Спосіб одержання антирабічної гіперімунної сироватки крові

Реферат: Спосіб одержання антирабічної гіперімунної сироватки крові полягає в чотирикратному 3 комбінованому введенні кролям внутрішньошкірно в п'ять точок по 0,1 см і внутрішньом'язово в 3 одну точку 0,5 см культурального антигену вірусу сказу, штаму Щолково-51 К, вирощеного в культурі клітин ВНК-21/13 та інактивованого β-пропіолактоном. Інокуляція антигену для гіперімунізації здійснюється на 0 та 21 добу, після чого на 28 добу досліду проводиться відбір крові для визначення рівня антирабічних антитіл. За результатами дослідження для подальшої імунізації відбираються кролі з титрами вище 20 МО. Третя та четверта імунізації здійснюються на 35-у та 49-у добу відповідно, відбір крові та отримання специфічної сироватки - на 63-ю добу. В схемі гіперімунізації застосовується культуральний рабічний антиген концентрований ПЕГ (поліетиленгліколем) з молекулярною масою 6000 в кінцевій концентрації 6 % та імуностимулюючий препарат "Фоспреніл" на 0, 21 та 49-у добу імунізації. UA 110313 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ АНТИРАБІЧНОЇ ГІПЕРІМУННОЇ СИРОВАТКИ КРОВІ UA 110313 U UA 110313 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до ветеринарної мікробіології, імунології, епізоотології, а саме до способу одержання гіперімунних сироваток, і може бути застосована у схемі виробництва флуоресціюючого антирабічного імуноглобуліну. За прототип вибрано спосіб одержання антирабічної гіперімунної сироватки крові кролів, 3 яким вводять культуральну суспензію п'ятиразово в 20 точок по 0,15 см внутрішньошкірно, вздовж хребта. Імунізацію проводять на 0-у, 30-у, 45-у, 60-у і 75-у добу, а відбір крові - на 90-у. Для імунізації використовується рекомбінантний антиген на основі вірусу віспи, який містить глікопротеїн вірусу сказу [Патент України на корисну модель № 48158, МПК А61К 39/205. Спосіб одержання антирабічної гіперімунної сироватки]. Недоліками цього способу є тривалість періоду гіперімунізації, великий об'єм введеної культуральної рідини і значна інвазивність (множинність введення). В основу корисної моделі поставлено задачу розробити ефективний спосіб одержання гіперімунної антирабічної сироватки крові із зменшеною інвазивністю, введення меншого об'єму антигену за коротший період часу. Поставлена задача вирішується шляхом чотирикратного (на 0, 21, 35 та 49 добу) 3 комбінованого введення кролям внутрішньошкірно в п'ять точок по 0,1 см та внутрішньом'язово 3 в одну точку 0,5 см культурального антигену вірусу сказу, штаму Щолково-51 К (вирощеного в культурі клітин ВНК-21/13, концентрованого ПЕГ-6000 та інактивованого β-пропіолактоном). Введення антигену на 0 та 21 добу проводиться для гіперімунізації, в результаті якої до подальшої імунізації відбираються кролі з титрами антирабічних антитіл вище 20 МО. З метою підвищення імунної відповіді організму тварин в схемі гіперімунізації застосовується імуностимулюючий препарат "Фоспреніл" на 0-у, 21-у та 49-у добу імунізації. Застосування неочищеного від ПЕГ антигену в комплексі з імуностимулятором забезпечує підвищення біологічної активності антигену та значне скорочення терміну гіперімунізації (відбір крові на 63-ю добу). Приклад 1. З метою підбору оптимального імуностимулюючого препарату для застосування в схемі гіперімунізації, в досліді