Спосіб очищення фактора згортання крові viii

Реферат: Спосіб очищення або збагачення фактора згортання крові FVIII з використанням хроматографії, який включає стадії забезпечення фракції, що містить FVIII, у водному розчині з високою іонною силою; приведення фракції, що містить FVIII, в контакт з багатомодальною смолою; необов'язкового промивання багатомодальної смоли, на яку абсорбований FVIII, водним промивальним буфером; елюювання фракцій, що містять FVIII, водним елююючим буфером, що містить, принаймні, одну амінокислоту, яка позитивно заряджена при величині рН 6-8; і необов'язкового збору фракцій, що містять FVIII, в очищеній або збагаченій формі. UA 100901 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується способу очищення фактора згортання крові VIII (далі використовують абревіатуру FVIII) і фракції, що містить, FVIII, яка може бути одержана відповідно до способу за даним винаходом. Передумови створення даного винаходу Гемофілія є групою спадкових генетичних розладів, які послаблюють здатність організму контролювати згортання крові або коагуляцію. У найбільш загальній формі, при гемофілії A спостерігається дефіцит згортання FVIII, і гемофілія A зустрічається у приблизно 1 з 5000-10000 новонароджених хлопчиків. Білок FVIII є найважливішим кофактором при коагуляції крові, який володіє здатністю виконувати безліч функцій. Дефіцит FVIII можна усувати за допомогою виділених із плазми концентратів FVIII або за допомогою FVIII, одержаного рекомбінантними методами. Лікування за допомогою концентратів FVIII дозволяє хворим на гемофілію вести нормальний спосіб життя. Історично гемофілію A лікували за допомогою FVIII, одержаного із плазми крові людини. У плазмі крові за нормальних умов молекула FVIII завжди зв'язується з її кофактором, фактором Віллебрандта (vWf), який додає молекулі FVIII стійкість до різних форм дегенерації. На ринку з'явилися виділені із плазми продукти на основі FVIII різного ступеня чистота, в якій присутні більші або менші кількості vWf. Як правило, продукти з невеликими кількостями vWf містять доданий альбумін людини або інші стабілізатори, зокрема включають підвищений вміст солі для стабілізації молекули FVIII. Способи, які використовують для очищення FVIII, зазвичай є поєднанням різних способів осадження, таких як кріоосадження, осадження за допомогою гідроксиду алюмінію і тому подібне, а також хроматографічні стадії, в основному стадії іонообмінної хроматографії, афінної хроматографії і гель-хроматографії. Для поліпшення продуктів на основі FVIII застосовували афінну хроматографію, яка ефективно видаляє домішки і дозволяє одержати FVIII високого ступеня чистоти, зокрема дозволяє понизити і вміст vWf (Farrugia et al., Biotechnology and plasma fractionation industry; The impact of advances in the production of coagulation FVIII. Biotechnology, Vol. 3, No. 1, February 1993). Недолік афінної хроматографії полягає в тому, що вона є порівняно дорогою, а також в тому, що моноклональні антитіла, які використовують в якості афінних лігандів, мають тваринне походження. В середині 80-х років спостерігалися випадки перенесення вірусів, пов'язані з продуктами на основі FVIII, виділеними із плазми. Не дивлячись на те, що вказана проблема була вирішена за рахунок застосування специфічних стадій видалення вірусу, вона з'явилася поштовхом для розробки рекомбінантних продуктів на основі FVIII (rFVIII). У 90-і роки на ринку з'явився перший продукт на rFVIII, і в даний час на ринку є три різні продукти rFVIII (дві повнорозмірні молекули і одна молекула з видаленим B-доменом, в якій неактивна частина молекули FVIII видалена, з метою підвищити продуктивність клітки-господаря (Eriksson et al., The manufacturing process for B-domain deleted recombinant FVIII. Seminars in Hematology, Vol. 38, No 2, Suppl. 4 (April), 2001: pp. 24-31)) високого ступеня чистоти (всі без vWf). Всі способи очищення, які використовують для очищення rFVIII, є поєднанням різних методів хроматографії (див. Bhattacharyya et al., оглядова стаття; Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies". CRIPS Vol.4, No.3, July-September 2003). Одним з них є добре відомий імуноафінний метод (навіть є речовини, що дозволяють вирішити вказану проблему, наприклад, речовини, що володіють спорідненістю до пептидів (Kelly et al., Development and validation of an affinity chromatography step using а peptide ligand for cGMP production of FVIII.), або виділені із дріжджів фрагменти антитіл (FVIII афінна смола VIIISelect-GE Health сare, каталожний № 17-5450, яка вже надходить на ринок), вживані для FVIII, виділеного із плазми. Оскільки у всіх продуктах