Штам m. avium subspecies paratuberculosis “деметра”

Реферат: Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" виділений з мезентеріальних лімфатичних вузлів корови для виготовлення біологічних препаратів (антигену, алергену, імуногенного препарату) при проведенні серологічної та алергічної діагностики паратуберкульозу, який депонований в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів за номером 610. Рід Mycobacterium, вид Mycobacterium avium, підвид Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. UA 103894 U (12) UA 103894 U UA 103894 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології та біотехнології, а саме для одержання активних та специфічних препаратів для серологічної та алергічної діагностики паратуберкульозу жуйних тварин. Існують штами M.paratuberculosis 316F та Mycobacterium avium D9, з яких виготовляють антигени для реакції зв'язування комплементу (РЗК) (ОІЕ Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. 2014. - (ch. 2.2.6, Paratuberculosis)). Штам М. avium ssp. paratuberculosis 19698 використовують для виготовлення ППД (йоніну) (Production of a Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis purified protein derivative (PPD) and evaluation of potency in guinea pigs E.M. Steadham, B.M. Martin and С.О. Thoen Biologicals (2002) 30, 93-95). Виготовлені препарати з цих штамів мають високу активність та специфічність. Однак, використання даних штамів в біологічній промисловості неможливе через їх відсутність в Україні. До того ж в Україні взагалі відсутній будь-який штам для виготовлення діагностичних препаратів. В Росії існує виробничий штам, з якого виготовляють комерційний паратуберкульозний антиген для РЗК (ТУ 46-12-211-85 "Антиген паратуберкулезный для РСК"). Одержаний з нього антиген має невисоку активність та специфічність. В основу корисної моделі поставлено задачу одержати місцевий штам шляхом виділення його з мезентеріальних лімфатичних вузлів корови з метою виготовлення із нього антигену і алергену (йоніну) при проведенні серологічної та алергічної діагностики паратуберкульозу. Запропонований штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" був ізольований з мезентеріальних лімфатичних вузлів корови на яєчному середовищі з фактором росту. Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" депонований в Державному науковоконтрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів за номером 610. Рід Mycobacterium, вид Mycobacterium avium, підвид Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis та зберігається у колекції штамів мікроорганізмів лабораторії вивчення туберкульозу ННЦ "ІЕКВМ". Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" є збудником паратуберкульозу і має наступні властивості: Культурально-морфологічні та біохімічні властивості У первинних генераціях, у мазках, пофарбованих за методом Ціль-Нільсена спостерігають дрібні кислото-спиртостійкі палички, коки, з характерним для паратуберкульозу розташуванням скупченнями. У препаратах зі субкультур спостерігають більш довгі кислотно-спиртостійкі палички з зернами на полюсах. Штам росте в R-формі, колонії дрібні, непігментовані, іноді з світло-сірим або світло-кремовим відтінком, в залежності від поживного середовища. Для росту на щільних яєчних середовищах потребує фактора росту. Для культивування на рідкому синтетичному середовищі необхідна попередня адаптація. Швидкість росту субкультур штаму на яєчному середовищі 25-30 діб, на середовищі Павловського - 20-30 діб. Оптимальна температура культивування (37,5±0,5)° С Штам не росте на середовищі з вмістом 5 % NaCl, гідролізує твин-80 за 10 діб, слабо відновлює телурит калію на 21 добу, має негативні каталазну та нікотинамідазну реакції та слабо-позитивні піразинамідазну і карбамідазну реакції. Протеїногенні