Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію. Для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію. UA 110796 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН UA 110796 U UA 110796 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані як антимікробні агенти у харчовій промисловості, медицині та сільському господарстві. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Патент № 10467 UA, МПК С21Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким аналогом до запропонованої корисної моделі є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii IMB В-7405 [Патент № 101395 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Панасюк К.В., Никитюк Л.В. Опубл. 10.09.2015, Бюл. № 17], який включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, з використанням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Недоліком цього способу є недостатньо високі антимікробні властивості синтезованих ПАР. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нового способу одержання ПАР, який покращує антимікробні властивості поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, згідно з корисною моделлю для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання відпрацьованої після смаження картоплі олії для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 1,8-3,5 разів (до 8-50 мкг/мл). Спосіб здійснюють наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO47H2O - 0,1, СаСl2 - 2Н2О - 0,1, КН2РО4 - 0,1, FeSO47H2O 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію (мережа ресторанів швидкого харчування Mcdonald's, Київ) у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % відпрацьованої після смаження картоплі олії. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 1,8-3,5 разів (до 8-50 мкг/мл). Приклад 1. Антимікробні властивості ПАР N. vaccinii IMB В-7405 залежно від якості пересмаженої олії у середовищі культивування. Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO47H2O - 0,1, СаСl22Н2О - 0,1, КН2РО4 - 0,1, FeSO47H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують відпрацьовану після смаження картоплі і м'яса олію (мережа ресторанів швидкого харчування Mcdonald's, Київ) у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % відповідної олії. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Позаклітинні поверхнево-активні речовини виділяють так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси.25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 Μ НСl, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 Μ НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну 1 UA 110796 U 5 10 15 20 25 30 35 40 фазу додають 9 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Антимікробні властивості поверхнево-активних речовин аналізують за показником мінімальної інгібуючої концентрації. МІК - це найменша концентрація препарату, що пригнічує видимий неозброєним оком ріст тест-культури. МІК є незалежним показником, за допомогою якого можна одночасно порівняти ефективність кількох антимікробних агентів. На відміну від інших методів аналізу активності відповідних препаратів, визначення МІК має ряд переваг: простота і швидкість аналізу, можливість одночасного визначення для кількох тест-культур, дослідження ефективності різних концентрацій препарату, можливість порівняння ефективності різних препаратів чи препаратів різного ступеня очищення. Визначення МІК є важливим фактором у лабораторній діагностиці для виявлення стійкості мікроорганізмів до антимікробних препаратів, а також для контролю ефективності нових лікарських засобів. У медичній практиці за допомогою цього показника обирають антибіотики та встановлюють необхідні їх дози для лікування пацієнтів. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють методом двократних серійних розведень у м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) для бактерій і рідкому суслі для дріжджів. У стерильних умовах у 10 пробірок вносять по 1 мл середовища, у першу додають 1 мл розчину ПАР певної концентрації, після чого перемішують, відбирають 1 мл і переносять у наступну пробірку. Аналогічно проводять розведення для наступних дев'яти пробірок. З останньої пробірки відбирають 1 мл. Таким чином, кінцевий об'єм у кожній пробірці становить 1 мл (МПБ чи рідке сусло і розчин ПАР), а концентрація ПАР у кожній наступній пробірці знижується у 2 рази. Як контроль використовують 1 мл МПБ (рідкого сусла) без додавання розчину ПАР. Далі у 5 6 кожну з пробірок вносять по 0,1 мл суспензії тест-культур (10 -10 КУО/мл), та перемішують. Пробірки інкубують впродовж 24 год. при 28-30 °C. Результати оцінюють візуально за помутнінням середовища: (+) - пробірки, в яких спостерігають помутніння середовища (ріст тест-культури), (-) - помутніння немає (ріст відсутній). Мінімальну інгібуючу концентрацію розчину ПАР визначають як середнє значення між концентраціями ПАР в останній пробірці, де ріст відсутній, і в попередній, де він наявний. Як тест-культури під час визначення антимікробних властивостей ПАР використовують штами бактерій (Escherichia coli IEM-1, Bacillus subtilis БТ-2) і дріжджів (Candida albicans Д-6) з колекції живих культур кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій, а також фітопа-тогенні бактерії з Української колекції мікроорганізмів (УКМ): Pectobacterium carotovorum УКМ В-1095, Pseudomonas