Спосіб відбору батьківських форм із використанням епігенетичного маркеру екологічної пластичності при селекції пшениці на стійкість до кліматичних змін

Реферат: Спосіб відбору батьківських форм із використанням епігенетичного маркера екологічної пластичності при селекції пшениці на стійкість до кліматичних змін, який включає: виділення і аналіз ДНК із двох граничних за швидкістю проростання субпопуляцій проростків злаків, проведення оцінки профілів метилування шляхом рестрикційного аналізу ДНК обох груп проростків з найбільш доступними рестриктазами та ISSR-ITS-RAPD-ПЛР з неспецифічні праймерами із невеликою кількістю кроків, співставлення наборів електрофореграм (для різних рестриктаз і праймерів) для обох субпопуляцій проростків, розрахунок різниці, "відстані" між наборами електрофореграм за методом Неї, що характеризує епігенетичний поліморфізм сирі) і названого епігенетичним маркером, значення якого корелює із здатністю сорту пристосовуватись до змін клімату. UA 115484 U (54) СПОСІБ ВІДБОРУ БАТЬКІВСЬКИХ ФОРМ ІЗ ВИКОРИСТАННЯМ ЕПІГЕНЕТИЧНОГО МАРКЕРА ЕКОЛОГІЧНОЇ ПЛАСТИЧНОСТІ ПРИ СЕЛЕКЦІЇ ПШЕНИЦІ НА СТІЙКІСТЬ ДО КЛІМАТИЧНИХ ЗМІН UA 115484 U UA 115484 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель відноситься до селекції рослин, зокрема до використання молекулярногенетичних підходів для підвищення точності та скорочення термінів створення нових сортів пшениці. З рівня техніки відомо, що за останні десятиліття на основі значного розширення знань про механізми спадковості формуються молекулярно-генетичні підходи, що дозволяють підвищити точність селекційного процесу та скоротити його терміни. Метод генетичних маркерів (ГМ) дозволяє встановити контроль над бажаною ознакою - з чітким визначенням генів, відповідальних за прояв даної ознаки та метаболічного ланцюжка, в якому задіяні продукти шуканих генів (Casa et al. 2000, Frisch M. et al. 2005; Breseghello, 2013). Розвитком цього методу є створення генетичних мап за допомогою серій молекулярних маркерів, що дозволяє встановити число локусів, від яких залежить ознака, їх взаємозалежність та локалізацію в геномі, включаючи не тільки дискретні менделівські локуси, але й і кількісні ознаки, що контролюються багатьма генами (Quantitative Trait Loci, QTL-метод) (Damerval С. et al. 2005; Wang, J., X et al, 2006, 2007; Cortijo S et al. 2014). Недоліком перерахованих методів є відсутність врахування можливих кліматичних змін та епігенетичного контролю формування адаптивних реакцій до нестабільних погодних умов. Відмінність методу, що пропонується, полягає у використанні епігенетичного маркера екологічної пластичності для вибору батьківських форм при селекції пшениці на стійкість до кліматичних змін. Його розробка базується на трьох надійно встановлених складових. Перша - це механізми контролю експресії генів (епігенетичні механізми, ЕМ), які об'єднують метилування ДНК, ряд хімічних перетворень білків хроматину, що обумовлюють зміни його конформації та активності геном), і інтерференцію РНК. Оскільки всі перераховані процеси щільно поєднані (оглядові статті: Clark D. J., 2010, Тейф В.Б, 2011, Teif V.B., 2015), їх узагальненим показником може виступати зміна профілів метилування ДНК. Другою складовою є дані останніх років, які встановили генералізоване переключення активності геному, що охоплює десятки і навіть сотні генів при формуванні адаптивної реакції до абіотичних чинників (оглядові статті: Colleman, 2010; Zhang et al. 2013, Flares К. В.,2013). Третя складова базується на серії оригінальних досліджень авторів запиту. Було встановлено зв'язок між різним часом проростання насіння одного сорту та врожаю із різницею (поліморфізмом) профілів метилування ДНК рослин, що з нього походять, а також із їх різною стійкістю до стресів. Встановлено, що найбільша різниця ("відстань") у профілях метилування спостерігається у двох граничних за термінами проростання субпопуляцій: тією, що проростає першою і тією, що проростає останньою (Кравец и др.2013, Sokolova et.al. 2013, Sokolova et.al. 2014a; Sokolova et.al.2014в); Далі було встановлено, що чим сорт пшениці більш екологічно пластичний, тобто невибагливий до часу посіву, внесення добрив, обробкою від шкідників і посухи, тим більша "відстань" між профілями метилування крайніх за часом проростання субпопуляцій проростків (Кравець та ін., 2016). Сукупність цих даних свідчить, що будь-яка генетично однорідна популяція рослин має множину епігенетичних програм розвитку з різними захисними реакціями та адаптивними стратегіями. Ключова роль в реагуванні популяції рослин на нестійкість погодних умов залежить не тільки від генів стійкості до певних факторів довкілля, але й епігенетичних механізмів контролю експресії генів, що створюють розмаїття стратегій адаптації