Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, який включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить UA 105304 C2 (12) UA 105304 C2 мінеральні солі і гліцерин як джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що у середовище вносять сульфат міді в кількості, що складає від 0,15 до 0,17 мкмоль/л, сульфат цинку в кількості, що складає від 37 до 39 мкмоль/л, та хлорид калію в кількості, що складає від 0,20 до 0,22 ммоль/л. UA 105304 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С21N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі попередників синтезу і факторів росту, а також невисокий вихід цільового продукту від субстрату (до 48 %). Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 [Пат. 53109 UA, МПК - С21R 1/38. Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Антонюк С.І., Щербина О.В. Опубл. 27.09.2010, Бюл. 18]. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (кількість грам ПАР, синтезованих 1 г біомаси). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання ПАР, який підвищує синтез поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і гліцерин як джерело вуглецю і енергії. Згідно з винаходом у середовище вносять сульфат міді (0,15-0,17 мкмоль/л), сульфат цинку (37-39 мкмоль/л) і хлорид калію (0,200,22 ммоль/л). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення у середовище з гліцерином сульфату міді (0,150,17 мкмоль/л), сульфату цинку (37-39 мкмоль/л) і хлориду калію (0,20-0,22 ммоль/л) дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність у 2,1-2,2 разу (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH 2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4·7H2O - 0,1; а також CuSO4·5H2O (0,16 мкмоль/л), 2+ ZnSO4·7H2O (38 мкмоль/л) і KСl (0,21 ммоль/л); рН середовища 6,8-7,0. Сu добавляють у 2+ середовище у вигляді розчину CuSO4·5H2O концентрацією 4 мг/100 мл. Zn добавляють у + середовище у вигляді розчину ZnSO4·7H2O концентрацією 1,1 г/100 мл. K вносять у середовище у вигляді 1,6 %-ного розчину KСl. Як джерело вуглецю і енергії використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії для одержання інокуляту використовують 0,5 % (об'ємна частка) гліцерину. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 30 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність у 2,1-2,2 разу (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси). Приклад 1. Синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 за різних концентрацій катіонів міді і цинку у середовищі з гліцерином Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4·7H2O - 0,1; а також CuSO4·5H2O (0,14-0,18 мкмоль/л) і ZnSO4·7H2O (36-40 мкмоль/л); рН середовища 6,8-7,0. 2+ 2+ Сu і Zn вносять у середовище у вигляді розчинів CuSO 4·5H2O (4 мг/100 мл) і ZnSO4·7H2O (1,1 г/100 мл). Як джерело вуглецю і енергії гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO 4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії використовують 0,5 % (об'ємна частка) гліцерину. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 30°С упродовж 120 год. Біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на суху біомасу за калібрувальним графіком. 1 UA 105304 C2 5 10 15 Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію, як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. Показники росту і синтезу ПАР залежно від концентрації катіонів міді наведено у табл. 1. Таблиця 1 Вплив різних концентрацій катіонів міді і цинку на синтез ПАР за умов росту штаму IMB В-7241 на гліцерині Концентрація, мкмоль/л CuSO4·5H2O ZnSO4·7H2O 0 0 0,14 36 0,15 36 0,16 36 0,17 36 0,18 36 0,14 37 0,15 37 0,16 37 0,17 37 0,18 37 0,14 38 0,15 38 0,16 38 0,17 38 0,18 38 0,14 39 0,15 39 0,16 39 0,17 39 0,18 39 0,14 40 0,15 40 0,16 40 0,17 40 0,18 40 20 25 ПАР, г/л 1,5±0,07 1,6±0,08 1,7±0,09 1,7±0,09 1,6±0,08 1,7±0,09 1,7±0,09 1,6±0,08 1,7±0,09 1,8±0,09 1,8±0,09 1,7±0,09 1,7±0,09 1,8±0,09 1,8±0,09 1,7±0,09 1,7±0,09 1,6±0,08 1,7±0,09 1,8±0,09 1,8±0,09 1,6±0,08 1,7±0,09 1,7±0,09 1,6±0,08 1,7±0,09 Показники синтезу г ПАР/г біомаси 1,4±0,07 1,5±0,08 1,6±0,08 1,6±0,08 1,7±0,09 1,7±0,09 2,0±0,10 2,4±0,12 2,5±0,12 2,4±0,12 2,0±0,10 2,0±0,10 2,3±0,11 2,5±0,12 2,4±0,11 2,0±0,10 2,0±0,10 2,4±0,12 2,5±0,12 2,4±0,12 2,0±0,10 2,0±0,10 2,0±0,10 1,9±0,10 2,0±0,10 2,0±0,10 Як видно з наведених у табл. 1 даних, за наявності у середовищі з гліцерином катіонів міді у концентрації 0,15-0,17 мкмоль/л і катіонів цинку у концентрації 37-39 мкмоль/л ПАРсинтезувальна здатність підвищується в 1,7-1,8 разу порівняно з показником на середовищі без 2+ 2+ Сu і Zn . Приклад 2. Вплив різних концентрацій хлориду калію на синтез ПАР А. calcoaceticus IMB В7241 Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4·7H2O - 0,1; а також CuSO4·5H2O (0,16 мкмоль/л), ZnSO4·7H2O (38 мкмоль/л) і KСl (0,18-0,24 ммоль/л); рН 2 UA 105304 C2 2+ 5 10 15 середовища 6,8-7,0. Сu добавляють у середовище у вигляді розчину CuSO 4·5H2O 2+ концентрацією 4 мг/100 мл. Zn добавляють у середовище у вигляді розчину ZnSO 4·7H2O + концентрацією 1,1 г/100 мл. K вносять у середовище у вигляді 1,6 %-ного розчину KСl. Як джерело вуглецю і енергії використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії для одержання інокуляту використовують 0,5 % (об'ємна частка) гліцерину. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 30 °C упродовж 120 год. Визначення показників синтезу ПАР здійснюють як описано у прикладі 1. Дані щодо впливу концентрації хлориду калію на синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 наведено у табл. 2. Дані, наведені у табл. 2, засвідчують, що у разі внесення 0,20-0,22 ммоль/л хлориду калію у середовище з гліцерином ПАР-синтезувальна здатність є найвищою і досягає 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси. Цей показник в 1,8-1,9 разу перевищує такий на середовищі з гліцерином без сульфату міді, сульфату цинку і хлориду калію (див. табл. 1). Приклад 4. Вплив катіонів цинку на активність алкогольдегідрогеназ А. calcoaceticus IMB В7241 20 Таблиця 2 Синтез ПАР А. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від концентрації хлориду калію Концентрація KСl, ммоль/л 0,18 0,19 0,20 0,21 0,22 0,23 0,24 25 30 35 40 45 ПАР, г/л 1,9±0,10 2,0±0,10 2,1±0,11 2,2±0,11 2,1±0,11 1,9±0,10 1,9±0,10 г ПАР/ г біомаси 2,2±0,11 2,2±0,11 2,9±0,15 3,0±0,15 2,9±0,15 2,3±0,11 2,3±0,11 Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 0,35; NaCl - 1,0; Na2HPO4- 0,6; KН2РО4 - 0,14; MgSO4·7H2O - 0,1; а також CuSO4·5H2O (0,16 мкмоль/л), ZnSO4·7H2O (38 мкмоль/л) і KСl (0,21 ммоль/л); рН 2+ середовища 6,8-7,0. Сu добавляють у середовище у вигляді розчину CuSO 4·5H2O 2+ концентрацією 4 мг/100 мл. Zn добавляють у середовище у вигляді розчину ZnSO 4·7H2O + концентрацією 1,1 г/100 мл. K вносять у середовище у вигляді 1,6 %-ного розчину KСl. Як джерело вуглецю і енергії використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO 4·7H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії для одержання інокуляту використовують 0,5 % (об'ємна частка) гліцерину. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 30 °C упродовж 48 год. Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв, + 4 °C). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05 М K -фосфатним буфером (рН 7,0), центрифугуючи (4000 g, 15 хв 4 °C). Відмиті клітини ресуспендують в 0,05 М + K -фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнують ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 40 с при 4 °C на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000 g, 30 хв, 4 °C), осад відкидають, а надосадову рідину використовують як безклітинний екстракт. Активність піролохінолінхінон(ПХХ)-залежної гліцериндегідрогенази (КФ 1.1.99.22) визначали за відновленням дихлорфеноліндофенолу за присутності феназинметасульфату при 600 нм з гліцерином як донором електронів. Активність нікотинопротеїнової (НАД(Ф)Н-вмісної) алкогольдегідрогенази (КФ 1.1.99.36) вимірювали спектрофотометрично за відновленням 4-нітрозо-N,N-диметиланіліну (НДМА) при 440 нм з гліцерином як донором електронів. Дані щодо впливу катіонів цинку на активність алкогольдегідрогеназ наведено у табл. 3. 3 UA 105304 C2 Таблиця 3 Вплив катіонів цинку на активність алкогольдегідрогеназ A. calcoaceticus IMB В-7241 -1 Концентрація ZnSO4·7H2O у реакціонній суміші, мМ 0 0,01 0,05 0,10 5 -1 Активність (нмоль·хв ·мг білку) НДМА-залежна ПХХ-залежна алкогольдегідрогеназа гліцериндегідрогеназа 29±1,4 68±3,4 59±2,9 55±2,7 39±1,9 41±2,1 29±1,4 41±2,1 Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що катіони цинку (0,01-0,05 мМ) є активаторами НДМА-залежної алкогольдегідрогенази у штаму IMB В-7241, що й зумовлює позитивний вплив 2+ Zn на синтез поверхнево-активних речовин за умов росту бактерій на гліцерині. Отже, внесення у середовище з гліцерином сульфату міді (0,15-0,17 мкмоль/л), сульфату цинку (37-39 мкмоль/л) і KСl (0,20-0,22 ммоль/л) дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність A. calcoaceticus IMB В-7241 у 2,1-2,2 разу (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і гліцерин як джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що у середовище вносять сульфат міді в кількості, що складає від 0,15 до 0,17 мкмоль/л, сульфат цинку в кількості, що складає від 37 до 39 мкмоль/л, та хлорид калію в кількості, що складає від 0,20 до 0,22 ммоль/л. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4