Спосіб отримання дигаплоїдних форм міскантусу у культурі in vitro

Реферат: UA 79704 U UA 79704 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, зокрема для створення, отримання і розмноження розсади цінних селекційних матеріалів. Дигаплоїдні форми необхідні для гетерозисної селекції. Вони використовуються як один із компонентів при отримані гібридів. У природі дигаплоїдні форми майже не зустрічаються, їх в більшості випадків створюють штучно методами біотехнології. Одним із таких методів є метод регенерації бруньок з незапліднених насіннєвих зачатків або пиляків. Подвоєні гаплоїди характеризуються гомозиготним станом генів, які проявляють певну необхідну для селекції ознаку, тому створення їх є актуальним питанням. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб отримання гаплоїдних і дигаплоїдних ліній цукрових буряків у культурі in vitro (Redko V.І., Dragunova О.K. Obtaining haploid and dihaploid lines of sugar beet under in vitro conditions // Abstr. II Intern. Synp. On plant biotechnology, 4-8 October 1998, Kyiv, Ukraine p. 106). За цього відомого способу проводять попередню холодову обробку квіткових пагонів цукрових буряків при температурі +4 °C до 8 діб. Для стерилізації пагонів з пуп'янками використовують 5-10 % розчин хлораміну протягом 30 хвилин, потім промивають стерильною водою. Ізолювання насіннєвих зачатків із закритих пуп'янків проводять в асептичних умовах під стереоскопічним мікроскопом МБС-1 або збільшуваною лупою, відриваючи пінцетом пуп'янок від пагона і руйнуючи голкою шар паренхімних клітин нижньої частини зав'язі, та висаджують їх на модифіковане живильне середовище Гамборга і Евелега (В5), доповнене біотином 10,0 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, дропом - 1,0 мг/л. Культивування незапліднених насіннєвих зачатків відбувається упродовж 2-3 тижнів у темряві за температури 27-33 °C. В подальшому культивування проводять упродовж 60 діб за температури 24±2 °C та при 16-годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк. Отримані із калюсу рослини оцінюють за рівнем геному та пересаджують на модифіковане живильне середовище з колхіцином 0,05-0,5 % та експозицією 7 діб. Культуральні рослини пересаджують на живильне середовище для розмноження та оцінюють за рівнем плоїдності і відбирають подвоєні гаплоїди. Відомий і пропонований способи отримання дигаплоїдних рослин мають спільні ознаки: попередня холодова обробка вихідного матеріалу при температурі +4 °C, стерилізація матеріалу, вилучення незапліднених насіннєвих зачатків, приготування живильних середовищ, використання колхіцину, оцінка матеріалу за рівнем плоїдності. Проте, відомий спосіб одержання дигаплоїдних рослин цукрових буряків з ізольованих недозрілих зачатків не дає можливості отримати достатню кількість стерильних життєздатних проростків та не забезпечує індукції гаплоїдних рослин у міскантусу, і висока концентрація колхіцину не тільки не забезпечує переведення на поліплоїдний рівень рослин, а призводить до їх загибелі. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб отримання дигаплоїдних рослин міскантусу, що дозволить удосконалити стерилізацію рослинного матеріалу і склад живильного середовища, отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу та підібрати оптимальну концентрацію колхіцину, яка забезпечуватиме поліплоїдний ефект. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі отримання дигаплоїдних форм для стерилізації пагонів з пуп'янками використовують 5-10 % розчин хлораміну протягом 30 хвилин, потім промивають стерильною водою. Попередньо проводять холодову обробку квіткових пагонів цукрових буряків при температурі +4 °C до 8 діб. Ізольовані насіннєві зачатки із закритих пуп'янків висаджують на модифіковане живильне середовище Гамборга і Евелега (В5), доповнене біотином - 10,0 мг/л, НОК - 0,5 мг/л, дропом - 1,0 мг/л. Упродовж 2-3 тижнів у темряві за температури 27-33 °C культивують незапліднені насіннєві зачатки, а потім при 16 годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк. Отримані із калюсу рослини оцінюють за рівнем геному та пересаджують на модифіковане живильне середовище з колхіцином 0,050,5 % та експозицією 7 діб. Культуральні рослини пересаджують на живильне середовище для розмноження та оцінюють за рівнем плоїдності і відбирають подвоєні гаплоїди. У запропонованому способі використовують сегменти волоті, із яких вилучають незапліднені насіннєві зачатки міскантусу, яким попередньо проводять холодову обробку при температурі +4 °C до 2 діб, стерилізують їх 35 % розчином Білизни за експозиції 40 хвилин і промивають дистильованою водою, що дозволяє отримати 82 % стерильного матеріалу. Використовують модифіковане живильне середовище Мурасіге і Скуга з додаванням БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, кінетину - 1,2 мг/л, дропу - 0,5 мг/л. Культивування за температури 24±2 °C у темряві упродовж 2 тижнів, а потім при 16 годинному фотоперіоді з інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк. Індуковані рослини пересаджують на середовище з колхіцином у концентрації - 0,02 % за експозиції - 12 годин, в подальшому їх відсаджують на живильне середовище та оцінюють. 