Спосіб відтворення тканин печінки в експерименті при цирозі

Реферат: Винахід належить до галузі медицини, а саме до гепатології, та стосується способу відтворення тканин печінки в експерименті при цирозі печінки шляхом застосування збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП), яку вводять у печінку в дозі 0,1 мл з концентрацією тромбоцитів 1 000 000 мкл, при цьому після першої ін'єкції ЗТП, яку вводять тричі на 14, 28 та 42 добу, досліджують експериментальну ділянку шляхом патоморфологічних досліджень із забарвленням, і при нормалізації розмірів печінки та відтворенні її нормальної мікроструктури корекцію ураження тканин печінки вважають ефективною. UA 111669 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до області медицини, а саме гепатології, і може бути використаний для відтворення тканин печінки при циротичному та фібринозному її ураженні. Цироз печінки є однією з важливих проблем терапії цієї патології, так як відомо, що це захворювання більш всього спостерігається у людей працездатного віку від 30 до 65 років і призводить до розвитку портальної гіпертензії та печінкової недостатності [1]. Лікування цієї патології займає одне з перших місць сучасної гепатології, бо рівень летальності при цьому захворюванні вкрай великий. Цироз є хронічним захворюванням печінки, що характеризується дифузними змінами структури її паренхіми у вигляді гепатоцелюлярного фіброзу [2]. Найбільш близьким до заявленого технічного рішення є розробка, в якій для фізіологічної та морфологічної регенерації печінкової тканини при цирозі печінки застосовуються стовбурові клітини шляхом їх трансплантації [3]. Однак клінічне застосування стовбурових клітин має серйозні проблеми: - імунне відторгнення і реакція "трансплантат проти хазяїна"; - можлива трансформація їх в пухлинні клітини; - складність і дорожнеча методик їх виділення; - етичні та релігійні обмеження. В основу винаходу поставлена задача вдосконалення способу відтворення тканин печінки в експерименті шляхом застосування збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП) та подальшого послідовного патоморфологічного дослідження із забарвленням клітин печінки, що дозволить вірогідно ідентифікувати репаративні та регенеративні її властивості в експерименті при використанні ЗТП. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з винаходом, застосовують ЗТП у дозі 0,1 мл з концентрацією тромбоцитів 1 000 000 мкл, при цьому після першої ін'єкції ЗТП, яку вводять тричі на 14, 28 та 42 добу, досліджують експериментальну ділянку шляхом патоморфологічних досліджень із забарвленням, і при нормалізації розмірів печінки та відтворенні її нормальної мікроструктури корекцію ураження печінкової тканини вважають ефективним. Спосіб виконується наступним чином Розробка патогенетично обґрунтованих методів лікування цирозу печінки вимагає з'ясування регуляції основних механізмів фіброгенезу. Відомо, що в цей процес залучені цитокіни, інші розчинні регуляторні фактори та їх міжклітинні сигнальні шляхи [4]. Перспективним методом відтворення структурної цілісності та функціональної активності органів, що уражені, вважають збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) [5]. Дослідження було проведено на статевозрілих самцях щурів Wistar віком 4-5 місяців, масою 230-280 г. Для моделювання цирозу печінки перорально вводили розчин моторної та оливкової олії концентрацією 50 % у дозі 0,4 мл кожну третю добу протягом 16 тижнів, для пиття пропонували водний розчин спирту етилового концентрацією 10 % за потребою [6]. ЗТП виділяли із цільної крові на апараті SmartPrep (Harvester Corp., USA), свідоцтво про держреєстрацію № 10179/2011 згідно Наказу Держлікінспекції МОЗ України від 08 лютого 2011 р. № 69. Тварин розподілили на 3 групи: 1 група - тварини з модельованим цирозом печінки; II група тварини з модельованим цирозом печінки та наступним введенням ЗТП внутрішньопечінково, двічі; III група - тварини з модельованим цирозом печінки та наступним введенням фізіологічного розчину в ті ж самі терміни, що