Спосіб структурно-функціонального оцінювання стану фотосинтетичного апарату рослин

Реферат: Спосіб структурно-функціонального оцінювання стану фотосинтетичного апарату рослин включає вимірювання in vivo показників індукованої флуоресценції хлорофілу, фотографування цифровою фотокамерою листя рослин на фоні білого аркушу паперу та визначення за допомогою комп'ютерних програм вмісту хлорофілу а і b у мг/100 г вологої речовини за формулами отримують регресійні залежності: chla 1  Cor  C, chlb chlb chlaLHC chla  chlb  Cor , chlb де chla та chlb - вміст хлорофілу а та b, мг/100 г зеленої маси; С - постійна величина; Cor та chlaLHC - вміст chla корових антен реакційних центрів та світлозбиральних антен, мг/100 г зеленої маси, за коефіцієнтами яких визначають величини вмісту хлорофілу a LHC та Cor, за якими після співставлення з даними флуоресцентного аналізу проводять оцінку структурнофункціонального стану рослин. UA 103548 U (12) UA 103548 U UA 103548 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біологічної області й може бути використаний в дослідженнях з фізіології рослин, біофізики та біохімії, у сільськогосподарській практиці та інших сферах науково-практичної діяльності, що потребують кількісного та якісного визначення стану фотосинтетичного апарату рослин. Відомо спосіб визначення активності фотосинтетичного апарату рослин [RU 2098948 Способ определения активности фотосинтетического аппарата растений], що включає відбір проб, підготовку проб шляхом приведення фотосинтетичного апарату в активний стан, виділення хлоропластів з рослинних тканин, суспендування їх, вимірювання показників, що відображають фізіологічний стан хлоропластів, і подальше визначення за цими показниками активності фотосинтетичного апарату рослин, при цьому проби відбирають без порушення цілісності рослин, підготовку проб здійснюють безпосередньо після виділення рослин з ґрунту шляхом розташування їх в темновій камері в умовах, що забезпечують збереження тургору, після виділення хлоропластів визначають вміст їх в зразках по оптичній щільності суспензії, а як показники, що відображають фізіологічний стан хлоропластів, вимірюють інтенсивність змінної і сповільненої флуоресценції в суспензіях, попередньо доведених до однакового числа хлоропластів в них. Такий спосіб характеризується точністю отримання показників, що відображають дійсний стан фотосинтетичного апарату рослин. Недоліком є те, що спосіб не дає уяви про склад пігмент-білкових комплексів фотосистем, є достатньо трудомістким і довготривалим у виконанні та потребує спеціального технічного оснащення. Відомо спосіб дослідження стану фотосинтетичного апарату, що дозволяє визначити склад пігмент-білкових комплексів фотосистем, а саме вміст і співвідношення хлорофілу в пігментбілкових комплексах реакційних центрів і світлозбиральних комплексах [Фотосинтез: Методические рекомендации к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / Авт.- сост. Л.В.Кахнович. - Мн.: БГУ, 2003. - 88 с.]. Для визначення вмісту хлорофілу в пігмент-білкових комплексах використовують дані, що отримуються спектрофотометричним аналізом хімічних екстрактів, вмісту хлорофілу а і b в листі рослин із розрахунку на одиницю маси і одиницю площі листа, а також дані про вміст хлорофілу в суспензії хлоропластів і в розрахунку на одиницю маси хлоропластів. На підставі цих даних розрахунковим шляхом визначають вміст хлорофілу а в пігмент-білкових комплексах реакційних центрів і світлозбиральних комплексах, вміст хлорофілу b і а + b в світлозбиральних комплексах, а також відношення хлорофіл світлозбиральних систем / хлорофіл реакційних центрів. При цьому виходять з того, що в реакційних центрах (РЦ) фотосистеми І і фотосистеми II листя міститься тільки хлорофіл а, а в світлозбиральних комплексах (LHC) співвідношення хлорофілу а і хлорофілу b дорівнює 1,2: 1, хлорофіл b знаходиться в світлозбиральних комплексах. Виходячи з цього, визначають кількість хлорофілу а в світлозбиральних комплексах (LHC). Спосіб є достатньо інформативним. Недоліком є те, що він потребує спеціального обладнання для хімічного аналізу та виходить із припущення, що в світлозбиральних комплексах (LHC) відношення хлорофілу а і хлорофілу b дорівнює 1,2: 1, яке в дійсності варіює для рослин різних систематичних груп та умов вирощування. Найближчим аналогом вибрано спосіб визначення пігментів хлорофілу та каротиноїдів [UA Пат. №71632, Спосіб визначення пігментів хлорофілу та каротиноїдів], який включає фотографування цифровою фотокамерою листя рослин на фоні білого аркуша паперу, визначення інтенсивностічервоного і синього кольору зображення у пікселях та показників поглинання (абсорбції) зеленим листям в цих областях спектру за допомогою комп'ютерних програм визначають вмісту хлорофілу а і b у мг/100 г вологої речовини за встановленими залежностями концентрації пігментів від абсорбційних показників. За величинами вмісту хлорофілу а та хлорофілу b оцінюється стан рослини, за яким прогнозують врожайність. Спосіб легкий та швидкий у виконанні, не потребує спеціальної апаратури, дозволяє отримати дані вмісту хлорофілу а та хлорофілу b in vivo в експрес режимі. Недоліком є те, що цим способом не передбачається аналіз складу пігмент-білкових комплексів фотосистем, за якими ми можемо спостерігати та оцінювати стан фотосинтетичного апарату рослини та приймати відповідні управлінські рішення. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу структурнофункціонального оцінювання стану фотосинтетичного апарату рослин за рахунок використання 1 UA 103548 U 5 10 15 20 25 математичного апарату, що дає можливість досягти спрощення методу дослідження, підвищити об'єктивність оцінки стану рослин при експресності та зниженні собівартості. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі структурно-функціонального оцінювання стану фотосинтетичного апарату рослин, який включає вимірювання in vivo показників індукованої флуоресценції хлорофілу, фотографування цифровою фотокамерою листя рослин на фоні білого аркушу паперу та визначення за допомогою комп'ютерних програм вмісту хлорофілу а і b у мг/100 г вологої речовини за формулами, в якому згідно з корисною моделлю отримують регресійні залежності: chla 1  Cor  C , (1) chlb chlb chlaLHC chla  chlb  Cor , (2) chlb де chla та chlb - вміст хлорофілу а та b, мг/100г зеленої маси; С - постійна величина; Cor та chlaLHC - вміст chla корових антен реакційних центрів та світлозбиральних антен, мг/100 г зеленої маси, за коефіцієнтами яких визначають величини вмісту хлорофілу a LHC та Cor, за якими після співставлення з даними флуоресцентного аналізу проводять оцінку структурно-функціонального стану рослин. Довгострокові досліди дали можливість підтвердити дійсність нових розрахункових підходів. Спосіб структурно-функціонального оцінювання стану фотосинтетичного апарату рослин здійснюється наступним чином. Одночасно робиться цифрове зображення зеленого листка рослини та вимірюються ІФХ - дані in vivo. Визначається вміст пігментів (chla та chlb) при використанні RGB-гістограмного розкладання цифрового зображення зеленого листка програмними фоторедакторами. Фотографія листка рослини робиться цифровою камерою на білому фоні, що використовується як еталон. Відстань до об'єкту - від 30 см до 40 см. Режим макро. Час експозиції, чутливість і баланс білого фіксовані. Розрахунок вмісту пігментів проводиться згідно з відомим способом за формулами: chla  10,8 2  Ar  3,5 4    Ab  e chlb  66,70 e 30 35 40 392 ,9 3 2 , (3) Ar Ab 2 , (4) де chla та chlb - вміст хлорофілу а та хлорофілу b, мг/100 г зеленої маси; Аr (Аb) - абсорбція в червоній (синій) частині спектру, що розраховується як різниця між інтенсивністю червоного (синього) кольору в пікселях еталона і зеленого листка. Структурна оцінка фотосинтетичного апарату рослин проводиться розрахунком вмісту і співвідношення основних структурних одиниць фотосистем - реакційних центрів (Cor, коровий хлорофіл) і світлозбиральних антен (LHC) при припущенні, що для даних умов вирощування рослини виконуються залежності: chlaLHC/chlb=C, (5) chlaLHC=chla – Cor, (6) де chla та chlb - вміст хлорофілу а та b, мг/100 г зеленої маси; С - постійна величина; Cor та chlaLHC - вміст chla корових антен реакційних центрів та світлозбиральних антен, мг/100 г зеленої маси. З аналізу серії зображень будуються регресійні залежності chla від chlb (2) та із коефіцієнтів регресії розраховуються chlaCor та chlaLHC: 1 (1) та chla від chlb chlb chla 1  Cor  C , (1) chlb chlb chlaLHC chla  chlb  Cor , (2) chlb 45 50 де chla та chlb - вміст хлорофілу а та b, мг/100г зеленої маси; Cor та chlaLHC - вміст chla корових антен реакційних центрів та світлозбиральних антен, мг/100 г зеленої маси; С - постійна величина. На основі отриманих даних оцінюється співвідношення вмісту структурних елементів фотосистем, що є чутливим до стресу показником, та визначається направленість його змін специфічно до стану умов вирощування рослин. Одночасне застосування методу ІФХ дозволяє 2 UA 103548 U 5 10 15 оцінити функціональний стан процесів фотосинтезу, зокрема електронного транспорту, ефективності поглинання сонячного світла, кисневиділяючого комплексу тощо. Застосування способу дає можливість прискорити отримання даних структурнофізіологічного стану фотосинтетичного апарату рослин in vivo та з врахуванням індивідуальних особливостей різних систематичних груп. Приклад застосування способу. Спосіб використано, зокрема, при дослідженнях Fe, Mn дефіцитного