Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Заявлено спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту - сечовину, як джерело вуглецевого живлення - пересмажену соняшникову олію, з використанням інокуляту, вирощеного на мелясі. Згідно з винаходом концентрація пересмаженої соняшникової олії становить 5,9-6,1 % (об'ємна частка), сечовини 1,2-1,4 г/л, а інокулят вирощують на середовищі з мелясою масовою часткою 1,6-1,8 %. UA 110593 C2 (12) UA 110593 C2 UA 110593 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis ІMB Ас-5017 [Пат. 63962 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Софілканич А.П., Квятківська І.В. Опубл. 25.12.2011, Бюл. № 20], який включає культивування R. erythropolis ІMB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для здешевлення процесу біосинтезу і підвищення концентрації синтезованих ПАР як джерело вуглецевого живлення використовують олієвмісні промислові відходи (у тому числі й пересмажену соняшникову олію), а на початку процесу або в експоненційній фазі росту продуцента у середовище вносять глюкозу масовою часткою 0,1-0,2 % чи мелясу масовою часткою 0,2-0,4 %. Недоліком цього способу є недостатньо висока ПАР-синтезувальна здатність (г ПАР/г біомаси). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує ПАР-синтезувальну здатність. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus ІMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту - сечовину, як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, з використанням інокуляту, вирощеного на мелясі. Згідно з винаходом концентрація пересмаженої соняшникової олії становить 5,9-6,1 % (об'ємна частка), сечовини 1,2-1,4 г/л, а інокулят вирощують на середовищі з мелясою масовою часткою 1,61,8 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання пересмаженої соняшникової олії у концентрації 5,9-6,1 % (об'ємна частка), сечовини - 1,2-1,4 г/л, а також інокуляту, вирощеного на середовищі з мелясою масовою часткою 1,6-1,8 % дає змогу підвищити в 1,1-1,2 разу ПАРсинтезувальну здатність (до 3,5-3,6 г ПАР/г біомаси). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування A. calcoaceticus ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH 2)2CO - 1,3, MgSO4·7H2O - 0,1, NaCl - 1,0, Na2HPO4 - 0,6, KH2PO4 - 0,14, pH 6,8-7,0. У середовище додатково вносять дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і розчин мікроелементів - 0,1 % (об'ємна частка). Розчин мікроелементів містить (г/100 мл): ZnSO 4×7H2O - 1,1; MnSO4×H2O - 0,6; FeSO4×7H2O - 0,1; CuSO4×5H2O - 0,004; CoSO4×7H2O - 0,03; H3BO3 - 0,006; KI - 0,0001; ЕДТА (трилон Б) - 0,5. Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 6 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,7 % меляси (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити в 1,1-1,2 разу ПАР-синтезувальну здатність. Приклад 1. Синтез ПАР A. calcoaceticus ІMB В-7241 залежно від концентрації сечовини і пересмаженої олії у середовищі культивування Культивування штаму ІMB В-7241 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): (NH2)2CO - 1,1-1,5, MgSO4·7H2O - 0,1, NaCl - 1,0, Na2HPO4 - 0,6, KH2PO4 - 0,14, pH 6,8-7,0. У середовище додатково вносять дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка) і розчин мікроелементів - 0,1 % (об'ємна частка). Розчин мікроелементів містить (г/100 мл): ZnSO 4×7H2O - 1,1; MnSO4×H2O - 0,6; FeSO4×7H2O - 0,1; CuSO4×5H2O - 0,004; CoSO4×7H2O - 0,03; H3BO3 0,006; KI - 0,0001; ЕДТА (трилон Б) - 0,5. 1 UA 110593 C2 5 10 15 20 25 Як джерело вуглецю та енергії використовують відпрацьовану (пересмажену) соняшникову олію у концентрації 5,8-6,2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 1,0 % глюкози (масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 120 год. Біомасу визначають ваговим методом. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Для видалення залишкової соняшникової олії з культуральної рідини здійснюють трикратну екстракцію її петролейним ефіром (співвідношення 1:1). Далі культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. ПАР-синтезувальну здатність визначають як відношення концентрації ПАР (г/л) до концентрації біомаси (г/л) і виражають у г ПАР /г біомаси. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від концентрації сечовини і пересмаженої олії у середовищі культивування. Таблиця 1 Вплив концентрації сечовини і пересмаженої соняшникової олії у середовищі на біосинтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 Концентрація соняшникової олії, % 5,8 5,9 6,0 6,1 6,2 Концентрація (NH2)2CO, г/л г ПАР/г біомаси 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 2,9±0,14 2,7±0,13 2,7±0,13 2,6±0,13 2,6±0,13 2,9±0,14 3,0±0,15 3,0±0,15 3,0±0,15 2,9±0,14 2,9±0,14 3,1±0,16 3,1±0,16 3,1±0,16 2,9±0,14 2,8±0,14 3,0±0,15 3,0±0,15 3,0±0,15 2,9±0,14 2,9±0,14 2,8±0,14 2,8±0,14 2,9±0,14 2,8±0,14 2 UA 110593 C2 5 10 15 20 Наведені у табл. 1 дані засвідчують, що найвища ПАР-синтезувальна здатність (3,0-3,1 г ПАР/ г біомаси) досягається за умов росту штаму IMB В-7241 на середовищі, що містить 5,96,1 % пересмаженої соняшникової олії та 1,2-1,4 г/л сечовини. Приклад 2. Синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 залежно від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Концентрація сечовини у середовищі становить 1,3 г/л, пересмаженої олії - 6 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру, вирощену до середини експоненційної фази росту на середовищі з 0,35 г/л сечовини і 1,0 % (масова частка) глюкози або 2,0 % (масова частка) меляси. