Спосіб оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології

Реферат: Винахід належить до способу оцінки активності патологічного процесу порожнини рота, який включає визначення рівня синтази оксиду азоту в біологічних зразках, де у пацієнтів з атопічною патологією активність синтази оксиду азоту (NO-синтази) визначають в м'яких тканинах ротової порожнини за допомогою імуногістохімічного дослідження шляхом постановки непрямої імунопероксидазної реакції з моноклональними антитілами до ендотеліальної (eNOs) та індуцибельної (iNOs) фракцій NO-синтази з візуалізацією реакції за допомогою набору UltraVision LP Detection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen, патологічний процес діагностують при виявленні eNOs в ендотелії змінених та незмінених ділянок слизової оболонки ротової порожнини, в тому числі і з позасудинною локалізацією, а саме у власній пластинці слизової і підлягаючій м'язовій пластинці, та при найбільшій активності iNOs навколо запальних UA 116178 C2 (12) UA 116178 C2 клітин в товщині епітеліального пласта змінених ділянок, а як активний патологічний процес оцінюють при підвищенні активності iNOs фракції NO-синтази в 2 рази та більше у порівнянні з контрольними вимірами інтактних тканин. UA 116178 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до медицини, а саме до стоматології та патологічної анатомії, і може бути використаний для оцінки активності патологічного процесу порожнини рота (ПР) при атопічній патології (АП). Зростаюча поширеність бронхіальної астми, атопічного дерматиту та алергічного риніту обумовлює необхідність вирішення проблем діагностики та лікування патологічних процесів в ротовій порожнині таких хворих. Особливого значення набуває при цьому задача оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології. У сучасних концепціях патогенезу атопічних процесів ПР вирішальне значення надається порушенням в імунній системі. За даними багатьох вчених у пацієнтів з АП виявлено пригнічення клітинного імунітету [Рабинович О.Ф. Рецидивирующий афтозный стоматит: классификация, клинические формы и лечение / О.Ф. Рабинович, И.М. Рабинович // Стоматология. - 2010. - Т. 78, № 3. - С. 76-79]. Також важливу роль відводять аутоімунним процесам, які викликають тканинні пошкодження. Певне значення має і так звана перехресна імунна реакція: пригнічення фагоцитарної активності нейтрофілів і зниження продукції ІЛ-1 та ІЛ-2, які визначають тяжкість перебігу АП [Burgan S.Z. Hematologic status in patients with recurrent aphthous stomatitis in Jordan / S.Z. Burgan, F.A. Sarwair, Z.O. Amarin // Saudi Med J.-2009. - Vol. 27, № 3. - P. 381-384]. Тривалий запальний процес призводить до виснаження захисних механізмів на рівні слизової оболонки, що супроводжується зміною рівня гуморального імунітету, а також деяких факторів неспецифічного захисту порожнини рота. Пригнічення місцевого імунітету порожнини рота впливає як на виникнення АП, так і на його перебіг та виникнення рецидивів надалі. Оцінюють активність патологічного процесу ПР при АП за показниками імунного статусу і неспецифічного захисту в ротовій рідині та крові. Так, наприклад, при активності АП реєструють депресію Т-системи імунітету, що виражається в зниженні кількості та функціональної активності Т-лімфоцитів, порушенні субпопуляції Т-лімфоцитів, вираженому зменшенні кількості Т-хелперів та збільшенні Тсупресорів [Особенности иммунного реагирования при атопии у детей / О.П. Турина, Е.А. Дементьева, А.Е. Блинов и др. // Педиатр. - 2014. - Т. 5, № 4. - С. 95-103]. Зафіксовані зміни В-системи імунітету, що проявляються збільшенням кількості Влімфоцитів, підвищенням рівня сироваткового імуноглобуліну G (IgG), циркулюючих імунних комплексів, зниженням рівня імуноглобуліну М (IgM) [Шумна Е. Характеристика гормонального профілю дітей з алергічними захворюваннями / Т. Шумна // Медичні перспективи.-2013. - Т. XVIII, № 1. - С. 64-70; Медицинская реабилитация детей с атопическим дерматитом (обзор) / К.В. Котенко, М.А. Хан, Н.