Спосіб приготування магнітного нанорозмірного сорбенту для імунологічних і біохімічних об’єктів

Спосіб приготування магнітного нанорозмірного сорбенту для імунологічних і біохімічних об'єктів, зокрема імуноглобулінів, що включає синтез магнітних наночастинок, активацію їх поверхні, іммобілізацію на поверхні органічних речовин, здатних до селективної сорбції субстратів, який відрізняється тим, що як магнітні частинки використовують наночастинки оксиду заліза (II, III), активацію поверхні проводять з використанням сполук олова (IV), селективність і оборотність сорбції імуноглобулінів досягаються за рахунок іммобілізації протеїну A Staphylococcus aureus, а стабілізація колоїдного розчину наночастинок сорбенту досягається за рахунок іммобілізації на їх поверхні речовин, що використовуються для селективного зв'язування субстратів, без додаткових поверхнево-активних речовин. Корисна модель відноситься до способу приготування і застосування магнітних сорбентів, а саме до сорбентів на основі магнітних наночастинок. Область застосування таких сорбентів полягає у відділенні за рахунок селективної фізичної адсорбції або селективного хімічного зв'язування на поверхні біологічних об'єктів і органічних молекул (протеїнів, антитіл, продуктів життєдіяльності організмів тощо) з розчинів, з метою їх аналізу або препаративного виділення, а також очистки (відокремлення). На відміну від сорбентів на основі суцільних матеріалів, наночастинки мають більшу площу поверхні, що обумовлює більш високу ємність сорбентів на їх основі. Перевагою магнітних наночастинок перед немагнітними сорбентами є можливість швидкого відокремлення при накладанні магнітного поля постійного магніту, без застосування фільтрування. Відокремлення магнітних сорбентів в магнітному полі від систем, де проводиться сорбція, може бути здійснене дуже швидко, без використання спеціальних приладів (наприклад, вакуумного насосу для фільтрування), в рідинах з високою в'язкістю (фільтрування яких являє складну задачу), у присутності інших суспендованих нерозчинних частинок, що також затримуються фільтром (наприклад, кров'яних тілець у випадку аналізу крові). Таким чином, метод використання магнітних сорбентів придатний для експрес-аналізу біологічних об'єктів, а також для виділення певних (заданих) компонентів з таких систем. Виділення біологічних об'єктів за допомогою наночастинок дозволяє здійснювати ранню діагностику ряду захворювань, наприклад раку [1] або туберкульозу [2]. Крім цього, можливість швидкого вилучення сорбенту з рідини, що аналізується, дає можливість контролювати час взаємодії сорбенту з аналітом, що може бути важливим в деяких випадках. Означені сорбенти створюються шляхом іммобілізації речовин, здатних до селективного зв'язування вказаних біологічних об'єктів і/або органічних молекул, на матриці магнітного сорбенту (тобто на магнітній основі, що визначає фізичні властивості сорбенту, але сама по собі не може специфічно зв'язувати будь-які молекули). Основними вимогами до таких сорбентів є: 1) висока ємність сорбенту по заданій речовині, тобто кількість такої зв'язаної речовини на одиницю маси сорбенту; 2) селективність сорбенту, тобто здатність вилучати певні речовини або речовини, що відносяться до певних класів; 3) відсутність потреби у складному обладнанні та швидкість відокремлення від розчину; 4) відсутність потреби у 1 о 10467 складному обладнанні і низька вартість приготування; 5) стабільність при зберіганні протягом тривалого часу, а також стабільність в розчинах, в яких ведеться концентрування речовин. Селективність сорбенту визначається специфічністю взаємоді'і речовини, іммобілізованої на матриці такого сорбенту, з речовиною, що має бути визначена. Необхідною умовою досягнення високої селективності сорбентів є збереження структури речовини, що іммобілізована на матриці сорбенту, що накладає певні обмеження на використання потенційних матриць