Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: UA 81800 U UA 81800 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання метаболітів з поверхнево-активними і емульгувальними властивостями за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С12N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі попередників синтезу і факторів росту, а також невисокий вихід цільового продукту від субстрату (до 48 %). Найбільш близьким до запропонованої корисної моделі (найближчий аналог) є спосіб одержання ПАР за допомогою Acinetobacter calcoaceticus ІМВ В-7241 [Пат. 53109 UA, МПК С21R 1/38. Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Антонюк СІ., Щербина О.В. Опубл. 27.09.2010, Бюл. 18]. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (кількість грам ПАР, синтезованих 1 г біомаси). В основу корисної моделі поставлено задачу створення нового способу одержання ПАР, який підвищує синтез поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і етанол або гексадекан як джерело вуглецю і енергії. Згідно з корисною моделлю, у середовище вносять сульфат міді (0,15-0,17 мкмоль/л) і сульфат заліза (3,5-3,7 мкмоль/л). Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному. Внесення у середовище з етанолом або гексадеканом сульфату міді (0,15-0,17 мкмоль/л) і сульфату заліза (3,5-3,7 мкмоль/л) дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність у 2,1-2,2 рази (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO47H2O-0,1; а також CuSO45H2O (0,16 мкмоль/л) та FeSO47H2O 2+ (3,6 мкмоль/л); рН середовища 6,8-7,0. Сu додають у середовище у вигляді розчину 2+ CuSO45H2O концентрацією 4 мг/100 мл. Fe вносять у середовище у вигляді 1 % розчину FeSO47H2O. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus ІMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO47H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії для одержання інокуляту використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність у 2,1-2,2 рази (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси). Приклад 1. Синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 за різних концентрацій катіонів міді у середовищі з етанолом або гексадеканом Культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO47H2O-0,1; а також 2+ CuSO4-5H2O (0,14-0,18 мкмоль/л); рН середовища 6,8-7,0. Сu добавляють у середовище у вигляді розчину CuSO45H2O концентрацією 4 мг/100 мл. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A calcoaceticus ІМВ В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO 47H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Біомасу визначають за оптичною густиною клітинної суспензії з наступним перерахунком на суху біомасу за калібрувальним графіком. 1 UA 81800 U 5 10 15 Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСІ, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. Показники росту і синтезу ПАР залежно від концентрації катіонів міді наведено у табл. 1. Таблиця 1 Вплив концентрації катіонів міді на синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 Концентрація CuSO4-5H2O, мкмоль/л 0 0,14 0,15 0,16 0,17 0,18 20 25 30 35 ПАР (г/л) за умов росту на г ПАР/г біомаси за умов росту на етанолі гексадекані етанолі гексадекані 1,70±0,08 1,94±0,09 2,06±0,10 2,06±0,10 2,06±0,10 1,82±0,09 2,20±0,11 2,36±0,12 2,51±0,13 2,51±0,13 2,51±0,13 2,36±0,12 1,4±0,07 1,6±0,08 1,7±0,09 1,7±0,09 1,7±0,09 1,5±0,08 1,4±0,07 1,5±0,08 1,6±0,08 1,6±0,08 1,6±0,08 1,5±0,08 Як видно з наведених у табл. 1 даних, у разі внесення досліджуваних концентрацій катіонів міді у середовище з етанолом або гексадеканом концентрація синтезованих ПАР і ПАРсинтезувальна здатність підвищуються, проте різниця показників синтезу ПАР на середовищі з 2+ Сu і без катіонів міді є статистично недостовірною. Приклад 2. Вплив різних концентрацій катіонів заліза на синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В7241 Культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO47H2O-0,1; а також 2+ FeSO4-7H2O (3,4-3,8 мкмоль/л); рН середовища 6,8-7,0. Fe вносять у середовище у вигляді 1 % розчину FeSO47H2O. