Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, де як джерело вуглецю та енергії використовують UA 105711 C2 (12) UA 105711 C2 суміш гексадекану і гліцерину у молярному співвідношенні 1:7, а концентрація гексадекану і гліцерину становить 0,59-0,61 об. % і 0,83-0,85 об. % відповідно. UA 105711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловостях. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 [Пат. 92819 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Шулякова М.О. Опубл. 10.12.2012, Бюл. № 23], який передбачає культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і етанол або гексадекан як джерело вуглецю і енергії. Для підвищення концентрації ПАР та скорочення тривалості культивування продуцента на початку стаціонарної фази росту у середовище з етанолом чи гексадеканом вносять 0,2-0,25 % фумарату і 0,1-0,15 % цитрату. Недоліком цього способу є недостатньо висока умовна концентрація поверхнево-активних речовин. В основу винаходу покладено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує умовну концентрацію ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Згідно винаходу як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану і гліцерину у молярному співвідношенні 1:7, а концентрація гексадекану і гліцерину становить (%, об'ємна частка) 0,59-0,61 і 0,83-0,85 відповідно. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю та енергії суміші гексадекану (0,59-0,61 %, об'ємна частка) і гліцерину (0,83-0,85, об'ємна частка) у молярному співвідношенні 1:7 дає змогу підвищити в 1,4-2,2 рази (до 7,2) умовну концентрацію ПАР порівняно з вирощуванням на відповідних моносубстратах. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3-1,3; MgSO4 × 7H2O0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4 × 7H2O-0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану та гліцерину об'ємною часткою 0,60 і 0,84 % відповідно. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити в 1,4-2,2 рази (до 7,2) умовну концентрацію ПАР порівняно з вирощуванням на відповідних моносубстратах. Приклад 1. Теоретичний розрахунок оптимального молярного співвідношення гліцерину та гексадекану у середовищі культивування штаму IMB Ас-5017 Для встановлення співвідношення концентрацій гексадекану й гліцерину в середовищі культивування R. erythropolis IMB Ас-5017 необхідно було: 1) розрахувати енергетичні потреби синтезу біомаси і трегалозоміколатів на енергетично-дефіцитному субстраті; 2) визначити концентрацію енергетично-надлишкового субстрату, яка б компенсувала втрати вуглецю гліцерину при його окисненні до СО2 з метою отримання енергії для конструктивного метаболізму. При проведенні розрахунків нами було зроблено такі припущення: 1) гексадекан використовується переважно як джерело енергії, а на синтез біомаси і трегалозоміколатів витрачається вуглець гліцерину; 2) міколовою кислотою є 3-гідрокси-2-додеканоїлдокозанова кислота, яка містить 34 атоми вуглецю; 4) співвідношення Р/О дорівнює 2. Затрати енергії на синтез трегалозофосфату. По одному моль АТФ витрачається на утворення дигідроксіацетонфосфату та 1,3-дифосфогліцерату, по два моля АТФ - на синтез ФЕП та триозофосфату при глюконеогенезі. Оскільки для утворення однієї молекули трегалози потрібно чотири молекули фосфогліцерату, на синтез яких необхідно 8 молекул гліцерину, то 1 UA 105711 C2 5 10 15 20 25 витрата енергії складе 28 АТФ. Крім того, один моль АТФ використовується при утворенні нуклеозиддифосфатсахариду (глюкозо-6-фосфат → УДФ-глюкоза). Таким чином, енергетичні потреби на синтез треголозо-6-фосфату з гліцерину складають 29 моль АТФ. Затрати енергії на синтез міколових кислот. Синтез жирних кислот відбувається таким чином: з ацетил-КоА і СО2 шляхом АТФ - залежної реакції утворюється