Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів, причому як джерело вуглецю використовують суміш технічного гліцерину об'ємною часткою 4,9-5,1 % та меляси масовою часткою 0,9-1,1 %. UA 109831 C2 (12) UA 109831 C2 UA 109831 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 Ν 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Ρ.Α., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Rhodococcus erythropolis 1MB Ас-5017 [Пат. 81804 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Шулякова М.О., Мащенко О.Ю. Опубл. 10.07.2013, Бюл. № 13], який включає культивування R. erythropolis 1MB Ас-5017 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецю і енергії. Для підвищення умовної концентрації ПАР як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану і очищеного гліцерину у молярному співвідношенні 1:7, а концентрація гексадекану і гліцерину становить (%, об'ємна частка) 0,59-0,61 і 0,83-0,85 відповідно. Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин. В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який підвищує концентрацію ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів. Згідно з винаходом як джерело вуглецю використовують суміш технічного гліцерину (відхід виробництва біодизелю) об'ємною часткою 4,9-5,1 % та меляси масовою часткою 0,9-1,1 %. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Використання як джерела вуглецю для культивування штаму N. vaccinii 1MB В-7405 суміші технічного гліцерину об'ємною часткою 4,9-5,1 % та меляси масовою часткою 0,9-1,1 % дає змогу підвищити у 2,3-2,4 разу концентрацію синтезованих ПАР (до 6,2-6,4 г/л). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii 1MB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO47H2O-0,1, СаСl22Н2О 0,1, KН2РО4-0,1, FeSO47H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш технічного гліцерину (5,0 %, об'ємна частка) та меляси (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш технічного гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу підвищити у 2,3-2,4 разу концентрацію синтезованих ПАР. Приклад 1. Синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 на суміші різних концентрацій технічного гліцерину та меляси. Культивування штаму 1MB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO47H2O-0,1, СаСl22Н2О -0,1, KН2РО4-0,1, FeSO47H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш технічного гліцерину (1,0-6,0 %, об'ємна частка) та меляси (1,0-3,0 %, масова частка). Технічний гліцерин одержано від підприємства-виробника біодизелю (Запорізький біопаливний завод). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш технічного гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 120 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку 1 UA 109831 C2 5 10 15 об'ємом 100 мл, додають5 мл 1 Μ НСІ, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 Μ НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 залежно від концентрації технічного гліцерину і меляси у суміші. Таблиця 1 Вплив концентрації технічного гліцерину і меляси у змішаному субстраті на синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 Концентрація у суміші, % технічного гліцерину меляси 1,0 1,0 2,0 1,0 3,0 1,0 4,0 1,0 5,0 1,0 6,0 1,0 1,0 1,5 1,0 2,0 1,0 2,5 1,0 3,0 ПАР, г/л Е24, % 2,8±0,14 3,0±0,15 3,6±0,18 4,8±0,24 6,4±0,32 5,9±0,29 2,1±0,10 2,0±0,10 2,3±0,11 1,8±0,09 58±2,9 58±2,9 57±2,8 59±2,9 62±3,1 58±2,9 56±2,8 55±2,8 52±2,6 52±2,6 20 25 30 35 Наведені у табл. 1 дані свідчать, що показники синтезу ПАР є найвищими за умов росту штаму 1MB В-7405 на суміші 5,0 % технічного гліцерину і 1,0 % меляси. Приклад 2. Визначення оптимальної концентрації технічного гліцерину у змішаному субстраті для синтезу ПАР N. vaccinii 1MB В-7405. Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (4,5-5,5 %, об'ємна частка) та меляси (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш технічного гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію синтезованих ПАР та індекс емульгування визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, за концентрації технічного гліцерину 4,9-5,1 % (об'ємна частка) у суміші з 1,0 % меляси концентрація ПАР та індекс емульгування є найвищими. 2 UA 109831 C2 Таблиця 2 Синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 залежно від концентрації технічного гліцерину у суміші з мелясою (1,0 %) Концентрація технічного гліцерину, % 4,5 4,7 4,9 5,0 5,1 5,3 5,5 5 10 15 ПАР, г/л Е24, % 5,2±0,26 5,8±0,29 6,3±0.32 6,4±0,32 6,2±0,31 5,8±0,29 5,0±0.25 57±2,8 58±2,9 61±3,0 62±3,1 60±3,0 56±2,8 55±2,8 Приклад 3. Визначення оптимальної концентрації меляси у суміші з гліцерином для синтезу ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 Культивування бактерій здійснюють на середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гліцерину (5,0 %, об'ємна частка) та меляси (0,8-1,5 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш технічного гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію синтезованих ПАР та індекс емульгування визначають як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР на суміші технічного гліцерину і різних концентрацій меляси наведено у табл. 3. Таблиця 3 Синтез ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 залежно від концентрації меляси у суміші з технічним гліцерином (5,0 %) Концентрація меляси, % 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 20 25 30 ПАР, г/л 6,0±0,30 6,3±0,31 6,4±0,32 6,2±0,31 6,0±0,30 5,8±0,29 5,3±0,27 5,0±0,25 Е24, % 59±2,9 61±3,0 62±3,1 60±3,0 58±2,9 56±2,8 56±2,8 55±2,8 Як видно з наведених у табл. 3 даних, найвища концентрація ПАР (6,2-6,4 г/л) і найвищий індекс емульгування (60-62 %) спостерігаються за концентрації меляси у суміші 0,9-1,1 %. Приклад 4. Порівняння показників синтезу ПАР штамами R. erythropolis 1MB Ас-5017 і N. vaccinii 1MB В-7405 на суміші ростових субстратів Культивування N. vaccinii 1MB В-7405 здійснюють на середовищі, наведеному у прикладі 1. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш технічного гліцерину (5,0 %, об'ємна частка) та меляси (1,0 %, масова частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш технічного гліцерину (0,5 %, об'ємна частка) і меляси (0,5 %, масова частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування штаму 1MB Ас-5017 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNCb-1,3; MgSO47H2O-0,1; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; KH2PO4-0,14; FeSO47H2O0,001; pH 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують суміш гексадекану та гліцерину об'ємною часткою 0,60 і 0,84 % відповідно. Як посівний матеріал використовують 3 UA 109831 C2 5 культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гексадекану. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Концентрацію ПАР визначають як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР штамами R. erythropolis 1MB Ас-5017 і N. vaccinii 1MB В7405 на суміші ростових субстратів наведено у табл. 4. Таблиця 4 Синтез ПАР за умов росту N. vaccinii 1MB В-7405 і R. Erythropolis 1MB Ас-5017 на суміші ростових субстратів Штам Змішаний субстрат R. erythropolis 1MB Ас-5017 (прототип) Гексадекан+гліцерин N. vaccinii 1MB В-7405 Технічний гліцерин+меляса 10 ПАР, г/л 2,7±0,14 6,4±0,32 Як видно з наведених у табл. 4 даних, культивування N. vaccinii 1MB В-7405 на суміші технічного гліцерину об'ємною часткою 5,0 % і меляси масовою часткою 1,0 % дає змогу підвищити концентрацію ПАР у 2,4 разу (до 6,4 г/л) порівняно з прототипом. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення суміш ростових субстратів, який відрізняється тим, що як джерело вуглецю використовують суміш технічного гліцерину об'ємною часткою 4,9-5,1 % та меляси масовою часткою 0,9-1,1 %. 20 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4