Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Rhodococcus 3 підтримання концентрації розчиненого кисню на рівні 65-70% від насичення повітрям дає змогу скоротити тривалість культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 до 50год. Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування R. erythropolis IMB Ac5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 1,3; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,14; MgSO4 x 7H2O - 0,1; FeSO4 x 7H2O - 0,001г/л) рН 6,8-7,0. Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis IMB Ac-5017 з середини експоненційної фази, вирощену на рідкому середовищі з 1,0% (об'ємна частка) гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 10% від об'єму середовища. Початкова концентрація гексадекану у середовищі становить 0,2-0,3% (об'ємна частка). Надалі через 5-6год культивування здійснюють дробне внесення гексадекану порціями по 0,3-0,4% до кінцевої концентрації 2,0-2,2%. Культивування бактерій здійснюють у ферментаторі АК-210 об'ємом 10л (робочий об'єм 7л), при 25° С, упродовж 50год. На початку процесу культивування швидкість перемішування становить 250об/хв, витрати повітря 0,2л/л хв. У процесі культивування швидкість перемішування підвищують до 380-400об/хв, а витрати повітря до 1,2л/л хв, для підтримання концентрації розчиненого кисню (рО2) на рівні 65-70% (від насичення повітрям). Використання нового способу дає змогу скоротити тривалість культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 з 60 до 50год. 52821 4 Приклад 1. Вплив концентрації розчиненого кисню на синтез ПАР за умов росту R. erythropolis IMB Ac-5017 на гексадекані Культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 здійснюють у ферментаторі АК-210 в умовах, описаних вище, на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): КNО3 - 1,0; NaCI - 1,0; NазНРO4 - 0,6; КН2РO4 - 0,14; MgSO4 x 7H2O - 0,1, FeSO4 x 7H2O - 0, 001, pH 6,8-7,0. Концентрацію розчиненого кисню упродовж культивування підтримують на рівні 50-80%. Синтез ПАР оцінюють за показником умовної концентрація ПАР (ПАР*), який визначають як ступінь розведення вільної від клітин культуральної рідини у точці збільшення поверхневого натягу на кривій залежності поверхневого натягу від логарифму значення розведень. Абсциса точки перетину кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР та виражається в безрозмірних одиницях. Показники синтезу ПАР залежно від концентрації розчиненого кисню у середовищі культивування наведено у табл. 1. Таким чином, за підтримання рО2 на рівні 5080% упродовж процесу культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 умовна концентрація ПАР є практично однаковою, проте за концентрації розчиненого кисню 65-70% тривалість культивування скорочується до 55год. Таблиця 1 Залежність синтезу ПАР R. erythropolis IMB Ac-5017 від концентрації розчиненого кисню Концентрація розчиненого кисню, % 50-60 (прототип) 65-70 75-80 Приклад 2. Вплив катіонів калію і натрію на активність алкангідроксила-зи R. erythropolis IMB Ac5017 Бактерії вирощують на рідких мінеральних середовищах такого складу (г/л), середовище 1: КNO3 - 1,0; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 0,14; MgSO4 x 7H2O - 0,1, FeSO4 x 7H2O - 0, 001, pH 6,8-7,0. У середовищі 2 нітрат калію замінений на еквімолярну за азотом концентрацію нітрату натрію (1,3г/л). Концентрація катіонів натрію і калію у середовищі 2 становить 36 і 1мМ відповідно. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан у концентрації 1% (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48год), вирощену на середовищах наведеного вище складу з 0,3% гексадекану. Вирощування бактерій здійснюють у колбах об'ємом 750мл зі 100мл середовища на качалці (220об/хв) при 30 С упродовж 72год. Тривалість культивування, год 60 55 60 ПАР* 6,3 6,3 6,2 Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину, одержану після культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 на рідкому середовищі з гексадеканом, обробляють гексаном для видалення залишків гексадекану, після чого відділяють клітини бактерій фільтруванням під вакуумом. Осад клітин на паперовому фільтрі послідовно (під вакуумом) промивають гексаном і 0,05 М К+ - фосфатним буфером (pH 7,0). Відмиті клітини ресуспендують у 0,05 М К+ - фосфатному буфері (pH 7,0) і руйнують ультразвуком (22кГц) 4 рази по 60 с при 4°С на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000g, 30хв, 4°С), осад відкидають, а надосадову рідину використовують як безклітинний екстракт. Активність алкангідроксилази (КФ 1.14.15.3) визначають спектрофотометричне за окисненням НАДФН при 340 нм з використанням гексадекану як донора електронів. Дані щодо активності алкангідроксилази за присутності різних концентрацій калію і натрію у реакційній суміші наведено у табл. 1. Таблиця 2 5 52821 6 Вплив катіонів калію і натрію на активність алкангідроксилази R. erythropolis IMB Ac-5017Концентрація у реакційній суміші, мМ + К" Na 0 0 25 0 50 0 100 0 0 25 0 50 0 100 Активність (нмоль.хв1.мг-1 білка) за умов росту на середовищі 1 середовищі 2 194 698 Н.в. 116 Н.в. 232 Н.в. 232 242 Н.в. 300 Н.в. 240 Н.в. Примітка. Н.в. - не визначали. Як видно з наведених даних, алкангідроксилазна активність знижується у 3-6 рази за присутності 25-100мМ К+, у той час як за наявності 50мМ Na+ активність ферменту підвищується у 1,5 рази. За умов росту R. erythropolis IMB Ac-5017 на середовищі 2, в якому вміст катіонів калію і натрію становить 1 і 36мМ відповідно, активність алкангідроксилази найвища. Приклад 3. Синтез ПАР за умов росту R. erythropolis IMB Ac-5017 на середовищах різного складу Культивування R. erythropolis ЕК-1 здійснюють у ферментаторі АК-210 на середовищах 1 і 2, склад яких наведено вище. Як посівний матеріал використовують культуру R. erythropolis IMB Ac 5017 з середини експоненційної фази, вирощену на рідкому середовищі 1 або 2 з 1,0% (об'ємна частка) гексадекану. Кількість посівного матеріалу становить 10% від об'єму середовища. Початкова концентрація гексадекану становить 0,2-0,3% (об'ємна частка). Надалі через 5-6год культивування здійснюють дробне внесення гексадекану порціями по 0,3-0,4% до кінцевої концентрації 2,02,2%. Концентрацію розчиненого кисню упродовж культивування підтримують на рівні 65-70%. Рівень синтезу поверхнево-активних речовин під час культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 на середовищах різного складу наведено у табл. 3. Таблиця 3 Залежність синтезу ПАР R. erythropolis IMB Ac-5017 від складу поживного середовища Джерело азоту у середовищі КNО3 (середовище 1) NaNO3 (середовище 2) Тривалість культивування, год 55 50 ПАР* 6,3 6,3 Примітка. Концентрації нітрату калію і нітрату натрію еквімолярні за азотом. Таким чином, заміна у середовищі культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 нітрату калію на еквімолярну за азотом концентрацію нітрату натрію дає змогу скоротити тривалість процесу біосинтезу на 5год. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Отже, використання запропонованого способу дає змогу скоротити з 60 до 50год + тривалість культивування R. erythropolis IMB Ac-5017 у ферментаторі АК-210. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601