хлорозу кукурудзи, що провокується в умовах досліду внесенням в ґрунт N90P60K40 + СаСО3 20 г/кг ґрунту. Вміст Fe та Μn в листі рослин фази 4-5 листків за таких умов знижується відповідно на 37 % та 12 % (відносно варіанту N90P60K40 за фонову карбонатність). Пігментний аналіз показує, що для хлоротичного листя характерно зниження загального вмісту хлорофілу майже в чотири рази та структурні зміни фотосинтетичного апарату, зокрема пригнічення синтезу хлорофілу реакційних центрів (Cor) відносно світлозбиральних антен (LHC) зі збільшенням відношення LHC/Cor майже в 6 разів (з 0,8 в контролі до 5,1). Склад фотосинтетичного апарату кукурудзи (по закінченні двох тижнів з моменту проведення позакореневої обробки мікродобривами рослин фази 4-5 листків) представлено у міліграмах на 100 г зеленої маси в табл. Таблиця Мікродобриво Без обробки Основне добриво N90P60K40 СаСО3+N90P60K40 N90P60K40 СаСО3+N90P60K40 N90P60K40 СаСО3+N90P60K40 Гумат амонію у фазу 4-5 листків "Реаком" у фазу 4-5 листків НІР0,5 20 25 30 35 40 45 50 chla 92,53 29,06 137,20 67,44 145,78 128,97 41,5 chlb 28,89 7,10 36,44 22,22 82,45 45,30 22,1 Cor 68,49 5,92 31,35 29,64 69,19 75,27 25,0 LHC 52,93 30,08 142,30 59,59 127,05 96,92 60,4 LHC/Cor 0,8 5,1 4,5 2,0 1,8 1,3 1,1 Такі зміни пояснюються тим, що нестача заліза порушує синтез білка і хлорофілу в рослинах, а дефіцит марганцю, який входить до складу кисневиділяючого комплексу реакційного центру фотосистеми II, знижує вміст Соr-хлорофілу. Застосування позакореневого підживлення мікроелементними препаратами ліквідує прояви хлоротичності. Вплив мікродобрив на стан фотосинтетичного апарату кукурудзи по закінченні двох тижнів з моменту проведення позакореневої обробки мікродобривами рослин фази 4-5 листків проілюстровано на графічному зображенні та в таблиці. Отримані результати вказують на те, що компенсаторна дія мікроелементного підживлення спрямована на збільшення загального вмісту хлорофілу і вирівнювання співвідношення між вмістом LHC- та Соr-структур. За аналізом методом ІФХ при позакореневому застосуванні мікродобрив спостерігається зменшення часу досягнення показника Fp (флуоресценції хлорофілу при закритих реакційних центрах фотосистеми II) з 213 мс до 174 мс. Це є результатом активізації азотного синтезу, як альтернативного споживача енергії кванту при фотосинтезі, за рахунок ліквідації дефіциту заліза. Спостерігається також зниження показника Fo (флуоресценції при відкритих реакційних центрах) на одиницю вмісту chla з 29 в контролі до 12 та 7 (у відносних одиницях на 100 г зеленої маси) при застосуванні позакореневого підживлення мікроелементними препаратами. Це свідчить про зменшення втрат енергії кванту за рахунок оптимізації роботи кисневиділяючого комплексу при компенсації марганцевого дефіциту. Тобто, позакореневе підживлення відновлює кількісні та якісні характеристики функціонування фотосинтетичного апарату. Таким чином, Fe-, Mn-дефіцит кукурудзи має специфічні візуальні прояви та структурнофункціональні зміни фотосинтетичного апарату, що визначаються in vivo в експрес-режимі. Своєчасне застосування позакореневого підживлення мікродобривами ліквідує прояви дефіциту та інтенсифікує фотосинтетичні процеси. Запропонований спосіб може застосовуватися як у прикладних, так і у фундаментальних дослідженнях. Переваги способу: 1. Простий у виконанні. 2. Не потребує спеціальної апаратури і обладнання. 3. Дозволяє економити на хімічному устаткуванні та реактивах. 4. Спосіб працює in vivo в експрес-режимі. 5. Дозволяє проводити серійні аналізи великої ємкості у стислі строки. 3 UA 103548 U 6. Можливе використання для експрес-діагностування стану рослин в сільськогосподарській практиці для своєчасного врегулювання живлення культур і умов їх вирощування. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб структурно-функціонального оцінювання стану фотосинтетичного апарату рослин, який включає вимірювання in vivo показників індукованої флуоресценції хлорофілу, фотографування цифровою фотокамерою листя рослин на фоні білого аркушу паперу та визначення за допомогою комп'ютерних програм вмісту хлорофілу а і b у мг/100 г вологої речовини за формулами, який відрізняється тим, що отримують регресійні залежності: chla 1  Cor  C, (1) chlb chlb chlaLHC chla  chlb  Cor , (2) chlb де chla та chlb - вміст хлорофілу а та b, мг/100 г зеленої маси; 15 С - постійна величина; Cor та chlaLHC - вміст chla корових антен реакційних центрів та світлозбиральних антен, мг/100 г зеленої маси, за коефіцієнтами яких визначають величини вмісту хлорофілу a LHC та Cor, за якими після співставлення з даними флуоресцентного аналізу проводять оцінку структурнофункціонального стану рослин. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4