властивості Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" забезпечує високий вихід загального протеїну з культурального фільтрату (табл. 1). Біологічні властивості Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" патогенний для кроликів 1-місячного 3 віку. При двократному зараженні у дозі 2 мг/см викликає характерні для паратуберкульозу патологоанатомічні ураження та загибель. Імуногенні властивості Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" при парентеральному введенні викликає виробітку специфічних антитіл та гіперчутливість уповільненого типу. Антигенні властивості Взаємодіє зі специфічними антитілами у серологічних реакціях. Підтримання штаму проводять шляхом пасажування через організм кролів з подальшою реізоляцією на живильних середовищах з фактором росту. Штам вільний від сторонньої бактеріальної та грибкової мікрофлори. Основні умови зберігання - штам культивують та зберігають на яєчних середовищах зі стимулятором росту або середовищі Павловського за температури (37,5±0,5)°С з інтервалом пересіву 2,5-3 місяці. Для виготовлення антигену або алергену штам культивують на синтетичному середовищі для виготовлення діагностичних препаратів з M. avium subspecies M. 1 UA 103894 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 paratuberculosis (Патент UA № 95598 U МПК C12N 1/00(2014.01)) або середовищі ВатсонаРейда. Приклад 1. Визначали порівняльний вихід бактеріальної маси і загального білка з культурального фільтрату. Для цього на рідкому синтетичному середовищі культивували запропонований штам Mycobacterium avium sp. paratuberculosis "Деметра" і епізоотичні культури збудників паратуберкульозу № 5809 та № 6651 впродовж 10 тижнів, інактивували автоклавуванням, бактеріальну масу відділяли фільтруванням, а білок культурального фільтрату осаджували 40 % трихлороцтовою кислотою і вимірювали їх вагу (таблиця 1). Як видно з результатів таблиці 1, ні всі культури збудника паратуберкульозу мають високі продуктивні властивості. Накопичення бактеріальної маси і білка в культуральному фільтраті штамом, що заявляється, у порівнянні з епізоотичними культурами, відбувалося набагато інтенсивніше. Так вага віджатої бактеріальної маси штаму Mycobacterium avium sp. paratuberculosis "Деметра" складала 25,0±1,6 г/л, що в 1,36 разу більше, порівняно з її кількістю у культури № 6651 (18,34±0,76 г/л) і в 8,6 разу більше, ніж у культури № 5809 (2,9±0,32). Вихід культурального протеїну штаму Mycobacterium avium sp. paratuberculosis "Деметра" складав 7,85±0,29 г/л, що в 1,67 разу більше, ніж у культури № 6651 (4,7±0,81) і в 10,75 разу більше, в порівнянні з культурою №5809 (0,73±0,64). Отже, штам, що заявляється, дозволяє отримати більший вихід цільового продукту (протеїну з культурального фільтрату і бактеріальної маси). Приклад 2. Запропонований штам використовували для виготовлення антигену для реакції зв'язування комплементу (РЗК). Для цього, штам Mycobacterium avium sp. paratuberculosis "Деметра" вирощували на синтетичному середовищі впродовж 10 тижнів, інактивували, бактеріальну масу відділяли фільтруванням, а з культурального фільтрату виготовляли антиген. Визначали активність та специфічність антигену в порівнянні з комерційним паратуберкульозним антигеном (СібНІВІ) (таблиця 2) з гомо/гетерологічними сироватками. За даними таблиці 2 при порівняльному визначенні специфічності антигенів (у робочих титрах) з гомологічними і гетерологічними сироватками крові, встановлено, що тільки антиген, виготовлений із запропонованого штаму, був специфічним, тобто виявляв антитіла в сироватках МАРнфікованих та імунізованих тварин і не реагував з сироватками проти гетерологічних мікобактеріальних антигенів і інших видів бактеріальних і вірусних збудників (сальмонельозу, бруцельозу та лейкозу). Комерційний антиген давав перехресні реакції