до несприятливих факторівсередовища в межах одного сорту. Сорт, що має вищій рівень епігенетичного поліморфізму (більшу "відстань" між профілями метилування ДНК проростків різних за часом проростання субпопуляцій) виявляється і більш гнучким при пристосуванні до нестійких погодних умов. Використання оцінки рівня епігенетичного поліморфізму сорту є головним у запропонованому методу відбору батьківських форм при селекції пшениці на стійкість до кліматичних змін. Суть корисної моделі (способу) пояснюється описом його проведення для визначення рівня епігенетичного поліморфізму сорту. Спосіб обіймає шість послідовних етапів: 1. Відбирають, зволожують і поміщають у термостат при температурі +21-+23° С насіння сортів, що досліджується. 2. Відбирають граничні за часом проростання субпопуляції насіння, тобто субпопуляції, що проростає найшвидше і тієї, що проростає останньою. Для різних сортів пшениці час проростання "швидкої" субпопуляції становить 12-16 годин з початку набубнявіння; 1 UA 115484 U 5 10 15 20 3. Виділяють ДНК із кожної субпопуляції проростків пшениці віку 10-12 діб, в залежності від сорту. Виділяють ДНК як за допомогою сучасних кітів (наборів реагентів для виділення ДНК), так і класичними методами (СТАБ - методу, наприклад). Оцінюють концентрації, чистоту та нативності ДНК загально прийнятими методами; 4. Проводять рестрикційний аналіз з найпоширенішими рестриктазами, наприклад Mspl (5'C…C*CGC…5'), Mbol (5'…C*CGC…3'), Hpall (3'G…GC*C…5') з подальшою ISSR-ITS-RABD ПЛР. Проводять рестрикцію ДНК з подальшою ампліфікацією на ДНК-ампліфікаторі будь-якого покоління та зразка. 5. Проводять горизонтальний електрофорез ПЛР - продуктів рестрикційного аналізу в 1 %1,7 % агарозному гелі з ТБЕ-буфером за присутності бромистого етидію; гель візуалізують на UV-трансілюмінаторі та фотографують; 6. Проводять кількісну оцінку різниці, "відстані" спектрів (набору) ампліконів на електрофореграмах, що належать рослинам "швидкої" і "повільної" субпопуляції, яка визначається як епігенетична відстань (EB=D) або молекулярно-генетичний маркер екологічної пластичності. Проводять розрахунок за допомогою модифікованого підходу Неї (Nei, 1974), що виходить з таких міркувань: Якщо X і Y є двома незалежними наборами ампліконів продуктів рестрикції, тоді xi та yi є частотами окремих смуг в цих двох наборах. Ймовірність ідентичності двох вибраних смуг j x   x i2 для набору X; j Y   y i2 для набору Y. Ймовірність ідентичності смуги з набору X із смугою з Y- j XY   x i y i . Таким чином, нормована ідентичність смуг між X та Y є: I J XJ , JX JY 25 30 35 40 45 50 55 Епігенетичну відстань між X та Y оцінюють як: D   lnI D=0 у випадку абсолютного співпадіння частот смуг в наборах ампліконів, a D=1 за умови повного розходження набору смуг (маси ампліконів) по всіх електрофореграмах, що відносяться до "швидкої" і "повільної" субпопуляцій проростків. Якщо "відстань" - D0,1 сорт належить до групи з високим епігенетичним поліморфізмом і може бути рекомендовано як батьківський при селекції злаків на стійкість до кліматичних змін. Технічним результатом впровадження методу є відбір батьківських сортів за здатністю формувати у популяції їх нащадків розмаїття стратегій захисту і адаптації, що необхідно за нестійких погодних умов при змінах клімату. Найближчим аналогом заявленої корисної моделі є метод генетичних маркерів. Методи різняться підходами до виявлення корисних ознак батьківських сортів. Підхід до відбору батьківських сортів з використанням методу генетичних маркерів базується на виявленні у батьківської форми одного чи декількох цільових генів і контролі передачі їх нащадкам без врахування кліматичних змін і епігенетичних механізмів формування адаптації до нестійких погодних умов. Метод, що пропонується, оцінює можливості сорту забезпечувати епігенетичними механізмами розмаїття стратегій захисту і адаптацію при формуванні врожаю за умов змін клімату. У зв'язку із різними підходами до виявлення корисних ознак батьківських сортів способи різняться методично. Відмінність методу, що пропонується, від методу генетичних маркерів полягає у врахуванні гетерогенності довільної вибірки насіння і одночасному виділенні і аналізі ДНК із двох граничних за швидкістю проростання субпопуляцій. Далі, для виявлення поліморфізму у епігенетичному контролі проводиться рестрикція ДНК з ISSR-ITS-RAPD - ПЛР. При цьому використовують найбільш доступні рестриктази і неспецифічні праймери із невеликою кількістю кроків. Метод генетичних маркерів не враховує епігенетичний контроль за проявом ознак і поліморфізм у метилуванні ДНК и використовує лише специфічні, підібрані до певних генів праймери. Переваги способу полягають у оцінці адаптивного потенціалу сорту до нестійких погодних умов, в той час як