Синтетичне середовище для виготовлення діагностичних препаратів з m. avium subspecies paratuberculosis (map)

Реферат: Синтетичне середовище для виготовлення діагностичних препаратів з М. avium subspecies paratuberculosis (MAP) містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, амоній лимоннокислий, залізо лимонно-аміачне, гліцерин, дистильовану воду, а також натрій Lглутаміновокислий, глікокол, глюкозу. UA 95598 U (54) СИНТЕТИЧНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ ВИГОТОВЛЕННЯ ДІАГНОСТИЧНИХ ПРЕПАРАТІВ З M. AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS (MAP) UA 95598 U UA 95598 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології і може бути використана в лабораторіях ветеринарної медицини для виготовлення діагностичних препаратів з М. avium subspecies paratuberculosis (MAP). У ветеринарній медицині з метою накопичення бактеріальної маси МАР використовують рідке синтетичне середовище Сотона [Иванова, Н.А. Культивирование микобактерий паратуберкулеза на жидких питательных средах / Н.А. Иванова // Инфекционная патология сельскохозяйственных животных: Тр. ВИЭВ - М., 1984. - Т.61. - С. 67-72], до складу якого входять аспарагін; калій фосфорнокислий двохосновний; магній сірчанокислий; залізо лимонноаміачне; лимонна кислота; гліцерин. Недоліками цього середовища є низькі ростові властивості, невисокий вихід бактеріальної маси й білка з культурального фільтрату, використання імпортного аспарагіну, що підвищує собівартість середовища, необхідність адаптування МАР до цього середовища шляхом багаторазового пасажування. За кордоном при виготовленні алергенів використовують синтетичне середовище WatsonReid, яке вміщує такі компоненти: L-аргінін; калій фосфорнокислий одноосновний; магній сірчанокислий; залізо лимонно-аміачне; хлорид кальцію; сульфат цинку; хлорид кобальту; хлорид натрію; декстрозу; гліцерин. Недоліком цього середовища є недостатньо високий вихід бактеріальної маси й білка з культурального фільтрату, використання високовартісного аргініну, декстрози [Paratuberculosis. Organism, Disease, Control: edited by Marcel A. Behr, Desmond M. Collins. - 2010. - 388 p.]. Найбільш близьким до об'єкта, що заявляється, є рідке середовище для виготовлення антигену, йоніну та вакцини проти паратуберкульозу [ОІЕ Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. - 2008. - Ch. 2.1.11. - 284 p.], до складу якого входить L-аспарагін - 5,0 г; калій фосфорнокислий однозаміщений - 2,0 г; магній сірчанокислий - 1,0 г; амоній 3 лимоннокислий - 2,0 г; залізо лимонно-аміачне - 0,075 г; декстроза - 10,0 г; гліцерин - 48,0 см , 3 дистильована вода - до 1000,0 см . Недоліком цього середовища є використання імпортних та коштовних L-аспарагіну, декстрози, а також недостатньо високий вихід цільового продукту з одиниці об'єму. Аналіз відомих синтетичних рідких середовищ для накопичення бактеріальної маси МАР показав, що незалежно від складу хімічних компонентів у синтетичні середовища обов'язково входять коштовні імпортні амінокислоти L-аспарагін або L-аргінін, що значно збільшує собівартість готового продукту. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити синтетичне середовище для виготовлення діагностичних препаратів з МАР, що включає: калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, амоній лимоннокислий 3-заміщений, залізо лимонноаміачне, глюкозу, гліцерин дистильовану воду шляхом вилучення L-аспарагіну та додаванням натрій L-глутаміновокислого, глікоколу і глюкози, при наступному співвідношенні компонентів, г/л: натрій L-глутаміновокислий (C5H8NNaO4×H2O) 3,0-5,0 глікокол (CH2NH2COOH) 3,0-5,0 амоній лимоннокислий ([NH4]3С6Н5О7) 1,0-3,0 калій фосфорнокислий однозаміщений (КН 2РО4) 1,0-3,0 магній сірчанокислий (MgSO4×7H2O) 0,5-1,5 залізо лимонно-аміачне (FeNH4C6H5O7) 0,075-0,085 глюкоза (С6Н12О6) 5,0-15,0 3 гліцерин (С3Н5(ОН)3) 40,0-60,0 см 3 вода дистильована до 1000,0 см . Порівняльний аналіз з найближчим аналогом дозволяє зробити висновок про те, що склад заявленого середовища відрізняється від відомого використанням вітчизняних та некоштовних натрію L-глутаміновокислого та глікоколу, що покращує ростові властивості середовища, чим досягається більш інтенсивний ріст бактеріальної маси, високий вихід протеїну з одиниці об'єму за меншої собівартості та відповідає критерію "новизна". Синтетичне середовище готують таким чином: Всі компоненти розчиняють у дистильованій воді, доводять рН до 5,8-6,0, фільтрують через ватно-марлевий фільтр. Середовище стерилізують за режимом 1 атм. (121 °C - 20 хвилин) і охолоджують до кімнатної температури. Середовище перевіряють на стерильність шляхом витримування у термостаті за температури (37,5±0,5)°С впродовж 3 діб. Перед посівом у бутлі проводять адаптування культури МАР з яєчного середовища шляхом одноразового пасажування на цьому синтетичному середовищі у флаконах. Через 20 діб матричну культуру висівають у бутлі. Після закінчення терміну культивування (через 10 тижнів), інактивовану бактеріальну масу 1 UA 95598 U 5 10 15 20 25 30 відфільтровують від культуральної рідини через ватно-марлевий фільтр, віджимають та зважувають. У певний обсяг культурального фільтрату додають 40 % трихлоруксусну кислоту (ТХУ) до 4 % кінцевої концентрації. Через 18 год. осаджений білок центрифугують в заздалегідь зважених центрифужних стаканах й визначають вагу. Критеріями якості ростових властивостей синтетичного середовища є інтенсивність росту збудника паратуберкульозу (площа плівки, її товщина), вихід віджатої (вологої) бактеріальної маси та осадженого протеїну з культурального фільтрату (г) через 10 тижнів культивування. Приклад № 1. Синтетичне середовище готують як вказано вище, при наступному співвідношенні компонентів г/л: натрій L-глутаміновокислий (C5H8NNaО4×H2О) 3,0 глікокол (CH2NH2COOH) 3,0 амоній лимоннокислий ([NH4]3С6Н5О7) 1,0 калій фосфорнокислий однозаміщений (КН 2РО4) 1,0 магній сірчанокислий (MgSO4×7H2O) 0,5 залізо лимонно-аміачне (FeNH4C6H5O7) 0,075 глюкоза (С6Н12О6) 5,0 3 гліцерин (С3Н5(ОН)3) 40,0 см 3 вода дистильована до 1000,0 см Приклад № 2. Теж, що і в прикладі № 1 при наступному співвідношенні компонентів г/л: натрій L-глутаміновокислий (C5H8NNaО4×H2О) 4,0 глікокол (CH2NH2COOH) 4,0 амоній лимоннокислий ([NH4]3C6H5O7) 2,0 калій фосфорнокислий однозаміщений (КН2РО4) 2,0 магній сірчанокислий (MgSO4×7H2O) 1,0 залізо лимонно-аміачне (FeNH4C6H5O7) 0,08 глюкоза (С6Н12О6) 10,0 3 гліцерин (С3Н5(ОН)3) 50,0 см 3 вода дистильована до 1000,0 см . Приклад № 3. Теж, що і в прикладі № 1 при наступному співвідношенні компонентів г/л: натрій L-глутаміновокислий (C5H8NNaO4×H2O) 5,0 глікокол (CH2NH2COOH) 5,0 амоній лимоннокислий ([NH4]зС6Н5О7) 3,0 калій фосфорнокислий однозаміщений (КН 2РО4) 3,0 магній сірчанокислий (MgSO4×7H2O) 1,5 залізо лимонно-аміачне (FeNH4C6H5O7) 0,085 глюкоза (С6Н12О6) 15,0 3 гліцерин (С3Н5(ОН)3) 60,0 см 3 вода дистильована до 1000,0 см . Дані про інтенсивність зростання плівки, накопичення бактеріальної маси і культурального білка на синтетичних середовищах представлені в таблиці. Як видно з наведених в таблиці даних, найбільш інтенсивний ріст плівки спостерігали на середовищах № 2 і № 3. Так, вже на 10 добу