1 UA 79704 U 5 10 15 20 25 30 35 Новими відмінними від існуючого найближчого аналога ознаками є: введення в стерильну культуру незапліднених насіннєвих зачатків міскантусу; використання для стерилізації Білизни - 35 %; експозиція 40 хвилин; холодова обробка - 2 доби; мінеральна основа середовища - MS; колхіцин - 0,02 %; експозиція колхіцину - 12 годин; додавання у середовище БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, кінетину - 1,2 мг/л, дропу - 0,5 мг/л. Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими дозволяють отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу, удосконалити та знизити затрати на стерилізацію вихідного матеріалу і склад живильного середовища, підібрати оптимальну концентрацію колхіцину, яка забезпечуватиме поліплоїдний ефект. Ефективність способу отримання дигаплоїдних форм міскантусу вивчали на п'яти сортах: Early, Late, Sinensis, Sachariflorus, New. Результати досліджень вказують, що для міскантусу не варто використовувати хлорамін, а доцільніше розчин Білизни 35 % за експозиції 40 хвилин, що забезпечує стерильність експлантів на 82,0 %. На живильному середовищі Гамборга і Евелега (В 5) не відбувається індукція органогенезу. Використання модифікованого живильного середовища за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, кінетину 1,2 мг/л, дропу - 0,5 мг/л дозволили отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу. Концентрація 0,05-0,5 % колхіцину за експозиції 7 діб для міскантусу є занадто високою, а 0,02 % за експозиції 12 годин дає можливість отримати 12-15 % виходу дигаплоїдних форм. Спосіб отримання дигаплоїдних форм міскантусу у культурі in vitro здійснюється таким чином: як вихідний матеріал використовують сегменти волоті міскантусу, які піддають холодовій обробці при температурі +4 °C до 2 діб. Стерилізують їх 35 % розчином Білизни за експозиції 40 хвилин і промивають дистильованою водою, що дозволяє отримати 82,0 % стерильного матеріалу. Пересаджують стерильні ізольовані насіннєві зачатки на модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга (БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, кінетин 1,2 мг/л, дроп 0,5 мг/л) та культивують за температури 24±2 °C у темряві упродовж 2 тижнів, а потім при довжині фотоперіоду 16 годин з інтенсивністю освітлення 2000-3000 лк. Утворені рослини піддають цитологічному аналізу. Відбирають потрібний матеріал та пересаджують на середовище з колхіцином у концентрації - 0,02 % за експозиції 12 годин. Колхіциновані рослини пересаджують на живильне середовище без колхіцину та проводять цитологічну оцінку і відбирають дигаплоїдні форми міскантусу (табл.). Таблиця Показники ефективності використання запропонованого способу дигаплоїдних форм міскантусу у культурі in vitro Показники Відомий спосіб Запропонований спосіб Експлант незапліднені насіннєві зачатки незапліднені насіннєві зачатки Стерилізація, % 5-10 % хлорамін білизна -35 % Експозиція, хвилин 30 40 Холодова обробка, діб 8 2 Стерильність експлантів, % 52,0 82,0 Мінеральна основа середовища В5 MS БАП/БА, мг/л 0,5-1,0 0,5 ІОК, мг/л 0,5 НОК, мг/л 0,5 Колхіцин, % 0,05-0,5 0,02 Кінетин, мг/л 1,2 Біотин 10,0 мг/л 10,0 Дроп, мг/л 1,0 0,5 Експозиція для колхіцину 7 діб 12 годин Індукція макроструктур, % 12 20 Вихід дигаплоїдних форм, % 7 12-15 2 UA 79704 U Продовження таблиці Цукроза, г/л Холодова обробка, °C Довжина фотоперіоду, годин Температура культивування, °C 5 30,0 4 16 24±2 30,0 4 16 24±2 Впровадження запропонованої корисної моделі дозволить удосконалити стерилізацію рослинного матеріалу і склад живильного середовища, отримати індукцію гаплоїдних рослин міскантусу та підібрати оптимальну концентрацію колхіцину, яка забезпечуватиме поліплоїдизацію та отримання дигаплоїдних форм міскантусу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб отримання дигаплоїдних форм міскантусу у культурі in vitro, що включає попередню холодову обробку вихідного матеріалу при температурі +4 °C, стерилізацію матеріалу, вилучення незапліднених насіннєвих зачатків, приготування живильних середовищ, використання колхіцину, оцінку матеріалу за рівнем плоїдності, який відрізняється тим, що використовують сегменти волоті міскантусу, які стерилізують 35 % розчином Білизни за експозиції 40 хвилин, для індукції використовують модифіковане живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга з додаванням БА - 0,5 мг/л, ІОК - 0,5 мг/л, кінетину - 1,2 мг/л, дропу 0,5 мг/л, для отримання дигаплоїдних форм використовують 0,02 % колхіцин за експозиції 12 годин. 20 Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3