й ЗТП тваринам II групи; окрема група тварин слугувала інтактним контролем. Початком експерименту вважали перший день після останньої ін'єкції. Проводили патоморфологічне дослідження печінки з забарвленням за стандартними методиками. Виведення тварин з експерименту відбувалося через 2 та 6 тижнів після останнього введення ЗТП або фізіологічного розчину у відповідних групах, вважаючи цей день нульовим днем експерименту. Підготування тварин до експерименту, всі інвазивні втручання, знеболювання та виведення з експерименту проводили згідно Закону України "Про захист тварин від жорсткого поводження" № 27, ст. 230 від 2006 p., із змінами, внесеними відповідно Закону № 1759-VI (1759-17) від 15.12.2009, ВВР, 2010, № 9, ст. 76. I група тварин Через 2 тижні від початку експерименту розміри печінки достовірно зменшуються у порівнянні з контролем. На фіг. 1а, б показані порушення часточкової структури печінки з початковою тенденцією до формування хибних часточок; розростання сполучної тканини; лімфогістіолімфоцитарний 1 UA 111669 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інфільтрат; розширення синусоїди; гіпертрофія судинних стінок; розширення жовчних проток; виразна вогнищева дрібно- та великокрапельна дистрофія. Забарвл. 1а - за Ван-Гізон, 1б гематоксилінсозин; зб. X 400. Через 6 тижнів від початку експерименту після завершення моделювання цирозу печінки розміри її зменшені, паренхіма коричневого кольору, щільна з дрібновузелковою структурою. Спостерігається розширення та фіброз портальних трактів з лімфогістіоцитарною інфільтрацією. Виявляється порушення часточкової структури за рахунок розростання тяжів волокнистої сполучної тканини з формуванням хибних часточок. З'являються фокуси центролобулярних некрозів, набряк та нерівномірне забарвлення гепатоцитів, вогнища дрібнота великокрапельної жирової дистрофії гепатоцитів. Вміст ШИК-позитивних речовин знижений. II група тварин Через 2 тижні від початку експерименту розміри печінки помірно зменшені у порівнянні з контрольною групою. Спостерігається помірне розширення портальних трактів з фокусами лімфогістіоцитарної інфільтрації, проліферацією судин, дрібних капілярів, гістіоцитів. Подекуди виявляється руйнація часточкової будови з тенденцією до формування хибних часточок. Гепатоцити мають ознаки жирової дистрофії: набряклі, повнокров'я судин, цитоплазма забарвлена нерівномірно, групи гепатоцитів з дрібними "оптично запустілими" вакуолями в цитоплазмі. Через 6 тижнів від початку експерименту після останнього введення ЗТП, спостерігається нормалізація розмірів печінки. Спостерігається помірне розширення портальних трактів з фокусами лімфогістіоцитарної інфільтрації та проліферацією капілярів мікроциркуляторного русла. Структура часточок збережена. Виявляються вогнища двоядерних гепатоцитів, їх кількість зростає як у порівнянні з І групою, так і порівняно з контролем. У центрі часточок спостерігається помірний периваскулярний фіброз. Гепатоцити з нерівномірним забарвленням цитоплазми, групи клітин з ознаками дрібно-крапельної жирової дистрофії. Підвищується вміст ШИК-позитивних речовин порівняно з І групою у цей самий термін спостереження, (фіг. 2а, б забарвл. 2а - за Ван-Гізон, 2б - гематоксилінсозин; зб. X 400. III група тварин Через 2 тижні від початку експерименту розміри з модельованим цирозом достовірно зменшені у порівнянні з групою контролю. Паренхіма органу підлягла вузликовій трансформації. Виявляються гепатоцити з тінями ядер. Спостерігаються зони некрозу, вакуольної дистрофії та порушення цілісності ядерної та цитоплазматичної мембран, розростання сполучної тканини з високим вмістом гістіоцитів та лімфоцитів. Вміст ШИК-позитивних речовин різко знижений. Через 6 тижнів від початку експерименту, після останнього введення фізіологічного розчину, розміри печінки залишаються майже на рівні попереднього терміну, спостерігається вузликова трансформація, вогнища некрозу, виражені сполучнотканинні тяжі. Співставлення результатів патоморфологічного дослідження печінки тварин на тлі