Спосіб прогнозування перебігу неходжкінських лімфом за рівнем трансформуючого фактора росту бета 1 та станом активності природних кілерів у крові

Реферат: Спосіб прогнозування неходжкінських лімфом з метою підвищення ефективності прогнозу та перебігу хвороби, крім оцінки клінічного стану пацієнтів за критеріями Міжнародного Прогностичного Індексу, проводиться визначення загальної концентрації, латентної та активної форм трансформуючого фактора росту бета 1 у плазмі крові та живильних середовищах мононуклеарів периферичної крові у взаємозв'язку з цитотоксичною активністю природних кілерів перед та після лікування пацієнтів. UA 107891 U (12) UA 107891 U UA 107891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема до онкогематології, і може застосовуватися для прогнозування, перебігу та оцінки відповіді на лікування пацієнтів з неходжкінськими лімфомами (НХЛ). Запропонований спосіб стосується вперше виявлених та лікованих пацієнтів з НХЛ, незалежно від застосованих схем поліхіміотерапії, у клініках гематологічного профілю. НХЛ належать до поширених летальних неоплазій лімфоїдної тканини, з переважаючим В-клітинним пухлинним субстратом на різних стадіях онтогенезу, і характеризуються значними імунними порушеннями та тривалістю безрецидивного виживання. На початку 2014 р. захворюваність на НХЛ становила 3,20 на 100 тис. дорослого населення України. Відомими способами для діагностики і клінічного перебігу НХЛ виступають критерії Міжнародного Прогностичного Індексу (ІРІ). Однак застосування лише критеріїв ІРІ не завжди дозволяють прогнозувати перебіг НХЛ. Поки що не виділено генетичних і фенотипових ознак субстратних пухлинних клітин, які дали б можливість чітко ідентифікувати групи хворих на НХЛ. До важливих прогностичних маркерів НХЛ, включених до переліку Міжнароного Прогностично Індексу (ІРІ), належать секретовані цитокіни [1]. Прогресування НХЛ супроводжується порушеним виробленням трансформуючого фактора росту бета 1 (TGF1), ізомеру з однойменної родини цитокінів, TGFs. Важливим джерелом вироблення TGF1 у кров виступають мононуклеари периферичної крові (МНПК) у відповідь на патологічних процес, а також лімфоїдна тканина лімфатичних вузлів, селезінки, уражених НХЛ. TGF1 - потужний інгібітор росту клітин епітеліального, ендотеліального і гематопоетичного походження, стимулятор росту сполучної тканини, продукції протеїнів позаклітинного матриксу, супресор імунної протипухлинної активності природних кілерів (NK) [2, 3]. Активність NK у протипухлинному захисті організму надзвичайно важлива. NK здатні першими впізнавати та знищувати вірусінфіковані та неопластичні клітини. TGF11 - неглікозильований димерний протеїн з мол.м. 25 kDa, який, на відміну від інших цитокінів, виробляється тканинами в активній і неактивній, латентній, формах, в комплексі з маскувальними протеїнами (latency-associated peptide-LAP). Останні захищають TGF 1 і забезпечують тривале депонування фактора в організмі. Біологічні властивості має лише активна форма TGF1, яка автокринно виробляється клітинами у середовище або активується після обробки фізіологічними активаторами [4]. В умовах in vivo активація TGF1 здійснювалася, переважно, протеїном, тромбоспондином-1, у середовищі клітин хронічної лімфоцитарної лейкемії (ХЛЛ), з чим пов'язують млявий перебіг ХЛЛ та фолікулярних індолентних НХЛ [2]. Природа багатьох інших активаторів до тепер остаточно не встановлена. Відомо, що латентний фактор LTBP-TGF1 депонується у тромбоцитах, кістках, позаклітинному матриксі і нагромаджується у плазмі крові, що дає можливість визначати концентрацію протеїну при різних патологічних станах [2-4]. Звільнення активного поліпептиду у дослідних зразках здійснюють концентрованими кислотами, лугами, після чого вони стають придатними для визначення загальної концентрації TGF1 в умовах in vitro. Активний TGF1 визначається у середовищі без попередньої обробки від латентних протеїнів. Не дивлячись на високу продукцію TGF1 у пухлинному мікрооточенні та нагромадженні фактора у крові, клітини НХЛ втрачають чутливість до ростового інгібування TGF1 на розгорнутих стадіях хвороби, стають резистентними до хіміотерапії і цитотоксичного впливу NK [2-6]. Найближчим за сукупністю ознак, подібних до сукупності суттєвих ознак даної корисної моделі, є спосіб прогнозування НХЛ за показниками лише загальної концентрації