А. Лян и др. // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. - 2016. - Т. 93, № 5. - С. 66-70; Особенности иммунного реагирования при атопии у детей / О.П. Турина, Е.А. Дементьева, А.Е. Блинов и др. // Педиатр. - 2014. - Т. 5, № 4. - С. 95-103]. Відомо, що при рецидивуючому АП знижена концентрація лізоциму та підвищений вміст бета-лізинів у сироватці крові, зменшений вміст фракцій комплементу С3, С4 і підвищений рівень фракції С5. Зменшується вміст секреторного та сироваткового імуноглобуліну A (IgA) в ротовій рідині [Особенности иммунного реагирования при атопии у детей / О.П. Турина, Е.А. Дементьева, А.Е. Блинов и др. // Педиатр. - 2014. - Т. 5, № 4. - С. 95-103; Аравийская Е.Р. Микробном: новая эра в изучении здоровой и патологически измененной кожи / Е.Р. Аравийская, Е.В. Соколовский // Вестник дерматологии и венерологии. - 2016. - № 3. - С. 102109]. Останнього часу як маркер активності патологічного процесу в порожнині рота пропонують використовувати визначення рівня оксиду азоту, зокрема при афтозному стоматиті [Increased nitric oxide production in patients with Behcet's disease: is it a new activity marker? / C. Evereklioglu, Y. Turkoz, H. Er et al. // J Am Acad Dermatol.-2002. - Vol. 46 (1). - P. 50-54]. Даний спосіб оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його вибрано за прототип. В основу винаходу поставлено задачу створення ефективного способу оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі оцінки активності патологічного процесу порожнини рота, який включає визначення рівня синтази оксиду азоту в біологічних зразках, згідно з винаходом, у пацієнтів з атопічною патологією активність синтази оксиду азоту (NO-синтази) визначають в м'яких тканинах ротової порожнини за допомогою імуногістохімічного дослідження шляхом постановки непрямої імунопероксидазної реакції з моноклональними антитілами до ендотеліальної (eNOs) та індуцибельної (iNOs) 1 UA 116178 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 фракцій NO-синтази з візуалізацією реакції за допомогою набору UltraVision LP Detection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen, патологічний процес діагностують при виявленні eNOs в ендотелії змінених та незмінених ділянок слизової оболонки ротової порожнини, в тому числі і з позасудинною локалізацією, а саме у власній пластинці слизової і підлягаючій м'язовій пластинці, та при найбільшій активності iNOs навколо запальних клітин в товщині епітеліального пласта змінених ділянок, а як активний патологічний процес оцінюють при підвищенні активності iNOs фракції NO-синтази в 2 рази та більше у порівнянні з контрольними вимірами інтактних тканин. Технічний ефект винаходу, а саме розширення арсеналу способів оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології, обумовлений синергізмом заходів та засобів, які заявляються. Сукупність суттєвих ознак способу невідома із рівня техніки і створює зверхсумарний результат - оригінальний спосіб оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології, який дозволяє досягнути підвищення точності діагностики, якої раніше неможливо було досягти. Сукупність суттєвих ознак способу, яка є невідомою із рівня техніки, володіє суттєвими відмінностями по відношенню до такої відомих способів оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології та є неочевидною для фахівця. Відрізняє винахід те, що поєднане використання відомих в медицині заходів та засобів невідоме із рівня техніки і призводить до результату, який не витікає із очевидністю з відомих характеристик цих заходів та засобів, таким чином одержуючи значний зверхсумарний результат - створення нового способу оцінки активності патологічного процесу порожнини рота при атопічній патології. Спосіб виконують наступним чином: у пацієнтів з атопічною патологією активність синтази оксиду азоту (NO-синтази) визначають в м'яких тканинах ротової порожнини за допомогою імуногістохімічного дослідження шляхом постановки непрямої імунопероксидазної реакції з моноклональними антитілами до ендотеліальної (eNOs) та індуцибельної (iNOs) фракцій NOсинтази з візуалізацією реакції за допомогою набору