Спосіб виділення фактора згортання крові іх

Реферат: Винахід належить до галузі біотехнології - одержання очищених білкових препаратів, і може бути використаний в медико-біологічній промисловості, на станціях переливання крові, а також у науково-дослідних лабораторіях. Спосіб полягає в одержанні препарату очищеного фактора IX згортання крові людини методом афінної хроматографії на кремнеземних сорбентах, з лігандами - триазиновими барвниками. UA 107382 C2 (12) UA 107382 C2 UA 107382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі біотехнології - одержання очищених білкових препаратів, - і може бути використаний у медико-біологічній промисловості, на станціях переливання крові, а також у науково-дослідних лабораторіях. Дане дослідження стосується способу виділення очищеного фактора IX згортання крові людини і, переважно, способу виділення очищеного фактора IX коагуляції крові людини методом біоспецифічної афінної хроматографії. Препарат фактора IX згортання крові використовують як терапевтичний засіб при замісній терапії для профілактики та лікування хворих на гемофілію форми В у медичній практиці. Лікування цього захворювання полягає у введенні хворим із зменшеним рівнем фактора IX недостатнього фактора IX. Джерелом цього фактора є свіжозаморожена плазма, а також препарати протромбінового комплексу (РСС), одержані шляхом фракціонування плазми чи кріосупернатанту (містять фактори II, VII, IX, X, білок С та білок S). Такі препарати довший час були практично єдиними засобами лікування гемофілії В і виготовлялись станціями переливання крові. До складу цих препаратів, крім самого фактора IX, може входити різна кількість домішкових білків: альбумін, фібриноген, фактори II, V, X та інші стабілізуючі агенти. Клінічні застосування таких препаратів часто призводять до випадків венозного тромбоутворення і ДВС-синдрому. Така непередбачувана реакція-відповідь може виникнути внаслідок гіперкоагуляції, що підсилюється високим рівнем домішкових білків, які вводяться паралельно із застосуванням концентрату фактора IX, або присутності інших тромбогенних компонентів у їх складі, чи внаслідок спонтанної активації факторів РСС [1]. Як відповідь на лікування препаратами концентратів, у випадку гемофілії В і гемофілії А часто виникає імуносупресія, що свідчить в обох випадках про небажане забруднення концентратів білковими домішками - так звана інгібіторна форма гемофілії. У зв'язку з цим, виникає необхідність вдосконалення методу розділення вітамін К-залежних факторів згортання з метою зменшення чи повного уникнення таких проблем [2]. Відомо, що вміст фактора IX у плазмі крові людини є досить низьким і його концентрація складає приблизно 5 мг/л або 0,09 мкМ. При цьому його питома активність становить 0,01 МО/мг загального білка [3]. Тому існуючі методи отримання фактора IX на початковому етапі зводяться до його концентрування. Найчастіше застосовують іоно-обмінну хроматографію, хоча такий спосіб є неселективним, і в ході цього процесу концентруються інші білки, у тому числі компоненти протромбінового комплексу. При двостадійній технології отримання концентрату фактора IX другим етапом очистки найчастіше є хроматографія (афінна, гідрофобна та ін.), що базується на використанні інших властивостей досліджуваного білка. Відомий спосіб [4], що об'єднує дві послідовні хроматографії: з аніоно-обмінником, на якому отримують протромбіновий комплекс, і афінну хроматографію на гепарин-сефарозі. Питома активність фактора в кінцевому препараті становить приблизно 130 МО/мг білка, однак і цих двох етапів недостатньо для отримання високоочищеного білкового препарату. Тому пошук додаткових засобів очищення фактора IX і досі становить важливе завдання для наукових досліджень. Згідно з нашими дослідженнями, серед носіїв, що використовуються для хроматографічного виділення та очищення білкових препаратів, достатньо ефективними є макропористі кремнеземні матриці з регульованим розміром пор. Вони достатньо жорсткі, хімічно інертні, термостійкі, а хроматографічні сорбенти на їх основі легко регенеруються, витримують високу швидкість пропускання розчинів із достатньою специфічною ємкістю відносно до досліджуваних білків, не піддаються гідролізу мікроорганізмами [5-7]. Найближчим за сукупністю ознак, подібних до сукупності суттєвих ознак даного винаходу, є