використовували імуностимулюючі препарати "РБС" - комплекс 3 біологічно активних речовин тваринної тканини (0,002 см /гол), "Ронколейкін" - рекомбінантний ІЛ-2 (100 і 200 МО/гол) та "Фоспреніл" в дозі 4 та 8 мкг/гол у різних схемах. Антирабічну вакцину 3 "Рабістар" в розведеннях 1:5, 1:25 і 1:125 вводили інтраперитоніально по 0,5 см . Препарати "РБС" та "Фоспреніл" ін'єктували внутрішньом'язово, а "Ронколейкін" - підшкірно, згідно з настановами до використання препаратів. На 7-у добу досліду провели ревакцинацію білих мишей, а інтрацеребральне зараження вірусом сказу - на 14-у добу. Заражаюча доза вірусу, взята в досліді, становила 125,9 MLD50/гол. Отримані результати порівнювали за показником ЕД50, який розраховували за формулою Sperman-Karber та за імуногенністю антирабічної вакцини (Табл. 1). Таблиця 1 Вплив препаратів "Фоспреніл", "Ронколейкін" і "РБС" на ефективність антирабічної вакцинації білих мишей Вакцина / препарат Рабістар 3 Рабістар + Фоспреніл (0,001 см ) Рабістар + Ронколейкін (100 МО) 3 Рабістар + РБС (0,002 см ) Рабістар + Ронколейкін (200 МО) 3 Рабістар + Фоспреніл (0,002 см ) 40 45 -ЕД50 1,52 1,75 1,16 1,65 1,39 1,46 Індекс імуногенності, МО/доза 6,96 11,8 3,04 9,39 5,16 6,06 Із двох груп тварин, яким ін'єктували "Фоспреніл", показник ЕД 50 був вищий на 15 % у групі тварин, яким застосовували препарат у дозі 4 мкг/гол порівняно із контрольною групою тварин (вакцина "Рабістар"). У групі тварин з дозою препарату 8 мкг/гол цей показник складав 1,46, що на 0,06 нижче ніж у контрольної групи тварин. Ефективну дію мав препарат "РБС". Показник 50 % ефективної дози був на рівні 1,65, що на 0,13 (9 %) вище ніж у контрольної групи тварин, але водночас на 0,1 нижче, ніж у тій групі тварин, якій застосовували "Фоспреніл" у дозі 4 мкг/гол. Імуностимулюючий препарат "Ронколейкін" не вплинув на ефективність антирабічної вакцинації. Показник ЕД50 в обох групах тварин був нижчим, ніж у тварин контрольної групи. 1 UA 110313 U 5 10 15 20 25 30 35 Імуногенна активність антирабічної вакцини "Рабістар" (серія № 060614) становила 6,96 МО/доза. У дослідних груп тварин, яким ін'єктували "Фоспреніл" (4 мкг/гол) і "РБС" разом з вакциною, імуногенність антирабічної вакцини зросла до 11,8 МО та 9,39 МО відповідно. Таким чином, проведені дослідження свідчать про підвищення імуногенної активності антирабічної вакцини на моделі лабораторних тварин в разі застосування препаратів "РБС" та "Фоспреніл" (4 мкг/гол). Доведено, що введення вищої та нижчої дози препарату "Фоспреніл" не впливало на підвищення рівня виживаності білих мишей після інфікування летальною дозою вірусу сказу. Приклад 2. На основі вивчених умов вирощування і отримання вірусу сказу з високою інфекційною активністю, підібрали оптимальні умови його концентрування. Для цього культуру клітин ВНК 21/13 в пластикових матрацах інфікували вірусом сказу, штамом "Щолково-51К", з множинністю зараження 0,1 МЛД50/кл. Матраци поміщали в CO2-інкубатор при 37±0,5 °C з 5 % CO2. Культуру клітин, інфіковану вірусом сказу, культивували 8 діб, отримання вірусовмісного матеріалу здійснювали у дві стадії - на 5-у добу при заміні середовища і на 8-у - після закінчення культивування. Для концентрування вірусу сказу підбирали різні концентрації поліетиленгліколю з молекулярною масою 6000 (1, 2, 4, 6, 8 % в кінцевій концентрації). В