині, до складу якої входять протеоглікани. Гідрофільна частина глікозаміногліканів, в якій містяться колагенові волокна, ковалентно з'єднуючись з білками, набуває форми протеогліканів. У стромі рогівкової оболонки виявлені такі глікозаміноглікани: кератан сульфат, дерматан сульфат, хондроїтин-4-сульфат та хондроїтин-6-сульфат. Глікозаміноглікани орієнтовані перпендикулярно колагеновому волокну, а зв'язок між волокнами та протеогліканами зумовлює прозорість рогівки. Десцеметова оболонка (Pas-позитивна) складається з тонких і коротких фібрил (10 нм), які занурені в глікопротеїнову основну речовину, і до складу яких входить колаген IV типу. Слід відмітити, що трансплантати повинні по своїх імунологічних характеристиках, механічній міцності та оптичній прозорості відповідати нативній людській рогівці та забезпечувати оптимальне мікросередовище для стромальних і епітеліальних клітин, які можуть мігрувати в тканини трансплантата (Lin XC, Hui YN, Wang YS, et al. Lamellar keratoplasty with a graft of lyophilized acellular porcine corneal stroma in the rabbit. Vet Ophthalmol. 2008; 11:61-66; Zheng Wu, Yang Zhou, Naiyang Li et al. The use of phospholipase A2 to prepare acellular porcine corneal stroma as a tissue engineering scaffold. Biomaterials.-2009. - V. 30. - P. 3513-3522; S. Ponce Marquez, V. Saez Martinez, W. Mclntosh Ambrose et al. Decellularization of bovine corneas for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia.-2009. - V. 5. - P. 1839-1847; J. S. Choi, J. K. Williams, M. Greven et al. Bioengineering endothelialized neo-corneas using donorderived corneal endothelial cells and decellularized corneal stroma. Biomaterials.-2010. - V. 31. - P. 6738-6745). В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу отримання еквівалента строми рогівки для кератопластики шляхом децелюляризації (видаленням клітинних і неклітинних складових рогівки, а також ділянок колагенових молекул) рогівкової оболонки з видалених свинячих очей, за рахунок чого стає можливим отримання трансплантату еквіваленту строми рогівки з ксенотрансплантатів у достатній кількості без антигенних властивостей, який по своїх імунологічних характеристиках, механічній міцності та оптичній прозорості відповідає нативній людській рогівці та забезпечує оптимальне мікросередовище для стромальних і епітеліальних клітин, що дозволить використовувати отриманий трансплантат для проведення пошарової та інтраламелярної кератопластики хворим з дистрофією рогівки. Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання еквівалента строми рогівки для кератопластики, згідно з корисною моделлю рогівкову оболонку, отриману з видалених очей свиней, розміщують в середовищі для культивування тканини, після чого проводять її децелюляризацію наступним чином: обробляють 0,5 % розчином додецилсульфату натрію в умовах постійного струшування при температурі не вище 4 °C, потім оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, здійснюють інкубацію в присутності ферментного 0,1 % розчину папаїну (рН 6,5) протягом 2,5 годин при 30 °C, промивають в калій-фосфатному 0,1м буфері (рН 6,5) трьохкратно по 5 хвилин, оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, знову оброблюють 0,5 % розчином додецилсульфату натрію двічі протягом 3 годин, промивають в калій-фосфатному 0,1 м буфері (рН 6,5) трьохкратно по 5 хвилин, знову оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин,промивають в калійфосфатному буфері (рН 6,5) п'ятикратно по 5 хвилин, центрифугують при 3000 g 15 хвилин з декантацією трьохкратно і переносять в середовище для зберігання - у 2 % розчин полівінілпіролідону при температурі 0 °C. 2 UA 101707 U Причинно-наслідкові зв'язки Причина Обробка 0,5 % розчином додецилсульфата натрія Обробка ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) Інкубація в присутності