таких сорбентів. Відомо декілька методів іммобілізації речовин на інертних носіях, головними серед яких є 1) сорбційне зв'язування, тобто утримання іммобілізованої речовини на поверхні за рахунок адсорбційних сил; 2) металохелатний метод, при якому іммобілізована речовина утримується за рахунок утворення комплексів на поверхні носія; і 3) ковалентне зв'язування - іммобілізація за рахунок утворення нових ковалентних зв'язків між поверхнею і іммобілізованою речовиною. Перевагами металохелатного методу над сорбційним або ковалентним зв'язуванням є надійна фіксація речовини на поверхні (що не завжди досягається при адсорбційному зв'язуванні) та мінімальна зміна її структури (що, відповідно, не завжди можливе у випадку ковалентного зв'язування) [3]. Особливістю приготування матриць магнітних сорбентів є вибір методу, що дозволяє отримати магнітні частинки певного розміру. Так, частинки з розміром порядку декількох нанометрів слабо втягуються в магнітне поле, що нівелює переваги саме магнітного сорбенту, а частинки з розміром більше 100 нм мають схильність до коагуляції в коло'їдних розчинах, що веде до зменшення їх площі поверхні і до ряду незручностей при роботі, пов'язаних із швидким неконтрольованим осадженням частинок. Описано сорбенти на основі магнітних наночастинок РезО4, отримані шляхом покриття поверхні наночастинок шаром полімеру [4, 5] або шляхом синтезу наночастинок РезОд у присутності дуже високих концентрацій декстрину [6]. В цих випадках функцією полімеру або декстрину є запобігання злипанню частинок та їх утримання в колоїдному стані. Проте, як застосований полімер, так і декстрин не здатні до специфічного зв'язування субстратів. В запропонованому нами методі стабілізація магнітних частинок в розчинах досягається за рахунок іммобілізації саме тих речовин, які пропонується використовувати для селективного зв'язування субстратів - амінокислот, сахарів, протеїну А і антитіл до мікобацил туберкульозу. Запропоновано метод приготування імуносорбенту на основі частинок нікелю розміром біля 1 мікрону [7]. Цей винахід полягає в приготуванні магнітних частинок, на поверхню яких іммобілізовано протеїн, що специфічно реагує з певним іншим протеїном (метод може бути поширений на велику кількість пар протеїнів, що селеістивно взаємодіють один з іншим). Проте недоліком систем, в яких використовують наночастинки металів, є порівняно низька стійкість таких частинок до окиснення киснем повітря, що може призводити_як до погіршення магнітних властивостей частинок, так і порушення поверхневого шару, на якому іммобілізовано протеїн Магнітні наночастинки оксидів, які пропонуються в цьому патенті, не змінюються під дією кисню повітря, а їх магнітні характеристики достатні для швидкого осадження в магнітному полі. Поряд з сорбентами на основі наночастинок використовуються сорбенти на масивній немагнітній основі. Наприклад, запропоновано метод визначення імуноглобулінів способом пропускання кров'яної плазми через шар силікагелю (вагою приблизно 100г), на якому іммобілізовано Імуносорбційну речовину [8]. Недоліком такого методу є відносно низька швидкість визначення, що лімітується швидкістю пропускання плазми крові через шар сорбенту, а також потреба у попередньому відокремленню плазми крові від кров'яних тілець. Це недолік може бути подоланий при використанні нанорозмірного магнітного сорбенту, який суспендується в розчині і швидко відокремлюється в магнітному полі. Описано метод іммобілізації імуноглобулінів на шар сполуки складу Cu3[Fe(CN)5(NH3)]2, який, в свою чергу, було зафіксовано за допомогою карбоксильних груп моношару аніонів 12мєркаптододеканкарбонової кислоти на поверхні золота [9]. Такий спосіб іммобілізації дозволив досягти однорідної орієнтації імуноглобулінів на поверхні, проте недоліком такого сорбенту є висока вартість його приготування. Магнітний нанорозмірний сорбент створюється шляхом утворення активного шару