rFVIII відсутній vWf, то певні заходи мають бути зроблені для стабілізації молекули FVIII з тим, щоб вона не втрачала своєї активності (стабілізації від агрегації, від протеаз, від абсорбції на поверхні і так далі). У один з продуктів додають хелатотворний агент (ЕДТК і тому подібне) з тим, щоб захистити FVIII від розкладання під дією металопротеаз (US-A-5831026). Стратегіями, які були випробувані для підвищення стійкості молекул rFVIII, є додавання альбуміну, апротиніну, інсуліну або навіть сумісна експресія rFVIII з vWf (з подальшим його видаленням на стадії очищення) (див. Bhattacharyya et al., оглядова стаття; Recombinant FVIII for Haemophilia "An overview of production technologies". CRIPS Vol. 4, No. 3, July-September 2003). Інша стратегія (для розробки процесу, в якому не використовуються добавки, одержані від ссавців, і хелатотворні агенти) приводиться в EP-A-1707634, де поєднання підвищеного вмісту солей призводить до стабілізації одержуваного rFVIII і збільшенню його виходу (Wang et.al, Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003), 1-15.). 1 UA 100901 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Проте вказаний метод має певні недоліки. Наприклад, відносний високий вміст солі робить вказаним спосіб непридатним для проведення прямої обробки в іонообміннику без розбавлення (і можливої дестабілізації, див. Parti et al., In vitro stability of recombinant FVIII. Haemophilia (2000), 6, 513-522. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 87, No. 3, Aug 5, 2004.). У WO-A-2009/007451 розкривається спосіб очищення FVIII з використання полімеру зі змішаною модальністю або багатомодальної смоли. Спосіб очищення заснований на взаємодії білка FVIII із смолою зі змішаною модальністю або багатомодальною смолою, що містить ліганди, які включають гідрофобну частину і негативно заряджену частину, і елююванні вказаного білка FVIII за допомогою елююючого буфера, який включає, принаймні, 1,5 М солі, щонайменше, 40 % (мас./об.) етилгліколя, пропіленгліколя або їх суміші і іони кальцію. У EP-A-1707634 розкривається спосіб виділення білків, одержаних рекомбінантними методами, зокрема такі способи, як імуноафінна хроматографія, афінна хроматографія, осадження білка, буферні обміни, іонообмінна хроматографія, хроматографія з гідрофобними взаємодіями, змішана хроматографія з гідрофобними взаємодіями/іонообмінна хроматографія, хроматографія з хелатоутворенням, вуглеводна афінна хроматографія, така як лектинова або гепаринова афінна хроматографія, ексклюзивна хроматографія, електрофорез, діаліз, використання різних осаджувачів, таких як поліетиленгліколь, сульфат амонію, етанол, адсорбція на гідроксиапатиті, адсорбція на мембранах, що фільтрують, застосування лігандів, пов'язаних з магнітними частинками, і так далі. Однак, він ідентифікує конкретні стадії хроматографічного очищення. У WO-A-2005-082483 розкритий спосіб очищення антитіл від однієї або більш ніж однієї домішки в рідині, який включає приведення вказаної рідини в контакт з першою хроматографічною смолою, що складається з основи, на яку імобілізовані багатомодальні ліганди, з метою абсорбції антитіл смолою, при цьому кожен багатомодальний ліганд містить, щонайменше, одну катіонообмінну групу і, щонайменше, одну ароматичну або гетероароматичну циклічну систему. Щоб вивільнити антитіла із смоли, додають елюат, і отриманий елюат вводять в контакт з другою хроматографічною смолою. У WO-A-2005/121163 розкритий спосіб виділення одного або декількох білків із розчину білка. Спосіб включає стадію одержання розчину білка, що містить один або більш специфічних білків і що має заздалегідь задану величину рН і заздалегідь задану іонну силу або провідність, стадію нанесення вказаного розчину білка на насадну колонку або розширену насадну колонку, що містить адсорбент, і отримання одного або більше за одного білка з колонки; де в білковий розчин доданий спирт. Опис винаходу Однією з цілей даного винаходу є усунення недоліків відомого з області техніки способу очищення за рахунок розробки нового способу. Іншою метою даного винаходу є спосіб очищення FVIII, зокрема, одержуваного з джерел, які містять багато солі, зокрема, в тому вигляді, в якому вони використовуються для приготування рекомбінантного FVIII. Вказані цілі досягаються в способі очищення фактора згортання крові FVIII за рахунок проведення послідовності стадій очищення за допомогою хроматографії, при цьому, принаймні, одну операцію хроматографії здійснюють з використанням багатомодальної смоли. Термін "багатомодальна смола" в даному описі означає вживану в хроматографії речовину, що включає основу і