Спосіб відтворення тканин печінки при експериментальному гепатиті

Реферат: Спосіб відтворення тканини печінки при експериментальному гепатиті включає використання суміші, отриманої із крові людини. Застосовують збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) у дозі 0,1 мл з концентрацією тромбоцитів 1000000 мкл. Після першої ін'єкції ЗТП на 14 та 30 добу досліджують експериментальну ділянку шляхом патоморфологічних досліджень із забарвленням, і при нормалізації розмірів печінки та відтворенні її нормальної мікроструктури корекцію ураження тканини печінки вважають ефективною. UA 95244 U (54) СПОСІБ ВІДТВОРЕННЯ ТКАНИН ПЕЧІНКИ ПРИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМУ ГЕПАТИТІ UA 95244 U UA 95244 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до області медицини, а саме експериментальної медицини і може використовуватися в хірургії, а також для відтворення тканини печінки в абдомінальній та гнійній хірургії, гастроентерології, онкології при лікуванні цирозу та токсичних уражень печінки, і може бути застосована для відтворення тканин печінки при експериментальному гепатиті. Корисна модель належить до області медицини, а саме експериментальної, а також може використовуватися в хірургії, для відтворення тканини печінки в абдомінальній та гнійній хірургії, гастроентерології, онкології при лікуванні цирозу та токсичних уражень печінки, і може бути застосована для відтворення тканин печінки при експериментальному гепатиті. На цей час токсичний гепатит є однією з найважливіших проблем сучасної гематології, оскільки його наслідком може бути фіброзування печінкової тканини з формуванням печінкової недостатності та цирозу [1]. Як пошкоджуючі чинники виступає ціла низка речовин, що мають гепатотоксичний ефект [2]. Відсутність радикальних методів лікування тяжких наслідків токсичного ураження печінки викликає необхідність пошуку нових терапевтичних стратегій. Розробляються вченими методики, що застосовані на використанні клітинних та генних технологій при лікуванні пацієнтів з цирозом печінки. Відоме використання регенераційного потенціалу стовбурових клітин пуповинної крові і тканинної терапії за Філатовим. Але ці методи не є універсальними. Найбільш близькою до запропонованого технічного рішення є розробка, в якій застосовується гемопоетичні клітини - попередники кордової крові (ГКП КК) [3]. Однак ці суміші викликають у ряді випадків реакції, пов'язані з імунною несумісністю. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу відтворення тканин печінки шляхом застосування збагаченої тромбоцитами плазми (ЗТП), в якій точно визначено апаратним методом концентрацію тромбоцитів у плазмі та розрахована кількість ростових факторів, що дозволить вірогідно ініціювати репаративні і регенеративні властивості печінки в експерименті при використанні ЗТП. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, застосовують збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) у дозі 0,1 мл з концентрацією тромбоцитів 1000000 мкл, при цьому після першої ін'єкції ЗТП на 14 та 30 добу досліджують експериментальну ділянку шляхом патоморфологічних досліджень із забарвленням, і при нормалізації розмірів печінки та відтворення її нормальної мікроструктури корекцією ураження тканин печінки вважають ефективною. Спосіб використовується наступним чином. Дослідження проведено на статевозрілих самцях мишей лінії ICR масою 28-32 г. Для моделювання фіброзу печінки перорально протягом 2 місяців внутрішньошлунково вводили розчин чотирихлористого вуглецю концентрацією 50 % у дозі 0,05 мл. ЗТП виділяли з цільної крові на апараті SmartPrep (Harvester Corp., USA), свідоцтво про держреєстрацію № 10179/2011, згідно з Наказу Держлікінспекції МОЗ України від 08 лютого 2011р. № 6 [4]. Розподіл тварин здійснювався наступним чином: І група - тварини з модельованим фіброзом печінки; II група - тварини з модельованим фіброзом печінки та наступним введенням ЗТП внутрішньопечінково двічі; III група - тварини з модельованим фіброзом печінки та наступним введенням фізіологічного розчину в ті ж самі терміни, що й ЗТП тваринам II групи; IV