на поверхні магнітних часток (матриці сорбенту). Прототипом матриці сорбенту є матриця магнітного сорбенту, отримана шляхом включення колоїдних магнітних частинок феритів складу MFe;>O4(M=Fe2+, Мл24", Cu 2 + , Ni 2 + і Со2+) в желатин, що також містить водорозчинний полісахарид (гумі-арабік, карбоксиметицелюлоза, агар-агар), поліметафосфат натрію (формули (NaPO3)n) [10]. Молекули желатину, що утворює оболонку частинок, зшиті глутаровим діальдепдом і формальдегідом через утворення основ Шифу з аміногрупами в складі желатину. Матриця сорбенту, що отримується таким чином, містить 5-30% желатину (тут і далі - відсотки по масі), 1-5% водорозчинного полісахариду, 0,01-1% поліметафосфату натрію І 0,00001-2% вказаного вище фериту. Ці частинки нерозчинні у воді і мають гідрофільні властивості. Призначенням наведеної матриці магнітного сорбенту є подальша іммобілізація природних протеїнів. Недопіком такої матриці сорбенту є низький вміст магнітної фази (до 2%), що знижує силу втягування таких частинок в магнітне поле при відокремленні сорбенту. До недоліків цієї матриці сорбенту також можна віднести складний спосіб її приготування. Діаметр частинок, що можна отримати за наведеним способом, лежить в межах від 0,8 до 50мкм, проте застосування частинок меншого розміру дозволило б підвищити сорбційну здатність матеріалу (завдяки більшій питомій площі поверхні частинок меншого розміру); це також деякою мірою можна вважати недоліком, оскі 10467 льки потенційні можливості нанорозмірних сорбентів повністю не використовуються. Прототипом магнітного нанорозмірного сорбенту є магнітний сорбент для мікобацил туберкульозу на основі наночастинок заліза діаметром 25мкм, покритих оболонкою оксиду кремнію (1-16 %) і гідроксиду титану (0,5-4 %), на яких іммобілізовано антитіла до мікобацилл туберкульозу [2]. Наночастинки заліза синтезують плазмохімічним методом. Покриття оксидом кремнію необхідно для підвищення питомого завантаження сорбенту антитілами, а гідроксид титану забезпечує фіксацію антитіл на поверхні. Розмір частинок сорбенту становить 2-5мкм; сорбційна ємність - 80мг імуноглобулінів (антитіл) на 1г сорбенту. Металохелатна фіксація імуноглобулшщ у даному випадку не призводить до пошкодження антитіл і забезпечує їх надійне утримання на поверхні. Недоліком цього сорбенту є порівняно низька стійкість частинок заліза до окиснеиня киснем повітря і складність приготування частинок (використання плазмохімічного методу). Дана корисна модель полягає у розробці способу отримання матриці магнітного сорбенту, придатної для іммобілізації широкого кола органічних молекул, включаючи біологічні об'єкти, і отриманні сорбенту, здатного до селективної і оборотної сорбції імуноглобупінів з метою їх відокремлення і/або аналізу. Поставлена мета по розробці способу отримання матриці магнітного сорбенту досягається шляхом отримання магнітних наночастинок РезСЦ і активації їх поверхні за допомогою хлориду олова (IV). Активність матриці магнітного сорбенту продемонстрована шляхом іммобілізації на ній оптично активних амінокислот, сахарів, а також антитіл до мікобацил туберкульозу (Таблиця 1). Мета по отриманню сорбенту, здатного до селективної і оборотної сорбції Імуноглобулінів, досягається шляхом іммобілізації на отриманій матриці сорбенту протеїну A Staphylococcus aureus, здатного до селективної взаємодії' з імуноглобулінами [13]. Важливість оборотної сорбції обумовлена тим, що для виділення імуноглобулінів або їх аналізу потрібно відокремлення їх від поверхні частинок сорбенту. Отриманий сорбент здатний до селективного виділення -Імуноглобулінів з цільної кролячої сироватки, що підтверджено експериментально, як це буде показано нижче. Активація поверхні наночастинок Fe3O4 необхідна для створення функціональних груп, здатних до хімічного (хелатного) зв'язування протеїнів, антитіл, амінокислот і сахарів [3]. При активації поверхні за допомогою SnCU з