Спосіб санації середовищ для розбавлення сперми жеребців та нейтралізації негативної дії мікотоксинів

Реферат: Винахід належить до галузі сільського господарства, зокрема до біотехнології відтворення коней, та може використовуватись для санації середовищ для розбавлення сперми жеребців та нейтралізації негативної дії мікотоксинів. Відповідно до способу на 100 мл будь-якого UA 112473 C2 (12) UA 112473 C2 середовища додають: цефазолін - 3-6 мг, кантаміцину сульфат - 2-4 мг, натаміцин - 2-6 мг, декаметоксин - 4-7 мг, тіотриазолін - 12-16 мг. UA 112473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі сільського господарства, біології, ветеринарії та зоотехнії, а саме до біотехнології відтворення коней, та може використовуватись для санації середовищ для розбавлення сперми жеребців. У практиці відтворення сільськогосподарських тварин існує багато способів санації середовищ для розбавлення сперми плідників, яка використовується у штучному осіменінні. Головною метою санації середовищ є підвищення запліднюваності та виходу молодняку за рахунок профілактики гінекологічних захворювань самок після штучного осіменіння. Для санації середовищ у їх склад, як правило, уводять антибіотики, сульфаніламіди, антисептики. Найбільш широко застосовують пеніцилін, стрептоміцин, стрептоцид, левоміцетин, поліміксин, гентаміцин, енрофлоксацин, тилозин та інші. Головним недоліком тривалого застосування бактерицидних препаратів в середовищах для розбавлення сперми є те, що з'являються штами мікроорганізмів, які нечутливі до цих препаратів. Антибіотики та антибіактеріальні речовини діють лише на бактеріальну мікрофлору і нездатні вплинути на розвиток мікроміцетів та нейтралізувати продукти їх метаболізму (наприклад мікотоксини та інші). Сьогодні у практиці відтворення коней України використовуються середовища ЛХЦЖ Всеросійського інституту конярства, імпортні середовища SMAY та KENNEY для розбавлення сперми, які не містять антибіотиків, антимікотиків, антиоксидантів та речовин, які нейтралізують дію мікотоксинів. У 2006 році науковцями Всеросійського науково-дослідного інституту конярства до середовища ЛХЦЖ було додано препарат для санації "Поліген", який містить колістин або поліміксин та гентаміцин [Атрощенко М.М. Полиген для санации спермы жеребцовпроизводителей / М.М. Атрощенко // Ветеринария. - 2006. - N 2. - С. 40-43]. У 2007 році групою авторів було проведено експериментальні дослідження порівняння ефективності додавання двох антибіотиків до середовища KENNEY для розбавлення сперми жеребців: це ticarcillin та piperacillin [Dietz J. P. Comparison of ticarcillin and piperacillin in Kenney's semen extender / J. P. Dietz, P. L. Sertich, R. C. Boston, С. Е. Benson // Theriogenology. - 2007, Volume 68, Issue 6. - P. 848-852]. Проте не тільки вірусна, бактеріальна або мікроміцетна мікрофлора негативно впливають на спермії і знижують запліднюючу здатність сперми жеребця. Більшість дослідників упускають із зору той факт, що і продукти обміну мікрофлори сперми здатні негативно вливати на показники якості сперми від яких залежить запліднюваність. Наприклад, групою італійських дослідників у 2011 році було доведено, що мікотоксини здатні негативно впливати на показники якості свіжорозбавленої сперми жеребців. Проте досліджень впливу мікотоксинів на ефективність кріоконсервування сперми та штучного осіменіння кобил автори не проводили. Автори відмітили, що мікотоксини здатні накопичуватись в організмі жеребця у тканинах простати, сім'яниках та інших органах зв'язуючись з гіалуроновою кислотою; в сечі жеребців виявляли до 6,8 мМ мікотоксину зеараленону [Dose-response effects of estrogenic mycotoxins (zearalenone, alpha-and