спосіб одержання фактора IX з використанням афінного сорбенту [8], який полягає у пропусканні через колонку із сорбентом концентрату протромбінового комплексу. Koch та співавтори [8] демонструють, що зв'язування В-компонента комплементу та IХ фактора згортання з іммобілізованим барвником не блокується присутністю каприлової кислоти, що свідчить про негідрофобний характер такої взаємодії. Автори акцентували увагу на присутність активності в елюаті білків з 20 мМ концентрацією бензамідину, але не при 20 мМ концентрації гуанідину, тобто зв'язок має швидше біоспецифічний характер (комбінація багатьох взаємодій). Основним недоліком прототипу є використання органічної матриці в хроматографічному сорбенті, що зумовлює певні обмеження в застосуванні останнього: низька механічна жорсткість, що має негативний вплив на швидкість процесу хроматографії; невисока стійкість до 1 UA 107382 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 можливої деградації мікроорганізмами; проведення елюції бензамідином може мати негативний вплив на властивості кінцевого білкового препарату. Задачею нашого винаходу є отримання очищеного препарату фактора IX шляхом застосування одностадійного хроматографічного етапу. Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання антигемофільного фактора, що включає хроматографічний етап розділення білків протромбінового комплексу та елюції фактора IX з біоспецифічного афінного сорбенту. Відмінність запропонованого способу полягає у застосуванні методу афінної сорбції на кремнеземних сорбентах з лігандами - активними барвниками триазинової групи. Наявність у досліджуваного ферменту типового для серинових протеїназ активного центру дає підстави вважати можливим застосування барвників-лігандів з бензамідиноподібними залишками для виділення та очищення цього білка. Синтез кремнеземних сорбентів з іммобілізованими барвниками здійснювали згідно з роботою [9]. Кількісне визначення фактора IX проводили за одностадійною уніфікованою методикою [10] та із застосуванням хромогенного субстрату Pefachrome® IXa 3960 фірми Pentapharm (Швейцарія). 3 Приклад 1. На колонку, заповнену 25 см сорбенту Діасорб-Рrосіоn blue HB, врівноважену 10-100 мМ Tris-HCl буферним розчином з рН 7,2-8,2, поступово наносили 50 мл концентрату РСС, віддіалізованого проти цього ж буферу. Витримували протягом 1 год. при 4 °C для сорбції білків. Від незв'язаного білка колонку промивали 3 об'ємами робочого буферу. Домішкові білки видаляли 10-70 мМ трис-НСІ буфером, рН 7,2-8,2, з 5-25 % ізопропанолу (іРrо). Елюцію фактора IX проводили 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, що містив 0,05-0,50 М εамінокапронової кислоти (ε-АКК) та 0-25 % iРrо. У результаті отримували розчин із питомою активністю фактора IX (10-25 МО/мг б). Концентрацію білка та активність антигемофільного фактора визначали у фракції, в якій відзначали пік виходу білка. 3 Приклад 2. На колонку, заповнену 25 см сорбенту Діасорб-Рrосіоn blue MXR, врівноважену 10-100 мМ Tris-HCl буферним розчином з рН 7,2-8,2, поступово наносили 50 мл концентрату РСС, віддіалізованого проти цього ж буферу. Витримували протягом 1 год. при 4 °C. Від незв'язаного білка колонку промивали 3 об'ємами робочого буферу. Домішкові білки видаляли 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, з 5-25 % iРrо. Елюцію фактора IX проводили 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, що містив 0,05-0,50 М ε-амінокапронової кислоти (ε-АКК) та 025 % iРrо, отримуючи розчин із питомою активністю фактора IX (10-25 МО/мг б.). 3 Приклад 3. На колонку, заповнену 25 см сорбенту Діасорб-Рrосіоn Yellow HE3G, врівноважену 10-100 мМ Tris-HCl буферним розчином з рН 7,2-8,2, поступово наносили 50 мл концентрату РСС, віддіалізованого проти цього ж буферу. Витримували протягом 1 год. при 4 °C. Від незв'язаного білка колонку промивали 3 об'ємами робочого буферу. Домішкові білки видаляли 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, з 5-25 % іРrо. Елюцію фактора IX проводили 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, що містив 0,05-0,50 М ε-амінокапронової кислоти (ε-АКК) та 0-25 % iРrо, отримуючи розчин із питомою активністю фактора IX (10-15 МО/мг б.). 