подальшим гідролізом такі групи містять залишки Sn(OH)n, і іммобілізація субстратів перебігає за рахунок реакції з такими фрагментами. Також суттєвим є те, що РезОд, оброблений тетрахлоридом олова, утворює більш стійкі колоїдні розчини порівняно з неактивованим зразком. Це виключає потребу у використанні додаткових стабілізаторів. Ми вважаємо, що як матриця магнітного сорбенту можуть використовуватися оксидні магнітні наночастинки іншого фазового складу, а активація поверхні може дося гатися шляхом обробки галогенідами інших елементів, зокрема титану, заліза, алюмінію, кремнію тощо. Матриця сорбенту, що пропонується, характеризується малим розміром частинок (в середньому, 15нм) і, внаслідок цього, високою площею поверхні (60м2/г), а також високими сорбційними характеристиками у зв'язуванні протеїну А Staphylococcus aureus, антитіл до мікобактерій туберкульозу, амінокислот і сахарів. За складом повітряно-суха матриця сорбенту містить 88-92% РезО4, 3-5% оксиду олова SnO2, решта - вода (вміст олова перераховано на оксид, проте за хімічним складом олововмісна оболонка є сумішшю гідроксидів і олов'яних кислот). Сорбційні характеристики даної матриці магнітного сорбенту по мають величини, що співставим! з описаними в літературі при порівнянні з аналогічними субстратами [2, 3]. На відміну від матриць сорбентів, описаних в прототипі, матриця сорбенту, яка пропонується, складається з наночастинок (з середнім діаметром 15нм). Так, частинки матриці сорбенту, описані в прототипі, мають розмір від 0,8 до 50мкм І при цьому містять 0,00001-2% магнітної фази. Таким чином, кожна магнітна частинка такої матриці сорбенту несе більше 98% немагнітної фази. Частинки матриці сорбенту, наведені в прототипі, мають розмір 2-5мкм. Важливою рисою матриці магнітного сорбенту, що пропонується, є його низька вартість і простота приготування порівняно з сорбентами, описаними в прототипі, І в літературі взагалі. Ці ознаки відносяться як до процесу отримання магнітних наночастинок РезО4, так і до її активації. Використання способу приготування сорбенту, який пропонується, може забезпечити зниження вартості магнітного сорбенту за рахунок використання наночастинок РезО4 як магнітної фази і простого способу їх активації, із досягненням високої сорбційної ємності матриці сорбенту при іммобілізації протеїнів, антитіл, амінокислот і сахарів, а можливістю простого виділення імуноглобулінів з розчинів. Простота приготування сорбенту і вилучення імуноглобуліиів полягає у відсутності потреби у складному обладнанні, а також у використанні дешевих і доступних реагентів. Застосування зазначеного способу приготування матриці магнітного сорбенту і способу іммобілізації органічних субстратів на ній дозволить спростити приготування сорбентів і сенсорів для імунологічних, біохімічних і аналітичних цілей і знизити їх вартість. Запропоновані методи придатні для іммобілізації широкого кола протеїнів, амінокислот І сахарів, що може бути використано при створенні магнітних сенсорів і магнітних сорбентів на біологічні об'єкти і органічні молекули. Дана корисна модель підтверджується, але не обмежується, наведеними нижче прикладами. Наночастинки оксиду заліза (II, 1 1 отримували за 1) реакцією комерційно доступних сульфатів заліза(ІІ) і заліза(ІІІ) з гідроксидом натрію за модифікацією методу, запропонованого в [4] (усі використані реактиви були марок "х.ч." і "ч.д.