група інтактні тварини. Початком експерименту вважали перший день після останньої ін'єкції. Проводили патоморфологічне дослідження печінки з забарвленням за стандартними методиками. Підготування тварин до експерименту, всі інвазивні втручання, знеболювання та виведення з експерименту проводили, згідно з Законом України "Про захист тварин від жорсткого поводження" № 27, ст… 230 від 2006 р., із змінами, внесеними відповідно закону № 1759-VI (1759-17) від 15.12.2009, ВВР, 2010, № 9, ст. 76. Через два тижні від початку експерименту у тварин І групи патоморфологічне дослідження виявило зменшення розмірів печінки у порівнянні з контролем. Спостерігалося утворення вузлів по всій площі печінки. Розміри гепатоцитів були меншими порівняно з контрольною групою. Виявлялися зони некрозу та вакуольної дистрофії, монолобулярні вузлики. Судини характеризувалися кровонаповненням, портальні тракти були розширенні, виявлялися явища стазу та скупчення сполучної тканини навколо центральної вени. Спостерігалися сполучнотканинні тяжі від центру в напрямку периферії часток (фіг. 1). [Забарвлення за Ван Гізоном. Збільшення, х 100. Печінка тварин через два тижні після закінчення введення тетрахлорметану - розростання сполучної тканини]. 1 UA 95244 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В гепатоцитах виявлялися явища жирової дистрофії та зниження вмісту ШИК - позитивних речовин (фіг. 2). [Забарвлення Суданом III, збільшення х 200. Печінка тварин через 2 тижні після закінчення введення тетрахлоретану - ознаки жирової дистрофії]. У тварин II групи в цей самий термін розміри печінки повільно зменшенні у порівнянні з контрольною групою. Спостерігаються поодинокі мономодулярні вузлики, поруч з якими розташована велика кількість двоядерних гепатоцитів. Виявляються новоутворені судини та жовчні протоки в портальних трактах (фіг. 3). [Забарвлення гематоксилін - еозином. Збільшення x 100. Печінка тварин через 2 тижні після останнього введення ЗТП - велика кількість новоутворених судин]. В окремих місцях знайдені ділянки з явищами лімфоцитарної інфільтрації центрального типу. Судини кровонаповненні. Портальні тракти помірно розширені. У центрі часточок виявлено розростання сполучної тканини, помірний периваскулярний фіброз з поодинокими явищами гіалінозу. У деяких тварин спостерігаються ознаки мілко крапчастої жирової дистрофії на периферії часточок. Виявляється незначна кількість ШИК - позитивних речовин. У тварин III групи розміри печінки зменшенні у порівнянні з групою контролю. Паренхіма органу підлягла вузликовій трансформації. Виявляються гепатоцити з тінями ядер. Спостерігаються зони некрозу, вакуольної дистрофії та порушення цілісності ядерної та цитоплазматичної мембран, розростання сполучної тканини з високим вмістом гістоцитів та лімфоцитів. Через 6 тижнів від початку експерименту у тварин І групи розміри печінки різко зменшенні у порівнянні з контрольною групою. Гепатоцити значно зменшені в об'ємі, виявляються гранули гемосидерину, ознаки гідро пічної дистрофії. В окремих ділянках спостерігається центролобулярний некроз, атрофія трабекул. Портальні тракти розширені. Поміж широких сполучнотканинних ділянок розташовані монокулярні вузлики, що містять переважно еластичні волокна (фіг. 4). [Забарвлення гематоксилін - еозином. Збільшення х 100. Печінка тварин через 6 тижнів після закінчення введення тетрахлоретану - активне розростання сполучної тканини]. Різко знижений вміст ШИК - позитивних речовин. У тварин II групи в цей самий термін спостерігається нормалізація розмірів печінки. В поодиноких ділянках виявляються ознаки білкової дистрофії. Кількість двоядерних гепатоцитів різко зростає у порівнянні як з попереднім терміном дослідження, так і з контролем. У портальних тканинах та септах виявлена велика кількість новоутворених судин та жовчних проток. Фіброзні перетинки різко потоншені, зменшений вміст колагенових судин. В центрі частинок спостерігається незначно виражений периваскулярний фіброз, помірно виражена дрібнокрапчаста жирова дистрофія (фіг. 5). [Забарвлення за Ван Гізоном. Збільшення х 100. Печінка тварин через