TGF1 у сироватці крові пацієнтів, без урахування продукції цитокіну у вільній, активній та латентній, неактивній формах [2, 3]. Поряд з цим, недоліком існуючих способів прогнозування НХЛ є відсутність оцінки секреторних властивостей TGF1 у кров з боку МНПК, у відповідь на патологічний процес. В існуючих способах загальний рівень TGF1 визначений імунологічними методами, з використанням фірмових наборів ELISA, які можуть виявляти неактивні епітопи молекул TGF1, що спотворює уяву про реальну поведінку TGF1 в організмі [2, 3]. Кількість NK у крові пацієнтів з НХЛ, визначена методом проточної цитофлюориметрії, була достовірно нижчою, ніж у здорових осіб, і відновлювалася до нормальних показників після курсу хіміотерапії [5]. Однак за допомогою цього методу не врахована функціональна, цитотоксична активність NK при дії на пухлинні клітини [5]. Активність NK при неоплазіях намагаються відновити різними способами, зокрема трансфекцією генів прозапальних цитокінів, TNF, IL-2, обробкою автологічних пухлинних антигенів до появи лімфокінактивованих кілерів (LAK) у культурі in vitro. Останні мали більшу протипухлинну активність в культурі in vitro, ніж автологічні NK. Однак такі підходи не 1 UA 107891 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 давали бажаних результатів. Ці клітини інактивувалися після введення LAK дослідним тваринам у кров з високою концентрацією TGF1 [7]. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб прогнозування НХЛ, мішенню якої будуть не безпосередньо неопластичні клітини НХЛ, а фактор пухлинного мікрооточення, TGF1. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі, згідно з корисною моделлю, проводять визначення загальної, латентної та активної форм TGF1 у плазмі крові і в кондиціонованих живильних середовищах (КЖС) МНПК на різних етапах лікування пацієнтів з різними гістологічними типами НХЛ. Отримані результати порівнюють з цитотоксичною активністю NK. Такі зміни досягаються застосуванням певних методів лабораторного дослідження. У запропонованому способі дослідження пацієнтів з НХЛ ми вибрали біологічні методи визначення загальної, активної, латентної форм TGF1, а також цитотоксичної активності NK у периферичній крові пацієнтів з НХЛ. Вони ґрунтуються, у випадку визначення TGF1, на проліферативній відповіді клітин-мішеней трансформованого ендотелію легенів норки лінії CCL64 (Mv.1.Lu), на які TGF1 чинить дозозалежний рістінгібіторний вплив [8]. Цитотоксичну активність NK у периферичній крові пацієнтів пропонується визначати після спільної інкубації МНПК пацієнтів з НХЛ з клітинами еритробластної лейкемії людини лінії К562 [9]. Спосіб прогнозування перебігу НХЛ здійснюють таким чином: на момент прийняття пацієнта у клініку проводять ретельну оцінку анамнезу хвороби та диференціальну діагностику НХЛ, відповідно до критеріїв ІРІ Національного інституту раку (NCI, США). Після підтвердження діагнозу НХЛ, та перед проведенням курсу хіміотерапії рекомендовано отримувати матеріал для дослідження (периферичну кров) у пацієнтів. Забір периферичної крові проводять натще, в стерильних умовах, в окрему стерильну пробірку з додаванням гепарину (5 од/мл), в об'ємі 10,0 мл. Після центрифугування плазму відбирають в окремі віали і зберігають при мінус 20 °C (не більше 1 року). Осад клітин крові нашаровують на градієнт щільності верографін-фіколу (=1,077) для отримання мононуклеарів периферичної крові (МНПК). Одну порцію МНПК інкубують у поживному середовищі (в концентрації 500 тис./мл впродовж 24 год., в атмосфері 2 СО за 37 °C) для отримання живильних середовищ МНПК, а іншу порцію МНПК використовують для визначення цитотоксичної активності NK [9]. Надосадову рідину 24годинних культур МНПК збирають в окремі віали і зберігають до моменту визначення концентрації TGF1. Вищезазначені показники пропонують визначати біологічними методами, які ґрунтуються на дозозалежній проліферативній відповіді клітин-мішеней трансформованого ендотелію легенів норки лінії CCL64 (Mv.1.Lu) в присутності дослідних зразків [8]. Природну цитотоксичність NK визначають після спільної інкубації МНПК пацієнтів з НХЛ з клітинами еритробласної лейкемії людини лінії К562 (у співвідношенні 1:20) [9]. Статистичну обробку результатів проводили за критерієм різниці тесту Стьюдента (t); вірогідність різниці між середніми величинами двох сукупностей приймалося за р