Штам бактерій rhodococcus erythropolis ek-1 як продуцент поверхнево-активних речовин

Штам бактерій Rhodococcus erythropolis EK-1 як продуцент поверхнево-активних речовин, що задепонований в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України під реєстраційним номером 1MB Ас-5017. Корисна модель відноситься до біотехнології і мікробіології та призначений для отримання поверхнево-активних речовин за допомогою нафтоокислювальних бактерій, які можуть бути використані для очистки довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також для розробки біоемульгаторів для парфюмерно-косметичної промисловості. Відомий штам Bacillus sp. №205, який є деструктором вуглеводнів, поверхнево-активних речовин і ксенобіотиків [Пат. №48901 UA, МПК C21N1/26. Евритермальний штам мікроорганізму Bacillus sp. №205 - деструктор вуглеводнів, поверхнево-активних речовин і ксенобіотиків та їх сполук /Астрова Н.Г. №2002031998; Заявл. 12.03.2002; Опубл. 15.08.2002, Бюл. №8.]. Також відомо препарати для біологічного очищення ґрунту і води від забруднень нафтою і нафтопродуктами: - "Родойл", до його складу входить штучно створена композиція природних вуглеводеньокислювальних мікроорганізмів [Gordonia rubropertinctus 1MB В-7012, Rhodococcus erythropolis 1MB B7012, Acinetobacter calcoaceticus 1MB B-7013] [Пат. №34894 UA, МПК C02F3/34. Препарат "Родойл" для біологічного очищення ґрунту і води від забруднень нафтою та нафтопродуктами / Дульгеров О.М., Ногіна Т.М., Підгорський B.C., Думанська Т.У., Гавриленко М.М. - №99074077; Заявл. 15.07.1999; Опубл. 15.08.2003, Бюл. №8.]; забруднення нафтопродуктами [Пат. №26495 UA, МПК C02F3/34]. Консорціум мікроорганізмів "Devouroil" [Rhodococcus sp., Rhodococcus man's, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Candida sp.], що використовується для очищення ґрунтових та солонувато водних екосистем від забруднення нафтопродукнафтопродуктами / Бозрєнков І.А., Мільохіна Є.І., Беляев С.С, Іванов М.В. №93007798; Заявл.28.10.1993; Опубл.11.10.1999, Бюл. №6.]; - Мікробний препарат для очищення води і ґрунтів від нафтових забруднень [Pseudomonas stutzeri - 367-1, Rhodococcus sp - 367-2, Rhodococcus marts - 367-5, Rhodococcus erythropolis - 367-6 і Yerrowia або Candida - 367-3] [Пат. №22690 UA, МПК C02N1/20. Мікробний препарат для очищення води і ґрунтів від нафтових забруднень / Болоховський В.В., Борзенков І.А., Поспелов М.Є. та ін. - №94032986; Заявл.22.03.1994; Опубл.30.06.1998, Бюл. №3.]. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є штам Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК C21N1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І. №95041549; Заявл.05.04.95; Опубл.25.12.96, Бюл. №4.], який є продуцентом позаклітинних поверхнево-активних речовин (ПАР) (рамноліпідів) і біополімеру. В основу корисної моделі поставлено задачу одержання поверхнево-активних речовин з використанням невідомого раніше штаму бактерій Rhodococcus erythropolis EK-1, який відрізняється від вище згаданих тим, що здатний рости на прос Консорціум мікроорганізмів "Devouroil" [Rhodococcus sp., Rhodococcus marts, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Candida sp.], що використовується для очищення ґрунтових та солонувато водних екосистем від забруднення 00 CM CO о> 10327 тому мінеральному середовищі з низькім вмістом солей (Зг/л) з використанням як гідрофільних (глюкоза, етанол) так і гідрофобних (гексадекан, рідкі парафіни) джерел вуглецю, не потребує внесення цитрату натрію як попередника синтезу ПАР, не потребує додавання факторів росту та мікроелементів Штам Rhodococcus erythropohs EK-1 виділено із забруднених нафтою зразків ґрунту Штам депоновано в Українській колекції мікроорганізмів (Інститут мікробіологи і вірусологи