Спосіб розмноження в культурі in vitro та адаптації міскантусу у відкритому ґрунті

Реферат: UA 111300 U UA 111300 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології та біоенергетиці для розмноження міскантусу в культурі in vitro, акліматизації та збереження рослин на першому році вирощування у відкритому ґрунті. Відомий спосіб розмноження міскантусу китайського шляхом регенерації рослин із калусу (Eun Soo Seong, Ji Hye Υοο, Hyun Young Kil, Jae Geun Lee, and Chang Yeon Yu Establishment of a Regeneration System by Callus Induction from Explants of Miscanthus sinensis// J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 2010, 53 № 6, P. 661-667.), де як експланти для отримання калусних культур використовують бруньки, гілочки, квітки та насіння міскантусу китайського, яке стерилізують за допомогою 6 % гіпохлориду натрію протягом 10 хвилин, промивають тричі стерильною водою. 0 Експланти інкубують при фотоперіоді - 16 годин світла, 8 годин темряви при температурі 25 С з -2-1 освітленням 45μmοl м білими флуоресцентними лампами. Калуси отримують, використовуючи середовища Гамборга - В5 або Чу з додаванням 2,4-Д - 2мг/л. Як регенераційне середовище використовують середовище Мурасіге-Скуга модифіковане за вмістом сахарози - 2 %, + 0,3 % гельріту + 5 мг/л БАП + 0,24мг/л НУК…або сахарози - 2 %, + 0,3 % геліту + 5 мг/л БАП + 2,4Д - 1 мг/л (Holme, І.В. and K.K. Petersen, Callus induction and plant regeneration from different explant types of Miscanthus-ogiformis Honda Giganteus. Plant Cell Tissue Organ Cult., 1996 45: 43-52), на якому через 4 тижня отримують 50 рослин з кореневою системою, які висаджують в горщики. Горщики накривають вініловими накривками, які підтримують високий вміст вологи, розміщують в боксі з автоклавованим піском та ґрунтом у співвідношенні 1:3 за об'ємом, та інкубують при 26 °C та 16 - годинному щоденному освітленні. Через 1 тиждень накривки видаляють, а після 3 тижнів рослини, що вижили, переносять в теплицю. Найбільш близьким до пропонованої корисної моделі є відомий спосіб розмноження міскантусу гігантського в культурі in vitro, який включає індукцію утворення та розмноження пагонів з субкультивацією кожні 5 тижнів на живильному середовищі Мурасиге - Скуга, яке містить 1-5 мг/л БАП в комбінації або без IOК - 0,2-0,45 мг/л, висаджування рослин для акліматизації та підрощування у ґрунтові суміші в умовах теплиць - температура день/ніч 20/15 °C, освітлення 16 годин галогеновими лампами. Для адаптації використовують пластикові накривки, які видаляють поступово через 1 тиждень після експлантації (Lewandowski I. Micropropagation of Miscanthus x gigantheus. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 39 High-Tech and Micropropagation V (ed. By Y.P.S. Bajaj), Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1997, p. 240-255). Відомий та пропонований способи розмноження в культурі in vitro мають спільні суттєві ознаки: індукції утворення пагонів та їх субкультивація для розмноження на живильному середовищі, яке містить БАП в комбінації або без НОК; висаджування рослин для акліматизації; адаптація рослин в ґрунті; використання пластикових накривок, які видаляють поступово через 1 тиждень після експлантації. Але відомий спосіб не забезпечує прискорене розмноження міскантусу, ініціацію, стимуляцію росту ризом, що потребує певного складу та співвідношення інгредієнтів, зокрема регуляторів росту, амінокислот у живильному середовищі та акліматизацію мікророслин у відкритому ґрунті без використання тепличних комплексів. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб розмноження in vitro та адаптації міскантусу відкритому ґрунті, шляхом індукції утворення пагонів та їх субкультивації через певний проміжок часу для розмноження на живильному середовищі, стимуляції росту ризом на середовищах з певним вмістом та співвідношенням регуляторів ростку та амінокислот, висаджування мікророслин у відкритий ґрунт без використання теплиць для їх акліматизації та підрощування. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, розмноження міскантусу в культурі in vitro, що включає індукцію утворення пагонів та їх субкультивація для розмноження на живильному середовищі, яке містить БАП в комбінації або без НОК, висаджування рослин для акліматизації та підрощування у ґрунтові суміші в умовах теплиць, використання для адаптації пластикових накривок, які видаляють поступово через 1 тиждень після експлантації. Згідно з корисною моделлю експланти (насіння, бруньки, які видаляють з ризом, частинки стебла з брунькою) для розмноження пагонів їх висаджують на модифіковане середовище 1 Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням: вітамінів - піридоксину - 1-10 г/л, тіамін - 1 мг/л, нікотинової кислоти - 1 г/л, аскорбінової кислоти - 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-300 мг/л, аспарагінової кислоти 1 UA 111300 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 30-50 мг/л, тірозину - 2-5 мг/л, аргініну - 2-3 мг/л, гідроксипроліну - 1-3 мг/л, регуляторів росту: БАП - 0,4-0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5мг/л +аденін - 0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5мг/л + аденін - 0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5мг/л +аденін - 0,5 мг/л + кінетин - 0,5 мг/л +ГК - 0,2-0,3 мг/л; для стимуляції росту ризом in vitro, які є запорукою високого ступеня адаптації, акліматизації та збереження рослин в умовах відкритого ґрунту пагони пересаджують на середовище іншого складу, яке відрізняється від попереднього вмістом та співвідношенням регуляторів росту - БАП 0,2-мг/л + ГК - 0,5-1,0 мг/л або БАП 0,2-мг/л + ГК 0,5-1,0 мг/л + НОК - 0,1 мг/л. Новими суттєвими ознаками корисної моделі є: склад живильного середовища для розмноження пагонів, модифіковане середовище 1 Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням: вітамінів - піридоксину - 1-10 г/л, тіаміну - 1 мг/л, нікотинової кислоти - 1 г/л, аскорбінової кислоти - 1 мг/л, амінокислот: глютамінової - 250-300 мг/л, аспарагінової кислоти 30-50 мг/л, тірозину - 2-5мг/л, аргініну - 2-3 мг/л, гідроксипроліну - 1-3 мг/л, регуляторів росту: БАП - 0,4-0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5мг/л +аденін - 0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5 мг/л +аденін - 0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5 мг/л +аденін - 0,5 мг/л + кінетин - 0,5 мг/л +ГК - 0,2-0,3 мг/л; склад живильного середовища для стимуляції росту ризом in vitro, яке відрізняється від попередніх вмістом та співвідношенням регуляторів росту - БАП - 0,2-0,3 мг/л + ГК - 0,5-1,0 мг/л або БАП 0,2-0,3 мг/л + ГК -0,5-1,0 мг/л + НОК - 0,1 мг/л; висаджування мікророслин безпосередньо у відкритий грунт без використання тепличних комплексів для їх підрощування та акліматизації. Відмінні від прототипу (нові суттєві ознаки) при взаємодії з відомими дозволяють розмножувати міскантус in vitro, стимулювати ріст та розвиток ризом, проводити адаптацію та акліматизацію мікророслин у відкритому ґрунті без використання тепличних комплексів. Спосіб розмноження в культурі in vitro та адаптації міскантусу у відкритому ґрунті здійснюється таким чином. Пагони міскантусу розмножують в культурі in vitro на живильному середовищі 1 модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, вітаміни - піридоксин -1-10 г/л, тіамін - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 г/л, аскорбінова кислота - 1 мг/л, + амінокислоти: глютамінова - 250-300 мг/л, аспарагінова кислоти 30-50 мг/л, тірозин - 2-5 мг/л, аргінін - 2-3 мг/л, гідроксипролін - 1-3 + регулятори росту: БАП 0,4-0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5мг/л +аденін - 0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5 