а."). Розмір частинок був визначений за даними рентгенофа 10467 зового аналізу з використанням дифрактометру ДРОН-3 (СиК - випромінення, відфільтроване нікелем, =1,5418 А ) по рівнянню Шерера [11], а площа поверхні - за даними адсорбції парів метанолу при 298 К [12]. Вміст адсорбованих антитіл, амінокислот і сахарів визначали методом C,H,Nаналізу. Для елементного аналізу частини зразків висушували на повітрі. Сорбцію антитіл також було підтверджено методом мас-спектрометрії. Приклади ілюструють отримання наночастинок РезО4 у формі, придатній для активації поверхні (приклад 1), метод отримання матриці магнітного сорбенту шляхом активації поверхні наночастинок РезСП (приклад 2), метод іммобілізації протеїну A StaphyJococcus aureus (приклад 3), метод виділення імуноглобулінів з цільної кролячої сироватки із застосуванням приготованого сорбенту (приклад 4), метод іммобілізації антитіл до мікобактерій туберкульозу (приклад 5), метод іммобілізації" 1-гістидину, 1-тирозину, сі-глюкози, d-лактози і d-мальтози (приклад 6): Приклад №1 Відфільтрований розчин 5,0r FeSO4-7H2O і 10,1г Fe2(SO4)3-9H20 у 300мл води при краплях протягом 20 хвилин додається до розчину 25г КОН (можна замінити на NaOH) у 200мл води при 90°С. Після закінчення додавання суміш витримується при цій температурі ще ЗО хвилин. Суміш прохолоджується і багаторазово (15-20 разів) промивається шляхом декантації до рН=7. Осадження наночастинок при декантації" можна прискорювати, накладаючи на суміш магнітне поле, створене постійним магнітом. Для подальшої активації осад розводиться 200мл води. Отримана суспензія містить 4г РезО4, вона стабільна протягом декількох хвилин, чого достатньо для дозування розчину. За даними РФА середній діаметр частинок дорівнює 15нм, а питома площа поверхні висушеного зразку - 60м2/г. Приклад №2 До ЮОмл свіжоприготованої" суспензії, що містить 2г РезО4 при рН=7 по краплях, при постійному енергійному перемішуванні додається 1мл SnCU. Після закінчення додавання SnCI4 до суміші відразу починається додавання 3% розчину аміаку до рН=6. Отримана суспензія залишається на 12 годин при кімнатній температурі, після чого промивається водою методом декантації (з осадженням наночастинок за допомогою магніту) декілька разів до рН=7. Зразок зберігається у вологому вигляді. Приклад №3 Для іммобілізації протеїну А до Юмл колоїдного розчину, що містив 0,05г активованих наночастинок Fe3O4 (отриманих, як описано в прикладі 2), при 4°С додавали 1мл розчину, що містив 0,013мг протеїну A Staphylococcus aureus, і залишали при цій температурі на 4 години при періодичному перемішуванні (1 раз на 10 хвилин). Реакційну суміш розділяли в полі постійного магніту, осад відокремлювали декантацією, промивали дистильованою водою (3 порції по Юмл) і зберігали у вологому стані. Приклад №4 Ретельно ресуспендований колоїдний розчин 8 сорбенту, приготованого, як вказано в прикладі З, змішували з рівним об'ємом кролячої сироватки (1:100). Отримана суміш витримувалася протягом 1 години при кімнатній температурі, після чого сорбент осаджували за допомогою постійного магніту, відокремлювали від розчину і до сорбенту додавали гліциновий буфер (рН=2,2) в об'ємі, що становив 1/10 від вихідного об'єм системи. Сорбент знову осаджували за допомогою постійного магніту, а розчин аналізували на вміст імуноглобулінів за допомогою поверхневого плазмонного резонансу (ППР) з використанням сенсору, на поверхні якого було іммобілізовано протеїн А за стандартною методикою [14]. Для контролю відгуку сенсору ППР використовували неочищену кролячу сироватку. Для перевірки того, що імуноглобуліни сироватки відокремлюються саме з участю запропонованого сорбенту, проводилося дослідження контрольного розчину, отриманого по такій же методиці, але з використанням сорбенту без іммобілізованого протеїну А (отриманого, як описано в прикладі 2); при цьому відгук сенсору ППР був відсутній. Наявність сигналу сенсору ППР в розчині, приготованому за описаною в прикладі 4 методикою, і відсутність такого сигналу у випадку використання сорбенту без протеїну А, свідчить про можливість виділення імуноглобулінів з сироватки за допомогою магнітного сорбенту з іммобілізованим протеїном А. Приклад №5 Для Іммобілізації антитіл до мікобактерій туберкульозу до Юмл колоїдного розчину, що містив 0,05г активованих наночастинок РезО4 (отриманих, як описано в прикладі 2), при 4°С додавали 0,25мл розчину антитіл, отриманого з мокроти хворих