syringae pv. atrofaciens УКМ В1015 і Xanthomonas campestris pv. campestris УКМ В-1049. Значення мінімальної інгібуючої концентрації ПАР залежно від типу пересмаженої соняшникової олії наведено у табл. 1. Таблиця 1 Мінімальна інгібуюча концентрація поверхнево-активних речовин Nocardia vaccinii IMB В-7405, синтезованих на олієвмісних субстратах Олія як субстрат для синтезу ПАР Відпрацьована після смаження м'яса Тест-культура В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) В. subtilis БТ-2 (спори) Е. соli IЕМ-1 С. albicans Д-6 P. syringae pv. atrofaciens УКМВ-1015 X. campestris pv. campestris УКМВ-1049 P. corotovorum УКМ B-1095 2 MIK, мкг/мл 56 142 28 71 49 28 90 UA 110796 U Олія як субстрат для синтезу ПАР Відпрацьована після смаження картоплі 5 10 15 20 Тест-культура MIK, мкг/мл B. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) В. subtilis БТ-2 (спори) E.coli IEM-1 С. albicans Д-6 P. syringae pv. atrofaciens УКМ В- 1015 X. campestris pv. campestris УКМВ-1049 P. corotovorum УКМ B-1095 16 50 8 33 14 16 50 Наведені дані свідчать, що ПАР, синтезовані на відпрацьованій після смаження картоплі олії, проявляють вищі антимікробні властивості, ніж одержані на відпрацьованому після смаження м'яса субстраті: МІК становить 8-50 і мкг/мл 28-142 відповідно. Приклад 2. Залежність антимікробних властивостей ПАР N. vaccinii IMB В-7405 природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту. Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,8 % меляси (масова частка), 0,5 % відпрацьованої після смаження картоплі олії. Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР і визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, значення МІК ПАР, синтезованих з використанням для одержання інокуляту відпрацьованої після смаження картоплі олії, є в 1,8-3,5 рази нижчими, ніж показники, встановлені для ПАР, одержаних із застосуванням посівного матеріалу, вирощеного на мелясі. Таблиця 2 Вплив природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту на антимікробні властивості ПАР N. vaccinii IMB В-7405, синтезованих на відпрацьованій після смаження картоплі олії Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Тест-культури В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) В. subtilis БТ-2 (спори) E.coli lEM-1 С. albicans Д-6 В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) В. subtilis БТ-2 (спори) Е.соlі ІЕМ-1 С. albicans Д-6 Меляса Відпрацьована після смаження картоплі олія + 25 30 МІК, мкг/мл 45 90 28 90 16 50 8 33 Приклад 3. Активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази N. vaccinii IMB В-7405 від природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту. Оскільки штам IMB В-7405 синтезує комплекс гліко-, фосфо-, аміно- та нейтральних ліпідів, цілком ймовірно, що в різних умовах культивування N. vaccinii IMB В-7405 може змінюватися співвідношення компонентів комплексу. За літературними даними аміноліпіди є ефективнішими антимікробними агентами порівняно з гліколіпідами. Отже, можливо, що за використання відпрацьованої олії як для одержання інокуляту. так і біосинтезу ПАР вміст аміноліпідів у складі синтезованого комплексу є вищим, ніж при вирощувані посівного матеріалу на середовищі з + мелясою. Для перевірки цього припущення аналізують активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази - ключового ферменту біосинтезу аміноліпідів у N. vaccinii IMB В-7405. 3 UA 110796 U 5 10 Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 2 упродовж 24 і 48 год. Для одержання безклітинних екстрактів культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв, + 4 °C). Отриманий осад клітин двічі відмивають від залишків середовища 0,05 Μ К -фосфатним буфером (рН 7,0), центрифугуючи (4000 g, 15 хв, 4 °C). Відмиті клітини ресуспендують в 0,05 Μ + К -фосфатному буфері (рН 7,0) і руйнують ультразвуком (22 кГц) 3 рази по 60 с при 4 °C на апараті УЗДН-1. Одержаний дезінтеграт центрифугують (12000 g, 30 хв, 4 °C), осад відділяють, а супернатант використовують як безклітинний екстракт. Активність глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4) аналізують за утворенням глутамату під час окиснення НАДФН при 340 нм. + Як видно з наведених у табл. 3 даних, активність НАДФ -залежної глутаматдегідрогенази за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 на відпрацьованій після смаження картоплі олії є вищою у разі вирощування інокуляту на такому самому субстраті. Таблиця 3 + Вплив природи джерела вуглецю у середовищі для одержання інокуляту на активність НАДФ залежної глутаматдегідрогенази N.vaccinii IMB В-7405 Джерело вуглецю у середовищі для одержання інокуляту Меляса Відпрацьована після смаження картоплі олія 15 -1 -1 Активність (нмоль хв. мг білка) у фазі росту ранній експоненційній пізній експоненційній 800±40 950±47 1200±60 1600±80 Отже, використання відпрацьованої після смаження картоплі олії для одержання інокуляту і біосинтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію синтезованих поверхнево-активних речовин у 1,8-3,5 рази (до 8-50 мкг/мл). ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення пересмажену соняшникову олію, який відрізняється тим, що для біосинтезу поверхнево-активних речовин і одержання інокуляту використовують відпрацьовану після смаження картоплі олію. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4