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus ІМВ В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO47H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Визначення показників синтезу ПАР здійснюють як описано у прикладі 1. Дані щодо впливу концентрації катіонів заліза на синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 наведено у табл. 2. 2 UA 81800 U Синтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 залежно від концентрації катіонів заліза Концентрація FeSO4-7H2O, мкмоль/л 0 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 5 10 15 20 ПАР (г/л) за умов росту на етанолі гексадекані 1,70±0,08 2,20±0,11 1,82±0,09 2,36±0,12 1,94±0,09 2,36±0,12 1,94±0,09 2,51±0,13 1,82±0,09 2,36±0,12 1,82±0,09 2,36±0,12 г ПАР/г біомаси за умов росту на етанолі гексадекані 1,4±0,07 1,4±0,07 1,5±0,08 1,5±0,08 1,6±0,08 1,5±0,08 1,6±0,08 1,6±0,08 1,5±0,08 1,5±0,08 1,5±0,08 1,5±0,08 Дані, наведені у табл. 2, засвідчують, що у разі внесення досліджуваних концентрацій катіонів заліза у середовище з етанолом або гексадеканом концентрація синтезованих ПАР і ПАР-синтезувальна здатність підвищуються, проте різниця показників синтезу ПАР на 2+ середовищі з Fe і без катіонів заліза є статистично недостовірною. Приклад 3. Біосинтез ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 за наявності у середовищі з етанолом і гексадеканом катіонів міді і заліза Культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4- 0,14; MgSO47H2O 0,1; а також CuSO45H2O (0,14-0,18 мкмоль/л) та FeSO47H2O (3,4-3,8 мкмоль/л); рН середовища 6,8+ 7,0. Сu добавляють у середовище у вигляді розчину CuSO 4-5H2O концентрацією 4 мг/100 мл. 2+ Fe вносять у середовище у вигляді 1 % розчину FeSO47H2O. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол або гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus IMB В-7241 з експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з FeSO 47H2O (36 мкмоль/л). Як джерело вуглецю та енергії використовують 0,5 % (об'ємна частка) етанолу або гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 120 год. Визначення показників синтезу ПАР здійснюють як описано у прикладі 1. Показники росту і синтезу ПАР залежно залежно від концентрації катіонів міді і заліза наведено у табл. 3. 3 UA 81800 U Таблиця 3 Вплив різних концентрацій катіонів міді і заліза на синтез ПАР за умов росту штаму ІМВ В-7241 на етанолі і гексадекані Концентрація, мкмоль/л CuSO45H2O FeSO47H2O 0 0 0,14 3,4 0,15 3,4 0,16 3,4 0,17 3,4 0,18 3,4 0,14 3,5 0,15 3,5 0,16 3,5 0,17 3,5 0,18 3,5 0,14 3,6 0,15 3,6 0,16 3,6 0,17 3,6 0,18 3,6 0,14 3,7 0,15 3,7 0,16 3,7 0,17 3,7 0,18 3,7 0,14 3,8 0,15 3,8 0,16 3,8 0,17 3,8 0,18 3,8 5 10 15 20 25 г ПАР/ г біомаси за умов росту на етанолі гексадекані 1,4±0,07 1,4±0,07 1,9±0,10 1,8±0,09 1,9±0,10 1,8±0,09 2,0±0,10 1,9±0,10 2,0±0,10 1,9±0,10 2,1±0,10 2,1±0,10 2,0±0,10 2,0±0,10 2,9±0,15 2,9±0,15 2,9±0,15 3,0±0,15 2,9±0,15 3,0±0,15 2,3±0,11 2,2±0,11 2,1±0,10 2,2±0,11 2,9±0,15 3,0±0,15 3,0±0,15 3,0±0,15 2,9±0,15 3,0±0,15 2,2±0,11 2,3±0,11 2,1±0,10 2,3±0,11 2,9±0,15 3,0±0,15 3,0±0,15 2,9±0,15 2,9±0,15 2,9±0,15 2,3±0,11 2,2±0,11 2,1±0,10 2,2±0,11 2,3±0,11 2,2±0,11 2,3±0,11 2,3±0,11 2,3±0,11 2,1±0,10 2,0±0,10 2,1±0,10 Як видно з