мг/л +аденін - 0,5 мг/л + кінетин - 0,5 мг/л +ГК - 0,2-0,3 мг/л. + сахароза 40 г /л + агар - 8 г/л. Культивують за температури 22-25° С та відносній вологості повітря 50-80 %, фотоперіоді 16 годин освітлення 2-5 клк. Після розмноження та отримання необхідної кількості пагонів, для стимуляції росту ризом (органу запасання поживних речовин, зберігання рослин в зимовий період та їх розмноження in vivo), пагони пересаджують на живильне середовище іншого складу, яке відрізняється від попереднього вмістом та співвідношенням регуляторів росту - БАП 0,2-0,3 мг/л + ГК - 0,5-1,0 мг/л або БАП - 0,2-0,3 мг/л + ГК -- 0,5-1,0 мг/л + НОК - 0,1мг/л. Після утворення ризом довжиною 10-15 см мікророслини обережно звільняють від залишків агару та висаджують у відкритий ґрунт, використовуючи для адаптації пластикові накривки, які видаляють поступово через 6-8 діб після пересаджування рослин з колби in vitro в умови in vivo. Згідно з отриманими результатами введення до складу живильних середовищ гібереліну стимулює ріст ризом та сприяє збільшенню довжини ризом в залежності від виду міскантусу в середньому в 5-7 разів (табл.1), тоді, як на середовищах прототипу або ризоми не рослин взагалі, або мали дуже малі розміри - від 0,3 до 1,1 см максимально. Таблиця 1 Довжина ризом міскантусу з культури in vitro перед висадкою в грунт, см в залежності від складу живильного середовища Середовище Довжини ризом, см П 0,3-1,1 Ρр1 2,7 Рр2 12,7 Рр3 15,8 Рр4 14,3 Π - середовище прототипу 50 1 Рр1 - модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням: вітамінів - піридоксин - 1-10 г/л, 2 UA 111300 U 5 10 15 20 тіамін - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 г/л, аскорбінова кислота - 1 мг/л, + амінокислоти: глютамінова - 250-300 мг/л, аспарагінова кислоти - 30-50 мг/л, тірозин - 2-5 мг/л, аргінін - 2-3 мг/л, гідроксипролін - 1-3 мг/л + регулятори росту: БАП - 0,2-0,3 мг/л л + сахароза 40 г /л + агар 8г/л; 1 Рр2 - модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням: вітамінів - піридоксин - 1-10 г/л, тіамін - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 г/л, аскорбінова кислота - 1 мг/л, + амінокислоти: глютамінова - 250-300 мг/л, аспарагінова кислоти- 30-50 мг/л, тірозин - 2-5 мг/л, аргінін - 2-3 мг/л, гідроксипролін - 1-3 мг/л + регулятори росту: БЛП - 0,2-0,3 мг/л + ГК - 0,5 мг/л л + сахароза 40 г/л + агар - 8 г/л (корисна модель); 1 Рр3 - модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням: вітамінів - піридоксин - 1-10 г/л, тіамін - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 г/л, аскорбінова кислота - 1 мг/л, + амінокислоти: глютамінова - 250-300 мг/л, аспарагінова кислоти - 30-50 мг/л, тірозин - 2-5 мг/л, аргінін - 2-3 мг/л, гідроксипролін - 1-3 мг/л + регулятори росту: БАП - 0,2-0,3 мг/л + ГК - 1,0 мг/л + сахароза 40 г/л + агар - 8 г/л (корисна модель); 1 Рр4 - модифіковане живильне середовище Мурасіге-Скуга, що містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, з додаванням: вітамінів - піридоксин - 1-10 г/л, тіамін - 1 мг/л, нікотинова кислота - 1 г/л, аскорбінова кислота - 1 мг/л, + амінокислоти: глютамінова - 250-300 мг/л, аспарагінова кислоти- 30-50 мг/л, тірозин - 2-5 мг/л, аргінін - 2-3 мг/л, гідроксипролін - 1-3 мг/л + регулятори росту: БАП - 0,2-0,3 мг/л + ГК - 1,0 мг/л + + НОК 0,1-0,2 мг/л, + сахароза 40 г/л + агар - 8 г/л (корисна модель); Таблиця 2 Характеристика способів розмноження міскантусу в культурі in vitro та адаптації в ґрунті Кількість Способи рослин, що Адаптація та Кількість розмноження Стимуляція Адаптація вижили акліматизація адаптованих та міскантусу в Розмноження росту в після в умовах акліматизованих культурі in vitro in vitro ризом in умовах перезимівлі відкритого рослин в % від та адаптації у vitro теплиць в% ґрунту висаджених грунті від висаджених За прототипом + + + 89 66 