малоніл-КоА, а далі в результаті трьох послідовних реакцій синтезується бутирил-КоА. Утворений бутирил-КоА взаємодіє з наступною молекулою малоніл-КоА до утворення СН3-(СН2)4-CO-SKoA. В наступному циклі утворюється СН3-(СН2)6-CO-SKoA. Таким чином, у результаті послідовного нарощування двовуглецевих фрагментів на ацетил-КоА синтезуються вищі жирні кислоти у вигляді відповідних ацил-КоА. Відповідно, для синтезу 3-гідрокси-2-додеканоїлдокозанової кислоти необхідно 16 таких циклів. Оскільки в одному циклі витрачається 1 моль АТФ і для утворення С34 - кислоти необхідно 17 моль ацетил-КоА, на синтез яких з гліцерину витратиться 17 моль АТФ, енергетичні витрати при синтезі однієї молекули міколової кислоти складуть 16+17=33 моль АТФ. Генерація АТФ при синтезі трегалозоміколатів з гліцерину. Енергія генерується лише при утворенні ацетил-КоА. Сумарна реакція утворення ацетил-КоА з гліцерину: Гліцерин → Ацетил-КоА + АТФ + 2НАДН (1) Оскільки в перетворенні беруть участь 17 моль ацетил-КоА для синтезу міколової кислоти: 17Гліцерин → 17Ацетил-КоА + 17АТФ + 34НАДН (2) та 8 моль - для синтезу трегалозофосфату: 8 Гліцерин → 8Ацетил-КоА + 8АТФ + 12 НАДН + 4 ФАДН (3) запишемо рівняння (1) наступним чином: 25Гліцерин → 25Ацетил-КоА + 25АТФ + 50НАДН + 4 ФАДН (4) З урахуванням Р/О=2, при утворенні однієї молекули трегалозоміколату генерація енергії складає 137 молекул АТФ. Отримані дані щодо витрати та генерації енергії в процесі синтезу трегалозоміколатів з гліцерину можна представити у вигляді табл. 1. Таблиця 1 Енергетичні потреби синтезу ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 з гліцерину Витрата гліцерину, моль 25 30 35 40 45 50 Затрати енергії, моль АТФ На синтез На моль використаного ПАР гліцерину 62 2,48 Генерація енергії, моль АТФ На синтез На моль використаного ПАР гліцерину 137 5,48 Отже, генерація енергії, яка може бути використана на утворення біомаси складе 5,482,48=2,52 моль АТФ/моль використаного гліцерину. Енергетичні витрати при синтезі біомаси. Синтез біомаси з фосфогліцеринової кислоти ключового інтермедіату синтезу всіх клітинних компонентів - можна записати у вигляді рівняння: 4ФГК + NH3+29АТФ + 5,5НАД(Ф)Н → (C4H8O2N). (5) Сумарні реакції перетворення гліцерину та гексадекану в ФГК: Гліцерин → ФГК + НАД(Ф)Н, (6) Гексадекан + 5АТФ → 4ФГК + 16НАД(Ф)Н + 11ФАДН2 + С02.(7) Для Р/О=2 рівняння (6) і (7) набувають вигляду: Гліцерин → ФГК + 2АТФ, (8) Гексадекан → 4ФГК + 38АТФ. (9) Виходячи з рівняння синтезу біомаси з ФГК (рівняння (5)) та рівняння катаболізму гліцерину (рівняння (8)), можна порахувати, що потреба в АТФ для синтезу біомаси складає 8 моль АТФ/моль гліцерину. Ця енергія може бути отримана з гексадекану. Враховуючи, що при синтезі ПАР з гліцерину генерується 3 моль АТФ на моль використаного гліцерину, за рахунок гексадекану повинно бути отримано 8-3=5 моль АТФ. З рівняння (9) виходить, що для отримання такої кількості енергії потрібно 0,13 моль гексадекану. Відповідно, співвідношення гексадекану і гліцерину в середовищі повинно бути 0,13:1, тобто 1:7,7. Приклад 2. Синтез ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 залежно від молярного співвідношення гексадекану і гліцерину у середовищі культивування Культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3-1,3; MgSO4 × 7H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO4 × 7H2O-0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану 2 UA 105711 C2 5 10 15 20 (0,5 %, об'ємна частка) та гліцерину (0,6; 0,7; 0,8; 0,9 %, об'ємна частка) у молярному співвідношенні 1:6; 1:7; 1:8; 1:9 відповідно. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Поверхневий натяг (σs) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності σ s від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Експериментально встановлено, що показники умовної концентрації ПАР корелюють зі зміною молярного співвідношення концентрацій енергетично нерівноцінних субстратів у суміші в процесі вирощування R. erythropolis ІMB Ас-5017 (табл. 2). Але за співвідношення 1:8 ці показники знижуються і за 1:9 спостерігаються найнижчі абсолютні та відносні показники синтезу ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017. Ймовірно, що в даному випадку підвищення вмісту ростових субстратів у середовищі спричиняє інгібуючу дію на синтез та активність ключових ферментів метаболізму, а отже, і на ефективність перетворення вуглецю в ПАР. Таблиця 2 Синтез ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 за різного молярного співвідношення концентрацій гексадекану та гліцерину у суміші Співвідношення моносубстратів 1:6 1:7 1:8 1:9 ПАР*, % від контролю гліцерин гексадекан 169,8±8,49 107,1±5,36 221,6±11,08 137,5±6,87 162,1±8,11 104,4±5,22 131,6±6,58 81,5±4,08 ПАР* 4,50±0,23 6,05±0,30 4,70±0,24 3,75±0,19 Примітка. Контролі (100 %) - показники синтезу на відповідних моносубстратах, у яких концентрація вуглецю еквімолярна концентрації змішаного субстрату. 25 30 35 40 На нашу думку, незначну невідповідність між експериментальним та теоретичним значенням можна пояснити тим, що синтезовані R. erythropolis ІMB Ас-5017 ПАР - це складний комплекс трегалозоміколатів, нейтральних і фосфоліпідів, причому точний вміст цих складових в утворюваних ПАР невідомий, у той час як розрахунки проводились лише для трегалозоміколату. Отже, за умов росту штаму Ас-5017 на суміші гексадекану і гліцерину спостерігаються за молярного співвідношення концентрації моносубстратів 1:7. Приклад 3. Вплив концентрації гексадекану і гліцерину у суміші на синтез ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 Культивування штаму ІMB Ас-5017 здійснюють на середовищі, склад якого наведено у прикладі 2. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану (0,5-0,8 %, об'ємна частка) та гліцерину (0,7-1,12 %, об'ємна частка) у молярному співвідношенні 1:7. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Умовну концентрацію ПАР визначають як описано у прикладі 2. Дані про синтез ПАР за умов росту штаму ІMB Ас-5017 на суміші гексадекану і гліцерину (молярне співвідношення 1:7) залежно від концентрації моносубстратів у суміші наведено у табл. 3. 3 UA 105711 C2 Таблиця 3 Залежність синтезу ПАР R. erythropolis ІMB Ас-5017 від концентрації моносубстратів у суміші Концентрація, об'ємна частка гексадекану гліцерину 0,50 0,70 0,55 0,77 0,59 0,83 0,60 0,84 0,61 0,85 0,65 0,91 0,70 0,98 0,80 1,12 ПАР* 6,05±0,30 6,30±0,31 7,20±0,36 7,20±0,36 7,20±0,36 6,40±0,32 6,50±0,32 6,50±0,32 ПАР* за умов росту на гліцерині гексадекані 2,90±0,14 4,70±0,23 3,00±0,15 4,70±0,23 3,27±0,16 5,10±0,25 3,27±0,16 5,10±0,25 3,27±0,16 5,10±0,25 3,10±0,13 4,85±0,24 2,96±0,15 4,64±0,23 2,96±0,15 4,64±0,23 Примітка. Молярне співвідношення гексадекану і гліцерину у всіх варіантах становить 1:7. 5 10 15 Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що найвищі показники синтезу ПАР (умовна концентрація поверхнево-активних речовин 7,2) спостерігаються за концентрації гексадекану у суміші (%, об'ємна частка) 0,59-0,61 і 0,83-0,85 відповідно. Отже, використання запропонованого способу дає змогу підвищити в 1,4-2,2 рази (до 7,2) умовну концентрацію ПАР порівняно з вирощуванням штаму ІMB Ас-5017 на відповідних моносубстратах. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Rhodococcus erythropolis IMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану і гліцерину у молярному співвідношенні 1:7, а концентрація гексадекану і гліцерину становить 0,59-0,61 об. % і 0,83-0,85 об. % відповідно. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4