результаті проведення серії експериментів встановлено, що максимальна кількість вірусу з мінімальним вмістом баластного білка досягається при концентруванні вірусу 6 %-им ПЕГ. Отриману культуральну суспензію вірусу сказу інактивували β-пропіолактоном (Serva, Німеччина) в концентрації 1:10000, при температурі 4 °C протягом 24 год. Приклад 3. В схемі гіперімунізації використовували 7 дорослих кролів, масою 2,4-2,7 кг. Інактивований 3 концентрований антиген вводили комбіновано: 0,5 см внутрішньом'язово в одну точку та по 0,1 3 см внутрішньошкірно в п'ять точок. Імуностимулятор "Фоспреніл" в дозі 4 мкг/кг вводили внутрішньом'язово на 0-у, 21-у і 49-у добу імунізації. Гіперімунізацію проводили на 0-у та 21-у добу досліду, після чого на 28 добу досліду відбирали кров для визначення рівня антирабічних антитіл. При дослідженні методом ІФА (імуноферментного аналізу), сироватка крові № 2 мала низьку 3 активність до вірусу сказу із титром 8 МО/см , що пояснюється зниженою реактивністю тварини на введення антигену вірусу сказу. За результатами дослідження, для подальшої імунізації допускалися кролі з титрами вище 20 МО в ІФА. Третя та четверта імунізації за схемою здійснюються на 35-у та 49-у добу відповідно, відбір крові та отримання специфічної сироватки - на 63-ю добу (Табл. 2). Таблиця 2 Схема гіперімунізації Доба введення 0 21 35 49 63 (Відбір крові) 40 Спосіб імунізації (об'єм/кількість введень) 3 3 Підшкірно, см Внутрішньом'язово, см 0,5/5 0,5/1 0,5/5 0,5/1 0,5/5 0,5/1 0,5/5 0,5/1 Фоспреніл, см 3 0,125 0,125 0,125 Після використання розробленої схеми гіперімунізації тварин визначали титри антирабічних антитіл у сироватках крові методом ІФА (імуноферментного аналізу) і в реакції нейтралізації (РН) на білих мишах (Табл. 3). Таблиця 3 Визначення титру віруснейтралізуючих антитіл методом ІФА та РН, n=3 № сироватки 1 3 Титр антитіл, МО/см ІФА 194±12,3 246±8,9 2 3 РН 183±15,6 262±22,5 UA 110313 U Продовження таблиці 3 Визначення титру віруснейтралізуючих антитіл методом ІФА та РН, n=3 4 5 6 7 Об'єднана проба 5 10 15 20 25 30 35 40 45 235±14,5 218±7,8 182±5,5 219±9,0 212±10,4 214±18,4 185±10,8 167±12,6 210±9,7 185±9,2 Після отримання результатів титрування кожної сироватки крові, провели дослідження об'єднаної проби. Антирабічна активність об'єднаної проби сироватки крові гіперімунних тварин 3 3 становила 185±9,2 МО/см в РН і 212±10,4 МО/см в ІФА. Таким чином, запропонована схема гіперімунізації кролів дає змогу одержати сироватку крові з високим титром антитіл до вірусу сказу. Джерела інформації: 1. Hanlon A. Laboratory diagnosis of rabies. The National Working Group on Rabies Prevention and Control / A. Hanlon, J. Smith, G. Anderson // Am. Vet. Med. Assoc. - 1999. - № 215. - P. 1444. 2. Expert Consultation on Rabies. Technical Report Series 982 // WHO. - 2013. - P. 27. 3. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals [Електронний ресурс] // ОІЕ. 2013. Режим доступу до ресурсу: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.13_RABIES.pdf. 4. Dean D.J. The fluorescent antibody test / Dean D.J., Abelseth M.K., Atanasiu P. // Laboratory techniques in rabies. Fourth edition. - WHO. - 1996. - P. 88-95. 5. Mazur N. The role of FAT in laboratory diagnosis of rabies / N. Mazur, V. Nedosekov, I. Polupan. // Ветеринарна біотехнологія. - 2015. - № 26. - С. 232-236. 