ферментного 0,1 % розчину папаїну (рН 6,5) Використання 0,1 м калій-фосфатного буфера (рН 6,5) Використання центрифугування (3000 g, 15 хвилин) з декантацією Використання 2% розчину полівінілпіролідону 5 10 15 20 25 30 Наслідок Деструкція клітинних стінок. Солюбілізує білки. Проявляє бактерицидну активність. Деструкція клітинних стінок. Гідроліз пептидів, білків, амідів та ефірів основних амінокислот Відмивання та видалення деструктивного матеріалу. Відмивання та видалення деструктивного матеріалу. Зберігання (має абсорбційні властивості) еквівалентів строми рогівки для підвищення стабільності Спосіб виконується таким чином: Рогівкову оболонку, отриману з видалених очей свиней, розміщують у середовищі для культивування тканини (фізіологічний розчин), після чого для отримання безклітинних еквівалентів строми рогівки здійснюють її децелюляризацію, а саме: 1. Обробка 0,5 % розчином додецилсульфату натрію в умовах постійного струшування при температурі не вище 4 °C. 2. Обробка ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин. 3. Інкубація в присутності ферментного 0,1 % розчину папаїну (рН 6,5) протягом 2,5 годин при 30 °C. 4. Промивання в 0,1м калій-фосфатному буфері (рН 6,5), трьохкратно по 5 хвилин. Обробка ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин. 5. Обробка 0,5 % розчином додецилсульфату натрію, двічі протягом 3 годин. 6. Промивання в 0,1 м калій-фосфатному буфері (рН 6,5), трьохкратно по 5 хвилин. 7. Обробка ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин. 8. Промивання в 0,1м калій-фосфатному буфері (рН 6,5), п'ятикратно по 5 хвилин. На останній стадії промивання використовували центрифугування (3000 g, 15 хвилин) з декантацією трьохкратно. 9. Перенесення в середовище для зберігання - 2 % розчин полівінілпіролідону при температурі 0 °C. Перевагами розробленого способу є можливість використання ксенотрансплантантів та простота отримання еквівалентів строми рогівки. Таким чином, як видно із проведеного аналізу, кінцева мета корисної моделі забезпечується сукупністю суттєвих відмітних ознак. Запропонована обробка є простою у виконанні і дозволяє отримати еквівалент строми рогівки для кератопластики з ксенотрансплантантів в достатній кількості без антигенних властивостей, який по своїх імунологічних характеристиках, механічній міцності та оптичній прозорості відповідає нативній людській рогівці та забезпечує оптимальне мікросередовище для стромальних і епітеліальних клітин, і який можливо використовувати для проведення пошарової та інтраламелярної кератопластики для лікування хворих з дистрофією рогівки. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 Спосіб отримання еквівалента строми рогівки для кератопластики, за яким рогівкову оболонку, отриману з видалених очей свиней, розміщують в середовищі для культивування тканини, після чого проводять її децелюляризацію наступним чином: обробляють 0,5 % розчином додецилсульфату натрію в умовах постійного струшування при температурі не вище 4 °C, потім оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, здійснюють інкубацію в присутності ферментного 0,1 % розчину папаїну (рН 6,5) протягом 2,5 годин при 30 °C, промивають в калій-фосфатному 0,1м буфері (рН 6,5) трьохкратно по 5 хвилин, оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, знову оброблюють 0,5 % розчином додецилсульфату натрію двічі протягом 3 годин, промивають в калій-фосфатному 0,1 м буфері (рН 6,5) трикратно по 5 хвилин, знову оброблюють ультразвуком (CD 3800 А, 50 Вт) протягом 5 хвилин, промивають в калій-фосфатному буфері (рН 6,5) п'ятикратно по 5 хвилин, 3 UA 101707 U центрифугують при 3000 g 15 хвилин з декантацією трикратно і переносять в середовище для зберігання - у 2 % розчин полівінілпіролідону при температурі 0 °C. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4