на туберкульоз, і залишали при цій температурі на 4 години при періодичному перемішуванні (1 раз на 10 хвилин). Реакційну суміш розділяли в полі постійного магніту, осад відокремлювали декантацією, промивали дистильованою водою (3 порції по Юмл) І зберігали у вологому стані. Іммобілізацію антитіл до мікобактерій туберкульозу на отриману матрицю сорбенту було додатково підтверджено методом мас-спектрометрії в варіанті польової десорбції. Так, в мас-спектрі імуноглобулінів і масспектрі, отриманому при нанесенні сорбенту з іммобілізованими імуноглобулінами на емітер масспектрометру, спостерігалися піки при однакових масових числах. Подібність способу фрагментації антитіл у вільному вигляді і у складі наночастинок свідчить про збереження будови антитіла при іммобілізації1. , , Приклад №6 Для іммобілізації 1-гістидину, 1-тирозину, сіглюкози, d-лактози і d-мальтози до 50мл колоїдного розчину, що містив 1г активованих наночасти(отриманих, як описано в прикладі 2) нок додавали Юмл водного розчину, що містив 1-10 моля відповідного субстрату, і залишали на 12 годин при 20°С. Осад, що утворювався при накладанні магнітного поля, відокремлювали декантацією і промивали 5-ма порціями води по 20мл. В таблиці наведено максимальні кількості антитіл до мікобактерій туберкульозу, амінокислот і сахарів, що -було іммобілізовано на поверхні отриманої 10467 матриці сорбенту. Для порівняння наведені дані по аналогічному сорбенту [2]. З даних таблиці видно, що сорбційні характеристики матриці сорбенту при сорбції антитіл до мікобактерій туберкульозу перевищують сорбційні характеристики відомого сорбенту [2]. Результати аналізу отриманої матри 10 ці сорбенту показали, що на ній можуть бути іммобілізовані антитіла, амінокислоти і сахари, і сорбційна ємність цієї матриці сорбенту при іммобілізації" антитіл перевищує таку для відомих аналогів. Таблиця Характеристики отриманої матриці магнітного сорбенту по іммобілізації антитіл, амінокислот і сахарів № 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Іммобілізована речовина Антитіла до мікобацил туберкульозу 1 -гістидин 1 -тирозин d-глюкоза d- мальтоза d-лактоза Прототип сорбенту Кількість іммобілізованої речовини на 1г 4 сорбенту, х10 моль Вміст органічної речовини, % 11* 2 12 2 3,5 2,5 8 1,3 7,7 Літ. 1,2 1,0 0,7 • В припущенні, що антитіла містять 60% вуглецю та азоту (в сумі). За даними аналізу отримано значення 60-50% в залежності від зразку. Література: 1. J.-M. Nam, С. S. Thaxton, C. A. Mirkin // Science - 2003 - V. 301 - P. 1884. 2. В. И. Филиппов, M. А. Владимирский, M. B. Андросова, Э. К. Добринский // Патент РФ №2140084 (1999 г.) 3. Иммобилизированные клетки и ферменты. Методы. Под. ред. Дж. Вудворда. М. Мир: 1988. 216 с. 4. С. S. Owen, J. С. Silvia, L. D'Angelo, P. A. Liberti // US Patent 4,795,698 (1989 p.) 5. P.A. Liberti, G.C. Rao, J.N. Chiarappa // US Patent 5,698,271 (1997) 6. R. S. Molday// US Patent 4,452,773 (1984) 7. I. Giaever//US Patent 4,018,886 (1977) 8. W.I. Bensinger// US Patent 4,614,513 (1986) 9. Snopok B.A., Goltsov Yu.G., Kostyukevich Комп'ютерна верстка А Крулевський E.V., Matkovskaja L.A., Shirshov Yu.M., Venger E.F. Sensors and Actuators, 2003, B95, 33610. M. Ikeda, S. Sakamoto, K. Suzuki // US Patent 4,582,622 (1986) 11. Hammond С // The basis of crystallography and diffraction - Oxford: Oxford Univ. Press, 1997. P. 145. 12. Schmidt W., Weidenthaler С // Chem. Mater. -2001 -V. 13-P. 607. 13. Brown N. L., Botlomley S. P., Gore M. G. // Biochem. Soc. Trans. - 1998.V.26, No.3. - P.S249. 14. Snopok B. A., Kostyukevich K. V., Lysenko S. I., Lytvyn P. M., Lytvyn O. S., Mamykm S. V., Zynyo S. A., Shepelyavyj P. E., Venger E. F., Kostyukevich S. A. Shirshov Yu. M. // Semicond. Phys. Quant. Electron. Optoelectr. - 2001 V. 4, No. 1. - P. 56. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вуп. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Ки'ів-42, 01601