beta-zearalenol) on motility, hyperactivation and the acrosome reaction of stallion sperm / [A. Filanninol, T. Stout, B. Gadella et all] // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2011, 9:134]. З цієї інформації можна зробити висновок про те, що, якщо мікотоксини виділялись у дуже великих кількостях з сечею, вони так само можуть виділятись і зі спермою жеребця при еякуляції, оскільки анатомічно і сеча, і сперма проходять через один сечостатевий канал уретру. Існують середовища для розбавлення сперми жеребців Gent та EquiPlus компанії Minitube International з антибіотиком (антибіотиками), назва яких є комерційною таємницею і не розголошується [Інтернет-публікація. http://www.minitube.de /DE_eng/ Products-Services / Equine / Semen-Extenders / Gent-Liquid-Equine-Extender-for-fresh-semen-45-ml]. Недоліками аналогу є те, що середовище містить лише антибіотик (антибіотики), а їх дія спрямована лише на бактеріальну мікрофлору, і жодним чином не стримує розвиток мікроміцетної (грибкової) контамінації сперми; середовище не здатне нейтралізувати негативний вплив кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів та продуктів обміну мікроміцетів (мікотоксинів); оскільки назва антибіотика (антибіотиків) невідома то можливий випадок, коли при проведенні осіменіння у кобили буде якась алергічна реакція на той невідомий антибіотик. Найбільш близьким технічним рішенням до заявленого винаходу є середовище "INRA 96" для жеребців компанії IMV-technologies, яке містить два антибіотики (пеніцилін та гентаміцин) та противогрибковий засіб "amphotéricine В" [Інтернет-публікація. http: // www.imv-technologies.com /nossolutions / equin / detail /product / inra-96-milieu-de-conservation-de-la-semence-fraiche-equineflacon-de-200-ml.html]. Недоліками прототипу є те, що кількість противобактеріальних та противогрибкових антибіотиків не розголошується, а тому вони можуть бути використані лише у складі того середовища, до якого розроблялись; середовище не здатне нейтралізувати негативний вплив 1 UA 112473 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів на спермії, адже не має компонентів здатних виконувати таку функцію; середовище не має компонентів для нейтралізації негативного впливу продуктів обміну мікроміцетів (грибів) - мікотоксинів, які дуже сильно пошкоджують клітинну стінку сперміїв, а відтак знижують запліднюючу здатність сперми; антибіотики пеніцилін та гентаміцин, які є у складі "INRA 96", тривалий час застосовуються з метою санації сперми, а тому застаріли. Отже, жодне з існуючих у світі середовищ для розбавлення сперми жеребців не здатне нейтралізувати негативний вплив мікотоксинів на спермії. В основу винаходу поставлено задачу розробити новий спосіб санації середовищ для розбавлення сперми жеребців та нейтралізації негативної дії мікотоксинів, який буде мати у своєму складі антибіотики проти бактеріальної мікрофлори і знижувати її кількість; буде мати у своєму складі антибіотики проти грибкової (мікроміцетної) мікрофлори для зниження її кількості; буде нейтралізувати негативну дію на спермії мікотоксинів, які є продуктами обміну мікроміцетів; буде нейтралізовувати негативний вплив кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів, кількість яких збільшується від діяльності бактерій та грибів; забезпечить можливість використання у будь-якому середовищі для розбавлення сперми жеребців, яке не містить антибактеріальних, антигрибкових, антиоксидантних компонентів та компонентів, що нейтралізують вплив мікотоксинів; буде підвищувати запліднюючу здатність свіжорозбавленої, охолодженої або відталої сперми жеребців-плідників і результативність штучного осіменіння кобил. Поставлена задача вирішується