метод генетичних маркерів фокусується на передачі генів стійкості до певного фактору середовища без врахуванні змін клімату. Результатом використання методу є відбір батьківських сортів із високим неспецифічним адаптивним потенціалом і стійкістю до змін погодних умов. 2 UA 115484 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Умовні позначення ПЛР = полімеразна ланцюгова реакція (simple sequence repeats) прості інвертовані повторювані послідовності ISSR = (мікросателіти) RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA, випадково ампліфікована поліморфна ДНК ITS Internal Transcribed Spacer, внутрішній спейсер, що транскрибується Джерела інформації: Breseghello F, Coelho AS. Traditional and modern plant breeding methods with examples in rice (Oryza sativa L.) // J Agric Food Chem. 2013 Sep 4; 61(35): 8277-86. doi:.1021/jf305531j. Breseghello F, Sorrells ME. Association mapping of kernel size and milling quality in wheat (Triticum aestivum L.) cultivars // Genetics. 2006 Feb; 172(2): 1165-77. Epub 2005 Aug 3. Casa et al. Quantitative Trait Locus (QTL) analysis // Nature Education 1(1) 2000 p. 1-13. Clark, D. J. Nucleosome positioning, nucleosome spacing and the nucleosome code // J Biomol. Struc. Dyn. 2010, 27, 781-793. PMID: 20232933. Damerval C. et al. Quantitative trait loci underlying gene product variation: A novel perspective for analyzing regulation of genome expression // Genetics.-1994. - Vol. 137.-P. 289-301. Coleman M.A. Low dose irradiation alters the transcript profiles of human lymphoblastoid cells including genes associated with cytogenetic radioadaptive response / M. A. Coleman, E. Yin, L. E. Peterson [et al.] // Radiat. Res.-2005. - Vol. 164, № 41.-P. 369-382. Cortijo S et al. Mapping the epigenetic basis of complex traits // Science. 2014 Mar 7; 343(6175): 1145-8. doi: 10.1126/science. 1248127. Flores K.B., Wohchin F., Amdam G.V. The role of methylation of DNA in environmental adaptation // Integrative and Comparative Biology-2013. - P. 1-14. Graznak Yu JK S et al QTL mapping of agronomic traits in tef [Eragrostis tef (Zucc) Trotter].// BMC Plant Biol. 2007 Jun 12;7:30. Kravets, О.Р. et al. Correlation between ecological plasticity of elite winter wheat varieties and DNA methylation pattern polymorphism within variety // Sci. innov. 2016, 12(2): 50-59. Sokolova D.A., Vengzhen G.S., Kravets A.P. An analysis of the correlation between the changes in satellite DNA methylation patterns and plant cell responses to the stress // CellBio.-2013.-Vol. 2.-P. 163-71. Sokolova D., Vengzhen G., Kravets A. The effect of DNA methylation modification polymorphism of corn seeds on their germination rate, seedling resistance and adaptive capacity under UV-C exposure // American Journal of Plant Biology.-2014.- Voд.1, - N1.-P. 1-14. Teif V.B. Nucleosome positioning: resources and tools online // Briefings in bioinformatics.-2015. DOI:10.1093/bib/bbv086. - PMID 26411474. Wang J. X. et al. Application of identifi ed QTL-marker associations in rice quality improvement through a design-breeding approach // Theor. Appl. Genet. 2007., 115:87-100. doi:10.1007/ s00122007-0545-x. Wang J. X. et al. QTL mapping of grain length in rice (Oryza sativa L.) using chromosome segment substitution lines // Genet. Res. Camb. 2006. 88:93-104. doi: 10.1017/S0016672306008408. Zhang et al. Epigenetic variation creates potential for evolution of plant phenotypic plasticity II New Phytologist-2013. - Vol. 197. - P. 314-322. Соколова Д.А., Венгжен Г.С, Кравец А.П. Влияние эпигенетичного полиморфизма семян кукурузы на скорость их прорастания и устойчивость проростків к УФ-С облучению // Цитология и генетика.-2014. - Т. 48, № 4. - С. 31-38. Тейф В. Б. и др. Нуклеосомы в генной регуляции: теоретические подходы // Молек. биол., 2011, Т. 45, № 6, С. 1-11. 3 UA 115484 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб відбору батьківських форм із використанням епігенетичного маркера екологічної пластичності при селекції пшениці на стійкість до кліматичних змін, який включає: виділення і аналіз ДНК із двох граничних за швидкістю проростання субпопуляцій проростків злаків, проведення оцінки профілів метилування шляхом рестрикційного аналізу ДНК обох груп проростків з найбільш доступними рестриктазами та ISSR-ITS-RAPD-ПЛР з неспецифічні праймерами із невеликою кількістю кроків, співставлення наборів електрофореграм (для різних рестриктаз і праймерів) для обох субпопуляцій проростків, розрахунок різниці, "відстані" між наборами електрофореграм за методом Неї, що характеризує епігенетичний поліморфізм сирі) і названого епігенетичним маркером, значення якого корелює із здатністю сорту пристосовуватись до змін клімату. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4