приєднані в основі функціональні групи, при цьому вказані функціональні групи взаємодіють з хімічними групами сполуки, яку необхідно виділити. У конкретному варіанті здійснення даного винаходу багатомодальна смола включає приєднані до матриці функціональні групи, і вказані функціональні групи здатні взаємодіяти з FVIII шляхом іонних взаємодій і інших типів взаємодій, таких як утворення водневих зв'язків і/або гідрофобна взаємодія. Відповідно до даного винаходу, пропонується спосіб очищення або збагачення фактора згортання крові FVIII з використанням хроматографії, який включає стадії забезпечення фракції, що містить FVIII, у водному розчині з високою іонною силою; приведення фракції, що містить FVIII, в контакт з багатомодальною смолою; необов'язкового промивання багатомодальної смоли, на яку абсорбований FVIII, водним промивальним буфером; елюювання фракцій, що містять FVIII, водним елююючим буфером, що містить, принаймні, одну амінокислоту, яка позитивно заряджена при рН 6-8; і необов'язково збір фракцій, що містять FVIII, в очищеній або збагаченій формі. Багатомодальна (або змішана) хроматографія є інструментарієм для очищення білків. Вона описана, наприклад, в специфікації компанії GE Health Care (11-0035-45AA) для Capto Adhere, специфікації компанії GE Health Care (28-9078-88AA) для Capto MMC і патентної заявки EP 07114856.3 "A process for the isolation and purification of а target protein, free of prion proteins". 2 UA 100901 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вказані способи мають певні перевагами і недоліки. Однією з переваг є можливість зв'язувати білки в середовищі з великою концентрацією солі, в порівнянні з тією, яка часто використовується при проведенні обмінної хроматографії. Недолік полягає в тому, що елюювання часто включає використання відносно тяжких умов, таких як, наприклад, рН менше або більше нейтрального значення рН, як індивідуально, так і у поєднанні з іншими параметрами елюювання. FVIII є відносно нестійким білком, наприклад, по відношенню до значень рН за межами нейтрального значення; рН 6-8 (Wang et. al., Coagulation FVIII, structure and stability. International Journal of Pharmaceuticals, 259 (2003), 1-15.). Даний винахід вирішує вказану проблему шляхом проведення елюювання в м'яких умовах при рН, близькому до нейтрального, що дозволяє зберегти активність молекули FVIII і полегшує застосування багатомодальної хроматографії у поєднанні із стабілізуючою дією підвищеної концентрації солі, що описане, наприклад, в EP-A-1707634. Відповідно до одного варіанту здійснення даного винаходу, багатомодальну хроматографію можна провести на хроматографічній колонці. Її можна розглядати як перший етап захоплення. Спосіб за даним винаходом можна також здійснити як порційний процес. Даний винахід також полегшує процес очищення без додавання отриманих від людини або тварини стабілізуючих добавок і дозволяє провести процес, зовсім їх не використовуючи (імуноафінні смоли на основі моноклональних антитіл). Використання багатомодальної смоли, зокрема, як стадії захоплення, забезпечує також сильніше зв'язування у порівнянні із звичайними іонообмінними смолами, що приводить до отримання на цій стадії продукту у вигляді більш концентрованого елюату, що чинить сприятливий вплив на стійкість продукту. Спосіб даного винаходу в загальному випадку відноситься до очищення рекомбінантного FVIII (rFVIII), зокрема, рекомбінантного FVIII, у якого видалений В-домен. Як правило, розчин містить FVIII в розчині з великою концентрацією солі, відповідній провідності в діапазоні від приблизно 25 до приблизно 200 мС/см при 25 °C. У іншому варіанті здійснення даного винаходу FVIII наносять на багатомодальну смолу, і після зв'язування з багатомодальною смолою проводять подальше елюювання з використанням відповідного буфера. Після нанесення суміші, що містить FVIII, і зв'язування FVIII з багатомодальною смолою молекулу FVIII елююють з багатомодальної смоли за допомогою елююючого буфера, що містить, принаймні, одну амінокислоту, яка позитивно заряджена при рН 6-8, і, зокрема, амінокислотою, яка позитивно заряджена при рН 6-8, є лізин, аргінін і/або гістидин. Крім того, буфер може включати, принаймні, одну органічну сполуку, що містить гідроксильну групу, таку як спирт, принаймні, одну органічну сполуку, що містить аміногрупу, 2+ таку як амінокислота, джерело іонів Ca , принаймні, одну сполуку для регулювання іонної сили буфера, таку як неорганічні солі, наприклад, NaCl, зокрема, з концентрацією µ 1 М, неіоногенний детергент і буферну речовину для підтримки рН в діапазоні від приблизно 6 до приблизно 8, зокрема, для підтримання приблизно нейтрального значення рН. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу спирт може бути вибраний з групи, що включає метанол, пропанол і етиленгліколь; амінокислота може бути вибрана з групи, що 2+ включає аргінін, лізин і гістидин; джерелом Ca може бути CaCl2; неорганічні солі можуть бути вибрані з групи, включаючої KCl і NaCl; неіоногенний детергент може бути вибраний з групи, що включає Tween 20, Tween 80 і Pluronic F68; буферна речовина може бути вибрана з групи, що включає цитрат натрію, гістидин, HEPES, MES і ацетат натрію при рН 6-8. Зокрема, концентрація амінокислоти, яка позитивно заряджена при рН 6-8, складає, щонайменше, >0,4 М, зокрема, >0,5 М. Якщо використовувати концентрацію конкретної амінокислоти більше, ніж 1 М, то подальших переваг не спостерігається. Як правило, кількість аргініну знаходиться в діапазоні від приблизно 0,4 М до приблизно 1 М, зокрема, в діапазоні від приблизно 0,7 М до приблизно 0,9 М. Органічна сполука, що містить гідроксильну групу, така як спирт, наприклад, етиленгліколь, міститься, зокрема, в кількості від 0 % (о./об.) до 30 % (о./об.), зокрема, від приблизно 5 % до 15 %. Концентрація іонів кальцію має бути в діапазоні від 0,0001 М до приблизно 0,1 М, зокрема, від приблизно 0,001 М до приблизно 0,03 М. Концентрація сполуки для регулювання іонної сили буфера має бути в такому діапазоні, щоб забезпечувалася провідність від приблизно 15 до приблизно 200 мС/см при 25 °C. Кількість неіоногенного детергента, як правило, складає від приблизно 0,001 % до 1 %. У одному варіанті здійснення даного винаходу багатомодальну смолу обробляють промивальним буфером. Його використовують для того, щоб вимити домішки і зберегти FVIII перш, ніж FVIII буде вивільнений. У ще одному варіанті здійснення даного винаходу використовувана "багатомодальна" хроматографічна смола включає, принаймні, один з наступних фрагментів: 3 UA 100901 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 i) позитивно заряджений ліганд N-бензил-N-метилетаноламін ii) негативно заряджений ліганд 2-(бензоїламіно) бутанову кислоту iii) фенілпропільний ліганд iv) N-гексильний ліганд v) 4-меркаптоетилпірідиновий ліганд vi) ліганд 3-((3-метил-5-((тетрагідрофуран-2-ілметил)аміно) феніл)аміно) бензойну кислоту, або їх поєднання. Зокрема, в способі даного винаходу "багатомодальна" хроматографічна смола вибрана з наступних комерційно доступних смол HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; MEP Hypercel™. У іншому варіанті здійснення даного винаходу стадію багатомодальної хроматографії комбінують із стадією афінної хроматографії FVIII, де афінність забезпечує білковий ліганд, такий як фрагмент антитіла, який експресується в дріжджах. Відповідно до способу даного винаходу, послідовність операцій очищення включає також стадії видалення/інактивації патогенів, які є стадією інактивації з використанням хімічних реагентів, стадію відділення по розмірах, хроматографічні стадії або їх комбінації, які засновані на різних фізіологічних властивостях, націлених проти патогена, що видаляється. У конкретному варіанті здійснення способу за даним винаходом послідовність операцій очищення включає також наступні стадії: i. використання аніонної мембрани, такої як Sartobind Q, зокрема, для зменшення вмісту ДНК; ii. катіонна багатомодальна смола, така як Capto MMC; iii. катіонообмінна смола, така як SP Sepharose FF; iv. використання другої аніонної мембрани, такої як Sartobind FF, зокрема, для подальшого зменшення вмісту ДНК; v. стадія інактивації з використанням хімічних реагентів для вірусів з ліпідною оболонкою, зокрема, стадія інактивуючої обробки типу "розчинник/детергент" з використанням три-нбутилфосфата і Triton X-100, як розкрито в EP-A-131740; vi. афінна смола на основі білкового ліганду, який експресується в дріжджах, така як VIIISelect, або аніонна багатомодальна хроматографічна смола, така як Capto Adhere; vii. стадія видалення патогенів шляхом фільтрації з використанням фільтру з середнім розміром пір приблизно 20 нм, такого як Planova 20N; viii. аніонообмінна смола, така як Q Sepharose FF; ix. смола для ексклюзійної хроматографії, така як Superdex 200pg. Зокрема, в способі даного винаходу умови елюювання на стадії катіонного обміну засновані 2+ на використанні іонів Ca , концентрація яких знаходиться в діапазоні 0,15-0,25 M, а загальна провідність елююючого буфера не перевищує 25 мС/см при 25 °C. При здійсненні способу за даним винаходом чистота отримуваного продукту складає >4000 IU/мг, після останньої стадії очищення переважно складає >9000 IU/мг і переважніше >10000 IU/мг білка, а вміст домішки ДНК складає