два тижні після останнього введення ЗТП - незначний фіброз та ознаки мілкокрапельної жирової дистрофії]. В центрі часточок виявляються ділянки із сполучнотканинними тяжами. Вміст ШИК - позитивних речовин значно підвищений у порівнянні з попереднім терміном спостереження та з даними тварин II групи. Розміри печінки тварин залишаються на рівні попереднього терміну. Спостерігається вузликова трансформація, вогнища некрозу, вираженні сполучнотканинні тяжі. Співставлення результатів патоморфологічного дослідження печінки тварин на тлі експериментального фіброзу баз лікування та після введення ЗТП показало, що застосування ЗТП сприяє активній регенерації тканини печінки. Вже через 6 тижнів після останнього ЗТП структура органу майже не відрізняється від такої у інтактних тварин. На протязі всього терміну спостереження у тварин без лікування спостерігалося розростання сполучної тканини на площі всього органу. В цей самий часу тварин після введення ЗТП виявилося достовірне збільшення новоутворених судин, зберігалася балкова структура печінкових часточок, а наприкінці спостереження - збільшення кількості двоядерних гепатоцитів та синусоїдних клітин. Збагачена тромбоцитами плазма являється автологічним концентратом крові, при використанні якого не потрібно імуносупресивної терапії, як це відбувається при застосуванні гетерогенних тканинних та клітинних препаратів. Крім того, ЗТП містить значну кількість цитокінів: епітеліальний фактор росту з тромбоцитів, фактор росту фібробластів, інсуліноподібний фактор росту, судинний ендотеріальний фактор росту та ін. [5]. Таке становище сприяє клітинному росту та диференціюванню, утворенню та росту судин, синтезу колагену, проліферації фібробластів, тобто процесам неоангіонезу та регенерації тканин печінки після токсичного ураження. Той факт, що тромбоцити індукують міграцію і адгезію стовбурових клітин та прогеніторних клітин у ділянки ангіонезу, може пояснити стимулювання проліферації та диференціації клітин у зрілі ендотеліальні попередники. Таким чином, у порівнянні з прототипом, заявлене технічне рішення за рахунок застосування збагаченої тромбоцитами плазми дозволяє досягти зниження об'єму сполучної 2 UA 95244 U 5 10 15 тканини та кількості колагенових волокон у місцях загибелі гепатоцитів внаслідок токсичного впливу, а також швидкої регенерації тканин печінки з відтворенням її нормальної мікроструктури. Джерела інформації: 1. Svegliati-Baroni G. Hepatic fibrinogenesis in response to chronic liver injury: novel insights on the role of cell-to-cell interaction and transition / G. Svegliati-Baroni, S. De Minicis, M. Marzioni. // Liver International. - 2008. - Vol. 28(8). - Р. 1052-1064. 2. Hepatic fibrosis and cirrosis: the (myo)fibroblastic cell subpopulations involved / C. Guyot, S. Lepreux, C. Combe, E. Dudnikoff, et al. // International Journal of Biochemistry & Cell Biology. - 2006. - Vol. 38 (2). - Р. 135-151. 3. Пат. 37688, Україна. Спосіб лікування хворих на цироз печінки. 4. Наказ Держлікінспекції МОЗ України від 08 лютого 2011 р. № 6. 5. Zhao Y. Research progress of platelet-rich plasma in promoting bone regeneration and repairing / Y. Zhao, W. Zhai // Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. - 2010. - Vol. 24, N 8. - P. 1004-1008. 6. Nonunions treated with autologous preparation rich in growth factors / M. Sanchez, E. Anitua, R. Cugat et al. // Journal of Orthopaedic Trauma. - 2009. - Vol. 23(1). - P. 52-59. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб відтворення тканини печінки при експериментальному гепатиті, що включає використання суміші, отриманої із крові людини, який відрізняється тим, що застосовують збагачену тромбоцитами плазму (ЗТП) у дозі 0,1 мл з концентрацією тромбоцитів 1000000 мкл, при цьому після першої ін'єкції ЗТП на 14 та 30 добу досліджують експериментальну ділянку шляхом патоморфологічних досліджень із забарвленням, і при нормалізації розмірів печінки та відтворенні її нормальної мікроструктури корекцію ураження тканини печінки вважають ефективною. 3 UA 95244 U 4 UA 95244 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5