експериментального цирозу без лікування та після введення ЗТП показало, що застосування ЗТП сприяє активній регенерації тканини печінки. Через 6 тижнів після останнього введення ЗТП в структурі органу спостерігаються ознаки активної регенерації печінки: нормалізуються розміри органу, відтворюється часточкова організація, виявляються скупчення двоядерних гепатоцитів, виявляється велика кількість новоутворених судин, зростає вміст ШИК-позитивних речовин. Ці результати лікування експериментального цирозу отримані вірогідно внаслідок впливу підвищеної концентрації цитокінів, що вивільнилися із ЗТП, сприяючи клітинному росту та диференціюванню, утворенню та росту судин, синтезу колагену, проліферації фібробластів, тобто процесам неоангіогенезу та регенерації тканини печінки після токсичного ураження. Той факт, що тромбоцити індукують міграцію та адгезію стовбурових та прогеніторних клітин у ділянки ангіогенезу, може пояснити стимулювання проліферації та диференціації клітин у зрілі ендотеліальні попередники. У групі тварин без лікування відбувалося стійке прогресування ознак фіброзно-некротичних змін. Таким чином, на підставі отриманих даних можна зробити висновок про те, що застосування збагаченої тромбоцитами плазми сприяє зниженню об'єму сполучної тканини та кількості колагенових волокон у місцях загибелі гепатоцитів внаслідок цирозу; введення ЗТП призводить до активної регенерації тканини печінки з відтворенням її мікроструктури. Важливим є також те, що ЗТП є сумішшю автологічних клітин, цілком фізіологічних для організму, і не потребує імуносупресії та створення особливих умов для лікування, як це зазвичай відбувається при трансплантації гетерогенного матеріалу. У порівнянні з прототипом запропоноване технічне рішення, за рахунок використання ЗТП, дозволяє досягти якісного та більш швидкого відтворення мікроструктури тканин печінки, що, в 2 UA 111669 C2 5 10 15 20 свою чергу, дозволяє зберегти морфологічні властивості тканини та органу в цілому. Цьому допомагає низка факторів, а саме велика кількість білкових молекул, в тому числі й сигнальних мембранних протеїнів, цитокінів та інших біологічно активних сполук, що вивільняються з тромбоцитів, підсилюючи ангіогенез, проліферацію клітинних елементів у зоні ураження, а також беруть участь у процесах адаптації, внаслідок чого застосування ЗТП сприяє процесам швидкої регенерації тканини печінки після ураження. Джерела інформації: 1. Anand В., Melcher M.L., Schleyer A.M. Cirrhosis //Elsevier BV, 2012. - 418 p. 2. Henderson N.C., Forbes S.J. Hepatic fibrogenesis: from within and outwith /N.C. Henderson, S.J. Forbes //Toxicology. - 2008. - Vol. 30. - N. 254(3). - P. 130-135/ 3. Friedman S.I. Hepatic fibrosis-overview /S.I. Friedman //Toxicology. - 2008. - Vol. 30. - N. 254(3). - P. 120-129. 4. Saile В., Ramadori G. Inflammation, damage repair and liver fibrosis-role of cytokines and different cell types /B. Saile, G. Ramadori //Zeitschrift fur Gastroenterologie. - 2007. - Vol. 45(l)/ - P. 77-86/ 5. Відтворення репродуктивної функції самців мишей під впливом збагаченої тромбоцитами плазми /В.М. Запорожан, О.Л. Холодкова, О.О. Аппельханс та ін…// Вісник морфології. - 2012. Т. 18, № 2. - С. 271-275. 6. Карташова О.Н., Блюгер А.И. Симуляция патологического процесса в печени. Рига: Звайгне, 1975. - 140 с. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 Спосіб відтворення тканин печінки в експерименті при цирозі печінки, використовуючи суміш, отриману із крові людини, який відрізняється тим, що застосовують збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) шляхом введення у печінку у дозі 0,1 мл з концентрацією тромбоцитів 1 000 000 мкл, при цьому після першої ін'єкції ЗТП, яку вводять тричі на 14, 28 та 42 добу, виконують патоморфологічне дослідження експериментальної ділянки, забарвлюють її і при нормалізації розмірів печінки та відтворенні її нормальної мікроструктури корекцію ураження тканин печінки вважають ефективною. 3 UA 111669 C2 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4