3 Приклад 4. На колонку, заповнену 25 см сорбенту Діасорб-Рrосіоn gelb M4R, врівноважену 10-100 мМ Tris-HCl буферним розчином з рН 7,2-8,2, поступово наносили 50 мл концентрату РСС, віддіалізованого проти цього ж буфера. Витримували протягом 1 год. при 4 °C. Від незв'язаного білка колонку промивали 3 об'ємами робочого буферу. Домішкові білки видаляли 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, з 5-25 % iРrо. Елюцію фактора IX проводили 10-70 мМ тріс-НСl буфером, рН 7,2-8,2, що містив 0,05-0,50 М ε-амінокапронової кислоти (ε-АКК) та 025 % iРrо, отримуючи розчин із питомою активністю фактора IX (10-25 МО/мг б.). На основі проведених досліджень складена схема способу одержання очищеного препарату антигемофільного фактора IX. Висновки: Застосування хроматографії на кремнеземних сорбентах із лігандами-активними барвниками можна рекомендувати як універсальний метод (основний чи додатковий) для виділення та очищення фактора IX. Питома ємність запропонованих сорбентів у 5,25 (декілька) разу вища порівняно з прототипом, що дозволяє за один технологічний цикл використати значно більшу кількість вихідної сировини для одержання препарату фактора IX. Елюцію фактора IX з питомою активністю близько 15 МО/мг білка здійснювали 10-100 мМ трис-НСl буферним розчином, в межах значень рН 7,2-8,2, що містив 0,25-0,50 М ε-АКК, 5-25 % іРrо. 2 UA 107382 C2 5 10 15 20 25 30 Електрофоретичні характеристики білків, одержаних на різних етапах фракціонування та в процесі хроматографічного розділення протромбінового комплексу, а також відомих комерційних препаратів фактора IX є однаковими за молекулярними масами та наближеними за ступенем очищення. Скорочення часу виділення фактора IX за рахунок здійснення хроматографічного процесу на макропористому кремнеземному сорбенті здешевлює пропонований спосіб, елюція фактора IX більш концентрованим піком спрощує наступні роботи технологічного процесу - діаліз, ліофілізацію, внаслідок чого покращуються аналітичні показники кінцевого продукту діагностичного чи лікувального препарату. Джерела інформації: 1. Патент Росії 2353386 С1, МПК, А61К 38/36. Способ получения концентрата IX фактора свертывания крови человека / А.А. Игонин, В.Ю. Уваров, Е.М. Пальцева, А.А. Иванов; "БиоГениус". - опубл. 27.04.2009. Бюл. № 12. 2. US Pat. 005445958 A. Process for purifying blood clotting factors / Feldman P.A. / Publ. 29.08.1995. 3. WO Pat. 2007/046631 Al Methods for manufacturing high purified factor IX / Kang Y., Choi Y.W., Son K.-W. et al. Publ. 26.04.2007. 4. US Pat. 832200, C12N9/64F2C21M22 Novel factor IX purification methods / Bonam D., Foster W.B., Costigan R.J. et al. Publ. 17.07.2008. 5. Биоспецифическая хроматография тромбина и урокиназы на кремнеземных сорбентах, модифицированных ингибиторами протеиназ / Магеровский Ю.В., Монастирский В.А., Гайда А.В., Даниш Т.В. / В кн.: "Хроматография в биологии и медицине". М. - 1986. - С. 183-184. 6. Affinity chromatography of human thrombin on modified silica /Gaida A.V., Monastyrskii V.A., Magerovskii Yu.V. et al. J. Chromatogr. - 1987. - V. 424, No. 2. - P. 385-391. 7. Патент України на корисну модель № 24182 від 25.06.2007 p., C12N 9/96, А61К 38/02. Спосіб виділення та очищення тромбіну / Магеровський Ю.В., Брагінець О.Г., Шурко Н.О., та ін. / Бюл. № 9, 2007 р. 8. Affinity chromatography of serine proteases on the triazine dye ligand Cibacron Blue F3G-A / Koch C, Borg L., Skjodt K., Houen G. Journal of Chromatography В.-1998. - V. 718. - P. 41-46. 9. Синтез кремнеземних сорбентів із лігандами - активними барвниками тріазинового ряду / Т.В. Даниш, М.І. Вороняк, Н.А. Дульцева, Н.О. Шурко // Вісник Львівського університету. Серія біологічна. - 2008. - В.47. - С. 63-69. 10. Баркаган З.С. Основы диагностики нарушений гемостаза / З.С. Баркаган, А.П. Момот - М. Изд-во: Ньюдиамед-АО. - 1999. - 217 с. 35 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 Спосіб виділення фактора IX згортання крові, який відрізняється тим, що концентрат протромбінового комплексу додатково очищують з використанням афінної сорбції на макропористих кремнеземних сорбентах з лігандами - активними триазиновими барвниками, вибраними з групи Procion blue HB, Procion blue MXR, Procion yellow HE3G, Procion gelb M4R, Активний яскраво-голубий К, та десорбції 10-70 мМ трис-НCl буфером, рН 7,2-8,2, що містить 0,05-0,50 М ε-амінокапронової кислоти та 0-25 % ізопропанолу. 3 UA 107382 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4