культивування половину поверхні цих середовищ займала тонка, ніжна, білого кольору плівка, яка до 20 доби культивування розросталася по всій поверхні середовища. При подальшому інкубуванні плівка потовщувалася у 2 рази, нашаровувалася на стінки бутилів, набувала складчастість й кремовий відтінок. Місце, де плівка під вагою опускалася на дно, поверхня середовища знову затягувалася культурою МАР. На середовищі-найближчому аналога ріст плівки був менш інтенсивним, ніж на середовищах № 2 і № 3, плівка розросталася по всій поверхні тільки через 30 діб. До кінця терміну інкубування на середовищі-найближчому аналогу плівка з бактеріальної маси в половині бутлів опустилася на дно, а зростання нової плівки на поверхні середовища більше не спостерігали. Інтенсивного зростання МАР на середовищі № 1 не спостерігали, зростання плівки було повільним, вона не розросталася в товщину та не набувала складчастості. Порівняльні ростові характеристики синтетичних середовищ наведені у таблиці. Як видно з результатів таблиці, накопичення бактеріальної маси і культурального білка на середовищі, що заявляється, відбувається набагато інтенсивніше. Так вага віджатої бактеріальної маси на середовищі № 2 складала 25,0±1,6 г/л, що в 1,34 рази більше, порівняно з її кількістю на середовищі-прототипі (18,6±0,54 г/л). Найменша кількість бактеріальної маси була на середовищі № 1 (12,0±0,52). 2 UA 95598 U 5 10 Вихід культурального протеїну з середовища № 2 складав 7,85±0,29 г/л, що в 1,4 рази більше, ніж з середовища-найближчого аналога (5,21±0,25) і в 2,2 рази більше, в порівнянні з середовищем № 1 (3,5±0,3). Кількість бактеріальної маси та культурального протеїну на середовищі № 2 і № 3 була майже однакова, але з боку економічних витрат, середовище № 2 є більш оптимальним. Таким чином, розроблене синтетичне середовище для виготовлення діагностичних препаратів (алергену, антигену) з МАР, забезпечує зниження собівартості, підвищення ростових властивостей середовища, що дозволить підвищити вихід цільового продукту з одиниці об'єму і може бути використано на підприємствах по виробництву діагностичних ветеринарних препаратів при виготовленні алергенів, антигенів або вакцини. Таблиця Синтетичне середовище для виготовлення діагностичних препаратів з М. Avium subspecies paratuberculosis (MAP) Приклад № 1 Приклад № 2 Приклад № 3 Термін культивування (діб) 10 20 30 10 20 30 10 20 30 * Площа плівки (%) 30 50 70 50 100 х2 50 100 100 БМ/1 л через 10 12,0±0,52 25,00±1,6 24,0±0,36 тижнів (г) Протеїн у КФ через 3,5±0,3 7,85±0,29 7,53±0,37 10 тижнів (г) * х2 - збільшення товщини плівки у 2 рази; Примітка: БМ - бактеріальна мaca; КФ - культуральний фільтрат. 10 30 Прототип 20 30 70 100 18,60±0,54 5,21±0,25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Синтетичне середовище для виготовлення діагностичних препаратів з М. avium subspecies paratuberculosis (MAP), що містить калій фосфорнокислий однозаміщений, магній сірчанокислий, амоній лимоннокислий, залізо лимонно-аміачне, гліцерин, дистильовану воду, яке відрізняється тим, що додатково містить натрій L-глутаміновокислий, глікокол, глюкозу при наступному співвідношенні компонентів, г/л: натрій L-глутаміновокислий 3,0-5,0 (C5H8NNaO4×H2O) глікокол (CH2NH2COOH) 3,0-5,0 амоній лимоннокислий 1,0-3,0 ([NH4]3С6Н5О7) калій фосфорнокислий 1,0-3,0 однозаміщений (KН2РО4) магній сірчанокислий 0,5-1,5 (MgSO4×7H2O) залізо лимонно-аміачне 0,075-0,085 (FeNH4C6H5O7) глюкоза (С6Н12О6) 5,0-15,0 3 гліцерин (С3Н5(ОН)3) 40,0-60,0 см 3 вода дистильована до 1000,0 см . 20 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3