з сироватками хворої на туберкульоз худоби, а також з кролячою сироваткою проти M.scrofulaceum та з сироваткою імунізованої M.intracellulare BPX. Приклад 3. Запропонований штам використовували як імуногенний препарат для одержання контрольної позитивної сироватки крові. Для цього тварин-продуцентів імунізували запропонованим штамом на вазеліновому маслі. Гіперімунізацію проводили 3-разовим 3 підшкірним введенням імуногенного препарату з інтервалом 7 діб в дозах 20, 30, 30 мг/см . Визначали титр антитіл в отриманої сироватки в порівнянні з комерційною сироваткою (Росія) в РЗК (таблиця 3). У порівняльному аналізі активності паратуберкульозних сироваток (таблиця 3) встановлено, що в сироватці, яка була отримана з використанням штаму М. avium sp. paratuberculosis "Деметра", максимальний титр антитіл був 1:400, тоді як у комерційній сироватці максимальний титр антитіл становив 1:280. Таким чином, імуногенний препарат із штаму, що заявляється, дозволяє отримати більш активну паратуберкульозну сироватку крові. 2 UA 103894 U Таблиця 1 Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" Показники продуктивності Штам Mycobacterium avium sp. paratuberculosis "Деметра" Епізоотична культура збудника паратуберкульозу № 6651 Епізоотична культура збудника паратуберкульозу № 5809 25,00±1,6 18,34±0,76 2,9+0,32 7,85±0,29 4,7±0,81 0,73±0,64 БМ через 10 тижнів (г/л) Протеїн у КФ через 10 тижнів (г/л) Примітка: БМ - бакмаса; КФ - культуральний фільтрат Таблиця 2 Штам Mycobacterium avium Аг комерційний (р.т. 1:100), sp. paratuberculosis (Росія), с. 2, к. 2 "Деметра" (р.т. 1:700) 1:5 1:10 1:20 1:5 1:10 1:20 # # # # # # Сироватки крові Позитивна сироватка крові від ВРХ Від кролика імунізованого штамом МАР "Деметра" Від ВРХ № 9849 інфікованої M.bovis Від ВРХ № 9850 інфікованої M.bovis Від ВРХ № 9210 інфікованої M.bovis Від ВРХ імунізованої M.intracellulare Від ВРХ імунізованої M.kansasii Від ВРХ імунізованої M.fortuitum Від ВРХ імунізованої BCG Від кролика, інфікованого M.scrofulaceum Від курки, інфікованої M. avium Бруцельозна с. 1, к. 118 Монорецепторна О-аглютинуюча сальмонельозна ФГУП "Краснодарская биофабрика" с. 295, к.295 РІД позитивнана лейкоз ВРХ # # # # # # +++ ++ + # # # # # +++ +++ # # +++ +++ +++ # +++ +++ Контролі S (1:10) з Аг S (1:10) без Аг + S (1:10) з Аг + S (1:10) без Аг Аг без S Без S, без Аг # + # Примітки: S - сироватка негативна; S - сироватка позитивна; Аг - антиген; # - відсутність гемолізу, прозора надосадова рідина; +++ - 25 % гемолізу еритроцитів; ++ - 50 % гемолізу еритроцитів; + - 75 % еритроцитів; - повний гемоліз, відсутність осаду еритроцитів, рідина забарвлена гемоглобіном. 3 UA 103894 U Таблиця 3 Штам M. avium subspecies paratuberculosis "Деметра" Розведення сироваток Сироватка крові кролика, імунізованого М. avium sp. paratuberculosis "Деметра" 1:10 1:80 1:280 1:320 1:360 1:400 1:440 1:480 1:520 # # # # # +++ ++ + Комерційна сироватка 1:10 # 1:80 # 1:280 1:320 1:360 +++ ++ Примітки: 1. Знак "#" - позитивна реакція, 100 % затримка гемолізу еритроцитів; 2. Знак "+++" - позитивна реакція, 75 % затримки гемолізу еритроцитів; 3. Знак "++" - сумнівна реакція, 50 % затримки гемолізу еритроцитів; 4. Знак "+" - негативна реакція, 25 % затримки гемолізу еритроцитів; 5. Знак "-" - негативна реакція, гемоліз еритроцитів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Штам M. avium subspecies paratuberculosis, виділений з мезентеріальних лімфатичних вузлів корови для виготовлення біологічних препаратів (антигену, алергену, імуногенного препарату) при проведенні серологічної та алергічної діагностики паратуберкульозу, який депонований в Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів за номером 610, рід Mycobacterium, вид Mycobacterium avium, підвид Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4