тим, що при розробці способу санації середовищ для розбавлення сперми жеребців та нейтралізації негативної дії мікотоксинів, який включає антибактеріальні та антигрибкові антибіотики, і згідно запропонованого винаходу для санації 100 мл будь якого середовища як антибактеріальні антибіотики додають цефазолін - 3-6 мг та канаміцину сульфат - 2-4 мг, як антигрибкові компоненти додають натаміцин - 2-6 мг та декаметоксин - 4-7 мг, для нейтралізації негативної дії мікотоксинів та кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів додають тіотриазолін - 12-16 мг. Приклади конкретного виконання. 1. У 100 мл середовищ ЛХЦЖ, SMAY та KENNEY або інших, які не містять антибіотиків, противогрибкових антибіотиків, речовин, що нейтралізують негативну дію кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів, мікотоксинів та нафтохінонів було додано цефазолін - 3-6 мг, канаміцину сульфат - 2-4 мг, натаміцин - 2-6 мг, декаметоксин - 4-7 мг, тіотриазолін - 12-16 мг. Цефазолін є антибіотиком групи цефалоспоринів з широкою бактерицидною активністю. Кантаміцину сульфат є антибіотиком групи аміноглікозидів з широким спектром бактерицидної дії. Натаміцин є протигрибковим макролідним антибіотиком полієнового ряду, протигрибкова активність якого проявляється за рахунок блокування стеролів клітинних мембран грибів (мікроміцетів). Декаметоксин є антисептиком з фунгіцидною (протигрибковою), простоцидною, вірусоцидною та антимікробною дією. Тіотриазолін має виражені мембраностабілізуючі, антиоксидантні, репаративні, імуномодулюючі та протиішемічні властивості; він здатен підсилювати активацію анаеробного гліколізу без змін внутріклітинного фонду АТФ, а також підсилює антиоксидантну систему, чим зменшує негативний вплив кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів, за рахунок чого нейтралізує негативний вплив мікотоксинів на спермії жеребця. 2. Потім було проведено отримання сперми від жеребців. Кожний отриманий еякулят із 44 ділили на 5 рівних частин (великий об'єм еякуляту жеребця дозволяє це робити). Першу частину розбавляли середовищем прототипу "INRA 96", другу-третю-четверту розбавляли середовищами без сануючих речовин ЛХЦЖ або SMAY або KENNEY - санували їх розробленим способом і визначали бактеріальну та мікроміцетну забрудненість, рухливість, виживаність та запліднюваність сперми, рівень кінцевих продуктів перекисного окиснення ліпідів (табл.). До п'ятої частини еякуляту додавали мікотоксини і перевіряли здатність середовища нейтралізовувати їх негативний вплив на сперму. А саме, до цієї частини еякуляту додавали 0,5 мМ зеараленону та 0,5 мМ Т-2 токсину одночасно (табл.). 2 UA 112473 C2 Таблиця Порівняльна ефективність санації середовищ для розбавлення сперми жеребців (м±М, n=44) Показник 3 Бактеріальна контамінація, КУО/см Кратність зниження, разів 3 Мікроміцетна контамінація, КУО/см Кратність зниження, разів Рухливість нативної сперми, бали Рухливість відталої сперми, бали Виживаність відталої сперми, годин ЦК (дієнові кон'югати), мкМ/л МДА (малоновий діальдегід), нМ/мл Запліднюваність кобил охолодженою спермою, % Запліднюваність кобил відталою спермою, % Рухливість відталої сперми з додаванням 0,5 мМ зеараленону та 0,5 мМ Т-2 токсину Виживаність відталої сперми з додаванням 0,5 мМ зеараленону та 0,5 мМ Т-2 токсину Показники нативної сперми жеребця 4729,1±36,9 2182,3±41,6 Середовище прототип "INRA 96" 2043,6±8,8*** 2,3 1047,3±13,0*** 2,1 Розроблений спосіб 714,5±7,5*** 6,6 84,84±1,75*** 25,7 6,50±0,19 3,78±0,12 3,45±0,15 17,75±0,60 7,19±0,39 3,85±0,12 3,98±0,16* 13,28±0,23*** 4,22±0,14*** 82,20±0,40 93,60±1,90* 60,00±0,90 67,45±0,75* 0,59±0,06 2,86±0,10*** 1,09±0,09 2,82±0,18*** Примітка: *-р