6. Новіцька О.В. Розробка тест-системи на основі імуноферментного аналізу для визначення антитіл проти вірусу сказу у сироватці крові тварин: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд.: спец. 16.00.03 "Ветеринарна мікробіологія та вірусологія" / Новіцька О.В. - К., 2004. - 25 с. 7. Опыт получения иммунных сывороток для производства диагностических препаратов / [Е.В. Алиева, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев и др.]. // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". - 2008. - № 1. - С. 11-15. 8. Клеточные культуры в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина / С.В. Генералов, Е.Г. Абрамова, А.К. Никифоров, Ж.В. Матвеева. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - № 110. - С. 76-79. 9. Пат. 2196607 Российская федерация, МПК А61 К З9/205, А61К 39/42, G01N 33/569. Способ получения гипериммунной антирабической сыворотки / Недосеков В.В.; Сливко И.А.; Куриннов В.В. - № 2001108407/13, заявл. 30.03.2001, публ. 20.01.2003. 10. Cellular immune response following pre-exposure and postexposure rabies vaccination by intradermal and intramuscular routes / [M.V. Manjunatha, N.M. Shampur, S.S. Sampada et al.]. // Clinical experimental vaccine research. - 2015. - № 4. - С. 68-74. 11. Nicholas Johnson. The immune response to rabies virus infection and vaccination / Nicholas Johnson, Adam F. Cunningham, Anthony R. Fooks. // Vaccine. - 2010. - P. 3896-3901. 12. Изучение сокращенных схем введения антирабической вакцины / Морогова В., Кравченко А., Магазов Р., Шафеева Р., Крутилина Д. // Имунобиологические препараты. - Уфа. 1983. - С. 62-64. 13. Застосування імуностимулюючих препаратів за антирабічної вакцинації / Н.В.Мазур, М.В. Мазур, І.М. Полупан, В.В. Недосєков // Ветеринарна біотехнологія. - 2015. - № 27. - С. 198-202. 14. Адъювантное действие Фоспренила на иммуногенность антирабической вакцины / [С.В. Ожерелков, А.М. Аржаев, Т.Н. Кожевникова и др.] // Ветеринарная клиника. - 2004. - № 8. - С. 910. 15. Полипренилфосфаты как адъюванты, поляризующие иммунный ответ в сторону ТЫ / [А.В. Пронин, С.В. Ожерелков, А.В. Деева и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2012. - № 3. С. 645-650. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 Спосіб одержання антирабічної гіперімунної сироватки крові полягає в чотирикратному 3 комбінованому введенні кролям внутрішньошкірно в п'ять точок по 0,1 см і внутрішньом'язово в 3 UA 110313 U 3 5 одну точку 0,5 см культурального антигену вірусу сказу, штаму Щолково-51 К, вирощеного в культурі клітин ВНК-21/13 та інактивованого β-пропіолактоном, інокуляція антигену для гіперімунізації здійснюється на 0 та 21 добу, після чого на 28 добу досліду проводиться відбір крові для визначення рівня антирабічних антитіл, за результатами дослідження для подальшої імунізації відбираються кролі з титрами вище 20 МО, третя та четверта імунізації здійснюються на 35-у та 49-у добу відповідно, відбір крові та отримання специфічної сироватки - на 63-ю добу, який відрізняється тим, що в схемі гіперімунізації застосовується культуральний рабічний антиген концентрований ПЕГ (поліетиленгліколем) з молекулярною масою 6000 в кінцевій концентрації 6 % та імуностимулюючий препарат "Фоспреніл" на 0, 21 та 49-у добу імунізації. 10 Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4