ПАН України їм Д К Заболотного) під номером 1MB Ас-5017 Штам Rhodococcus erythropohs EK-1 характеризується наступними культу -ральноморфолопчними і фізюлого-бюхімічними ознаками Культурально-морфолопчні ознаки На 24год росту на м'ясо-пептонному агарі (МЛА) клітини мають вигляд нерухомих довгих паличок (3-8мкм), рідко зустрічаються палички довжиною 2-Змкм Палички рівні та зігнуті Іноді зустрічаються ланцюжки, що складаються з 3-6 коків Переважно зустрічаються ланцюжки, що містять палички (2-5шт) На 24год росту на сусло-агарі (СА) клітини мають вигляд нерухомих, коротких паличок (2Змкм), більшість з яких з'єднані попарно, та коків, які утворюють рівні та зігнуті ланцюжки На 24год росту на глюкозо-картопляному агаризованому агарі (ГКА) клітини мають вигляд нерухомих, коротких паличок, довжиною 2-Змкм, рідко зустрічаються довгі (5-7мкм) Палички рівні та зігнуті Кокові форми не виявлені При рості на агаризованих середовищах штам Rhodococcus erythropohs EK-1 на 24год утворює складчасті (шорохуваті) колонії блідо-кремового (МПА) або блідо-оранжевого забарвлення (СА та ГКА) При вирощуванні штаму Rhodococcus erythropohs EK-1 на рідкому мінеральному поживному середовищі з гідрофільними субстратами (етанол, глюкоза) утворюється однорідна гомогенна суспензія клітин На гідрофобних субстратах (гексадекан) залежно від умов культивування (масообмін, тривалість культивування, склад поживного середовища) може спостерігатись агрегація клітин у формі кульок різної форми та кольору (від кремового та рожевого до оранжевого), які знаходяться на поверхні середовища Залежно від умов культивування відбувається зміна забарвлення культуральної рідини від молочно-білого до темнокоричневого кольору Фізюлого-бюхімічні ознаки Як джерело вуглецю та енергії штам використовує глюкозу, сахарозу, фруктозу, маніт, оцтовокислий натрій, етанол, гексадекан, рідкі парафіни, керосин, а також здатний засвоювати нафту, цитрат натрію, бензин Як джерело азоту штам використовує амонійний та нітратний азот Не потребує факторів росту Строгий аероб Росте в діапазоні температур 10-34°С Оптимум для росту - 30°С Росте в діапазоні рН6,0-8,5 Крохмаль не пдролізує, желатину не розріджує, сірководень не утворює, росте на середовищі з 3-5% хлористого натрію Умови зберігання Штам зберігається при температурі +4°С на глюкозо-картопляному або м'ясопептонному агарі Пересіви проводять через З МІСЯЦІ Склад середовища для отримання посівного матеріалу і біосинтезу ПАР, (мас %) NaNO 3 -1,3 NaCI-1,0 Na2HPO4-0,6 КН2РО4-0,14 MgSO 4 x7H 2 O-0,1 FeSO4x7H2O-0,001 Вода дистильована - до 1л Як інокулят використовували культуру з експоненційної фази росту, вирощену на мінеральному середовищі вказаного складу з 0,5% етанолу або 0,3% гексадекану Культивування Rhodococcus erythropohs EK-1 для отримання поверхнево-активних речовин здійснювали на качалці (220об/хв ), коефіцієнт масопереносу 0,14г О2/л год, температура 25°С, рН середовища 6,8-7,0, тривалість культивування 168год Джерело вуглецю (етанол або гексадекан) - 2,0% (за об ємом) КІЛЬКІСТЬ ПОСІВНОГО матеріалу 5% (за об'ємом) посівного середовища Показники, за якими визначали синтез ПАР - Поверхневий натяг ( s мН/м) супернатанту культуральної рідини, який вимірювали за допомогою платинової або скляної пластинки за методом Вільгельмі - Вміст загальних ЛІПІДІВ (Г/Л) у культуральній рідині, який визначали ваговим методом після екстракції сумішшю Фолча (хлороформ - метанол 21) - Умовна концентрація ПАР (ПАР), яку визначали для експрес-оцінки КІЛЬКІСНОГО вмісту ПАР у культуральній рідині Цей показник визначається як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності s , від значення розведень Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях - Емульгувальна активність (Е 24 ), яку визначали через 24год як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини у пробірці і виражали у процентах Як субстрати для емульгування використовували соняшникову або вазелінову олію Емульгувальну активність визначали для нативної куль-туральної рідини і культуральної рідини, розведеної дистильованою водою у 10 і 50 раз - Якісний склад ЛІПІДІВ визначали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках "Silufol" ("Kavalier", Чехія) Аналіз проводили за використанням наступних систем розчинників неполярна система гексан - діетиловий ефір (2 1), полярна система хлороформ - метанол - вода (85 15 1) Ідентифікацію ЛІПІДІВ здійснювали шляхом зафарбовування пластинок спиртовим розчином фосфорномолібденової кислоти и парами йода (фосфоліпіди, загальні ЛІПІДИ), розчином нінпдрину (пептидоліпіди), анісовим альдегідом і антроновим реактивом (ГЛІКОЛІПІДИ) Приклад 1 10327 Штам Rhodococcus erythropolis EK-1 культивуШтам Rhodococcus erythropolis ЕК-1 культивували на мінеральному поживному середовищі вивали на мінеральному поживному середовищі вищевказаного складу Як джерело вуглецю та енерщевказаного складу Як джерело вуглецю і енергії гії використовували етанол (2,0% за об'ємом) використовували гексадекан (2,0% за об'ємом) Супернатант культуральної рідини характериПоказники синтезу поверхнево-активних речозувався наступними показниками вин Величина поверхневого натягу ( ^ 43,2Величина поверхневого натягу ( ^ 29,445,5мН/м, умовна концентрація ПАР -3,0-3,5, КІЛЬ29,8мН/м, умовна концентрація ПАР -6,0-6,5, КІЛЬКІСТЬ синтезованих ПАР-1,0-1,2г/л, індекс емульгуКІСТЬ синтезованих ПАР-8,0-8,5г/л, індекс емульгування (Е24) розведеної у 50 раз культуральної рівання (Е24) розведеної у 50 раз культуральної рідини становить 80-85% У складі ЛІПІДІВ, дини складає 46-50% У складі ЛІПІДІВ, синтезованих Rhodococcus erythropolis ЕК-1 на синтезованих Rhodococcus erythropolis ЕК-1 на етанолі, виявлено ГЛІКОЛІПІДИ (трегалозомоно- і гексадекані, виявлені ГЛІКО-ЛІПІДИ (трегалозомоно-1 трегалозодикоріноміколати), та загальні ЛІПІДИ трегалозодикоріноміколати), фосфоліпщи (фосфа(цетиловий спирт, пальмітинова кислота, метилтидил-глщерин, фасфатидилетаноламін, дифосовий ефір н-пентадеканової кислоти, тригліцерид, фатидилгліцерин), пептидоліпщи та загальні ЛІПІДИ (цетиловий спирт, пальмітинова кислота, метилМІКОЛОВІ КИСЛОТИ) овий ефір н-пентадеканової кислоти, тригліцерид, Нами вперше встановлена можливість синтеМІКОЛОВІ КИСЛОТИ) зувати поверхнево-активні речовини представниками роду Rhodococcus на етанолі, тому як в науУ таблиці наведено основні показники синтезу ковій, науково-технічній та патентній літературі ПАР штамами Rhodococcus erythropolis ЕК-1 та такі дані відсутні Pseudomonas sp PS-17 (прототип) Приклад 2 № Загальний вміст солей у середовищі, г/л ПАР Дана корисна модель 2 Прототип 1 s ПАР, Вихід ВІД субстрату, % г/л 3 29,4 8,5 71 12 29,5 9,5 48 ХІМІЧНИЙ склад ЛІПІДІВ ГЛІКОЛІПІДИ, загальні ЛІПІДИ, фос фоліпіди, пептидоліпщи, Рамноліпіди - як джерело вуглецю використовували гліцерин У порівнянні з прототипом штам бактерій Rhodococcus erythropolis ЕК-1 має такі переваги - здатність синтезувати поверхнево-активні речовини на простому мінеральному середовищі з низьким вмістом солей - Зг/л (для інших штамів продуцентів ПАР- до 12г/л), не потребують додат Комп'ютерна верстка М Мацело кового внесення у середовище мікроелементів та дріжджового автолізату, не потребує внесення у середовище попередників синтезу (цитрат натрію), характеризуються вищим виходом ПАР від субстрату Підписне Тираж 26 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького 45 м Київ МСП 03680, Україна ДП'Український інститут промислової власності вул Глазунова 1,м К и ї в - 4 2 01601