Живильне + + 67 41 середовище для розмноження в культурі in vitro за прототипом, адаптація та акліматизація за корисною моделлю За корисною + + + 100 100 моделлю 25 30 Згідно з даними, що наведені в таблиці 2, при застосуванні способу розмноження міскантусу в культурі in vitro та адаптації у ґрунті за прототипом (використання теплиць) кількість адаптованих та акліматизованих рослин в % від висаджених становила 89 %, а кількість рослин, що вижили після перезимівлі в % від висаджених 66 %, адаптація та акліматизація мікророслин за корисною моделлю тобто висаджування їх безпосередньо у відкритий ґрунт з середовищ прототипу забезпечила тільки 67 % адаптованих та акліматизованих рослин в % від висаджених, а кількість рослин, що а вижили після перезимівлі - 41 %. Такі результати були отримані в умовах України, тоді як в умовах інших європейських країн рослини без застосування тепличних комплексів взагалі не виживають. Стимуляція утворення та пролонгації ризом на відповідних живильних середовищах перед висаджуванням рослин міскантусу у відкритий ґрунт 3 UA 111300 U 5 10 15 20 25 30 (корисна модель) сприяла 100 % адаптації та 100 % виживанню рослин в зимовий період, без застосування тепличних комплексів, як проміжної ланки для адаптації та підрощування мікророслин. Спосіб розмноження міскантусу in vitro та адаптації у відкритому ґрунті надає значні переваги при розмноженні міскантусу тому, що дозволяє уникнути використання тепличних комплексів, стаціонарний характер, конструкційна складність та дороговизна яких обмежують використання їх окремими фермерами та малими сільськогосподарськими підприємствами. Спосіб забезпечує гарантоване 100 % збереження розмножених в культурі in vitro мікророслин при адаптації та акліматизації у відкритому ґрунті та 100 % виживання у зимовий період, що значно здешевлює вартість рослин в зв'язку з тим, що відпадає необхідність пересаджувати рослини спочатку в горщики або в суцільні ємності з ґрунтовими сумішами та адаптувати їх в умовах теплиць, а потім викопувати їх з травмуванням кореневої системи та пересаджувати у відкритий ґрунт. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб розмноження в культурі in vitro та адаптації міскантусу у відкритому ґрунті, що включає розмноження пагонів міскантусу в культурі in vitro, висаджування рослин для акліматизації та адаптації в ґрунт, використання пластикових накривок, які видаляють поступово через 1 тиждень після експлантації, який відрізняється тим, що пагони міскантусу розмножують в культурі in vitro на живильному середовищі - модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга, що 1 містить /2 дози макроелементів та повну дозу мікроелементів, вітаміни - піридоксин - 1-10 г/л, тіамін - 1 мг/л, нікотинову кислоту - 1 г/л, аскорбінову кислоту - 1 мг/л, + амінокислоти: глютамінову - 250-300 мг/л, аспарагінову - 30-50 мг/л, тірозин - 2-5 мг/л, аргінін - 2-3 мг/л, гідроксипролін - 1-3 + регулятори росту: БАП - 0,4-0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5 мг/л + аденін - 0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л або БАП - 0,4-0,5 мг/л + аденін - 0,5 мг/л + кінетин -0,5 мг/л + ГК - 0,2-0,3 мг/л з додаванням сахарози - 40 г/л та агару - 8 г/л, культивують за температури 22-25° С та відносній вологості повітря 50-80 %, фотоперіоді - 16 годин освітлення 2-5 клк, для стимуляції росту ризом in vitro пагони пересаджують на середовище іншого складу, яке відрізняється від попереднього вмістом та співвідношенням регуляторів росту - БАП 0,2 мг/л + ГК - 0,5-1,0 мг/л або БАП - 0,2 мг/л + ГК - 0,5-1,0 мг/л + НОК - 0,1 мг/л; після утворення ризом та збільшення їх розмірів до 10-15 см міскантус висаджують у відкритий ґрунт без попередньої адаптації, акліматизації та підрощування у ґрунтових сумішах в умовах теплиць. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4