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 120 год. ПАР-синтезувальну здатність визначають як описано у прикладі 1. Емульгувальну здатність (індекс емульгування, Е 24) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини, попередньо обробленої петролейним ефіром для видалення залишкової пересмаженої олії, додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Як видно з наведених у табл. 2 даних, у разі використання інокуляту, вирощеного на мелясі, показники синтезу ПАР є вищими, ніж при застосуванні посівного матеріалу, одержаного на середовищі з глюкозою. Таблиця 2 Вплив способу підготовки інокуляту на синтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Глюкоза Меляса г ПАР/г біомаси Е24, % 3,1±0,16 3,3±0,17 58±2,9 60±3,0 25 30 35 40 Приклад 3. Залежність синтезу ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 на пересмаженій соняшниковій олії від концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Концентрація сечовини у середовищі становить 1,3 г/л, пересмаженої олії - 6 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру, вирощену до середини експоненційної фази росту на середовищі з 0,35 г/л сечовини і 1,5-1,9 % (масова частка) меляси. Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 120 год. ПАР-синтезувальну здатність та індекс емульгування визначають як описано у прикладі 1 (табл. 3). Дані, наведені у табл. 3, засвідчують, що оптимальною концентрацією меляси у середовищі для одержання інокуляту, є 1,6-1,8 г/л (масова частка). Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР штамами Rhodococcus erythropolis IMB Ас5017 і A. calcoaceticus IMB В-7241 на пересмаженій соняшниковій олії Культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Концентрація сечовини у середовищі становить 1,3 г/л, 3 UA 110593 C2 Таблиця 3 Вплив концентрації меляси у середовищі для одержання інокуляту на біосинтез ПАР A. calcoaceticus IMB В-7241 Концентрація меляси у середовищі для одержання інокуляту (%, масова частка) 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 5 10 15 г ПАР/ г біомаси Е24, % 3,3±0,16 3,5±0,17 3,6±0,18 3,5±0,17 3,3±0,16 59±2,9 61±3,0 60±3,0 61±3,0 58±2,9 пересмаженої олії - 6 % (об'ємна частка). Культивування штаму IMB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3 - 1,3; MgSO4·7H2O - 0,1; NaCl - 1,0; Na2HPO4 - 0,6; KH2PO4 - 0,14; FeSO4·7H2O - 0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують пересмажену соняшникову олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). У середовище культивування штаму IMB Ас-5017 додатково вносять 0,1 % глюкози (масова частка). Як посівний матеріал використовують штами A. calcoaceticus IMB В-7241 і R. erythropolis IMB Ас-5017, вирощені до середини експоненційної фази росту на середовищах наведеного вище складу, що містять 1,7 % (масова частка) меляси і 1,0 % (об'ємна частка) соняшникової олії відповідно. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 120 год. ПАР-синтезувальну здатність та індекс емульгування визначають як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР штамами IMB В-7241 і Ас-5017 наведено у табл. 4. Таблиця 4 Синтез ПАР за умов росту A. calcoaceticus IMB В-7241 і R. erythropolis IMB Ас-5017 на пересмаженій соняшниковій олії Штам R. erythropolis IMB Ас-5017 (прототип) A. calcoaceticus IMB В-7241 20 г ПАР/г біомаси 3,1±0,15 3,6±0,18 Індекс емульгування, % 47±2,3 60±3,0 Як видно з наведених у табл. 4 даних, культивування A. calcoaceticus IMB В-7241 на середовищі, що містить 6 % пересмаженої соняшниковій олії та 1,3 г/л сечовини з використанням інокуляту, вирощеного на мелясі масовою часткою 1,7 %, дає змогу підвищити ПАР-синтезувальну здатність майже в 1,2 разу порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Acinetobacter calcoaceticus IMB В-7241 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту містить сечовину, як джерело вуглецевого живлення - пересмажену соняшникову олію, з використанням інокуляту, вирощеного на мелясі, який відрізняється тим, що концентрація пересмаженої соняшникової олії становить 5,9-6,1 % (об'ємна частка), сечовини 1,2-1,4 г/л, а інокулят вирощують на середовищі з мелясою масовою часткою 1,61,8 %. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4