даних, наведених у табл. 3, за одночасної наявності катіонів міді (0,15-0,17 мкмоль/л) і заліза (3,5-3,7 мкмоль/л) у середовищі з етанолом і гексадеканом показники синтезу ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 підвищуються порівняно з такими на середовищі без цих катіонів (найближчий аналог). Приклад 4. Вплив катіонів міді і заліза на активність ферментів біосинтезу ПАРА calcoaceticus ІМВ В-7241 Культивування A. calcoaceticus ІМВ В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO-0,35; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4×7H2O-0,1; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю і енергії використовують етанол у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру A. calcoaceticus ІМВ В-7241 із експоненційної фази (48 год. росту), вирощену на рідкому середовищі наведеного вище складу з 0,5 % (об'ємна частка) етанолу. Кількість посівного матеріалу становить 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють у колбах об'ємом 750 мл з 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 30 °C упродовж 48 год. Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв, + 4 °C). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05 М К - фосфатним буфером (рН 7,0), центрифугуючи (4000 g, 15 хв. 4 °C). Відмиті клітини ресуспендують в 0,05 М + К - фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнують ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 40 с. при 4 °C на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000 g, 30 хв, 4 °C), осад відкидають, а надосадову рідину використовують як безклітинний екстракт. + Активність НАДФ - залежної глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) визначають за відновленням + НАДФ при 340 нм за присутності ізоцитрату і 2-оксоглутарату відповідно, фосфоенолпіруват(ФЕП)синтетази (систематична назва ферменту - піруват, вода дикіназа; КФ 2.7.9.2) - за швидкістю утворення пірувату, яку аналізують за окисненням НАДН при 340 нм у 4 UA 81800 U 5 спряженій реакції з лактатдегідрогеназою, ФЕП-карбоксикінази (КФ 4.1.1.49) - за швидкістю утворення малату з оксалоацетату, яку визначають за окисненням НАДН при 340 нм у спряженій реакції з малатдегідрогеназою. FeSO47H2O і CuSO45H2O вносили у реакційну суміш у концентрації (0,01-0,1 мМ). Дані щодо впливу катіонів на активність ферментів біосинтезу поверхнево-активних аміно+ (НАДФ -залежна глутаматдегідрогеназа) і гліколіпідів (ФЕП-синтетаза і ФЕП-карбоксикіназа) наведено у табл. 4. Таблиця 4 Активність ферментів біосинтезу ПАР A. calcoaceticus ІМВ В-7241 залежно від концентрації катіонів міді і заліза -1 Концентрація FeSO4-7H2O, мМ 0 0,01 0,05 0,10 0 0 0 10 -1 Активність, нмольхв мг білка Концентрація + ФЕПНАДФ -залежна CuSO4-5H2O, мМ ФЕП-синтетаза карбоксикіназа глутаматдегідрогеназа 0 959±47 342±17 340±17 0 890±44 411±20 680±34 0 411±20 136±7 340±17 0 274±13 136±7 168±8 0,01 1838±92 345±17 676±33 0,05 1930±96 340±17 810±40 0.10 1946±92 320±16 405±20 Дані, наведені у табл. 4, засвідчують, що катіони міді і заліза (у певних концентраціях) є активаторами ферментів біосинтезу ПАР у штаму ІМВ В-7241. Отже, внесення у середовище з етанолом чи гексадеканом сульфату міді (0,15-0,17 мкмоль/л) і сульфату заліза (3,5-3,7 мкмоль/л) дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність A. calcoaceticus ІМВ В-7241 у 2,1-2,2 рази (до 2,9-3,0 г ПАР/г біомаси). 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і етанол або гексадекан як джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що у середовище вносять сульфат міді (0,15-0,17 мкмоль/л) і сульфат заліза (3,5-3,7 мкмоль/л). Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5