UltraVision LP Detection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen, патологічний процес діагностують при виявленні eNOs в ендотелії змінених та незмінених ділянок слизової оболонки ротової порожнини, в тому числі і з позасудинною локалізацією, а саме у власній пластинці слизової і підлягаючій м'язовій пластинці та при найбільшій активності iNOs навколо запальних клітин в товщині епітеліального пласта змінених ділянок, а патологічний процес оцінюють як активний при підвищенні активності iNOs фракції NO-синтази в 2 рази та більше у порівнянні з контрольними вимірами інтактних тканин. Точність та специфічність способу доведена морфологічними дослідженнями на експериментальних тваринах (самцях-кролях). Для моделювання атопічного процесу використовували овальбумін (альбумін яєчного білка) за відомою схемою [Effect of interferon-gamma on allergic airway responses in interferon-gammadeficient mice / M. Yoshida, R. Leigh, K. Matsumoto et al. // Am J Respir Crit Care Med.-2002. - Vol. 166. - P. 451-456; A herb extract, as the remedy for allergen-induced asthma in mice / S.J. Cho, H.W. Kim, B.Y. Kim et al. // Pulm Pharmacol Ther.-2008. - Vol. 21. - P. 578-583; Antiasthmatic effects of schizandrae fructus extract in mice with asthma / H. Kim, Y.T. Ahn, Y.S. Kim et al. // Pharmacogn Mag.-2014. - Vol. 10 (Suppl 1). - S 80-S 85]. Експериментальних тварин (самці-кролі у віці 3 місяці) сенсибілізували шляхом внутрішньочеревної ін'єкції овальбуміну і гідроксиду алюмінію протягом перших 3-х днів експерименту. Через п'ять днів кролям під місцевою анестезією інтраназально закапували в два рази меншу дозу овальбуміну (8-й день) і повторювали інтраназальне введення овальбуміну на 16-й, 17-й, 20-й і 21-й день. Дози препаратів, які використовували, визначали у відповідності з масою тіла тварини. Були сформовані дві групи інтактні тварини та група тварин з модельованою атопією. Після рутинної проводки фрагменти м'яких тканин ротової порожнини забарвлювали гематоксиліном і еозином, пікрофуксином за ван Гізоном. Імуногістохімічне дослідження (ІГХ) проводили постановкою непрямої імунопероксидазної реакції з моноклональними антитілами до ендотеліальної і індуцибельної фракцій NO-синтази (eNOs і iNOs відповідно) фірми Thermo scientific. Реакцію візуалізували за допомогою набору Ultra Vision LP Detection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen (Thermo scientific). Мікропрепарати вивчали на мікроскопі "Olympus BX-41" з подальшою обробкою програмою "Olympus DP-soft version 3.2", за допомогою якої проводили визначення інтенсивності імуногістохімічних реакцій, морфометричне дослідження. Всі процедури цього дослідження виконані відповідно до Гельсінської декларації, Європейської конвенції захисту хребетних тварин від 18.03.1986 року, директиви Ради Європейського економічного співтовариства щодо захисту хребетних тварин. 2 UA 116178 C2 5 10 15 20 При вивченні гістологічних препаратів, забарвлених гематоксиліном і еозином, встановлено, що в результаті проведених маніпуляцій в слизовій оболонці ротової порожнини сформований комплекс патологічних змін. У епітелії відзначається нерівномірність товщини плоскоклітинного пласта з наявністю інтраепітеліальних лімфоцитів, еозинофілів, вогнищевих ерозивних ушкоджень, чергування ділянок атрофії, некрозу, проліферації. Між ділянками атрофії багатошаровий плоский епітелій нерівномірно потовщений за рахунок проліферації клітин зернистого, шипуватого і, в меншій мірі, базального шарів, з ознаками помірного папіломатозу. У власній пластинці слизової відмічається формування периваскулярних запальних інфільтратів, дифузний розподіл еозинофілів, набухання і розволокніння сполучнотканинної основи. Мікроциркуляторне русло нерівномірного кровонаповнення. При проведенні ІГХ імунопозитивна тканина до eNOs виявляється як в змінених, так і в незмінених ділянках слизової оболонки ротової порожнини, що абсолютно логічно пояснити наявністю судин мікроциркуляторного русла. При цьому як на поздовжніх, так і поперечних зрізах судин в обох групах тварин eNOs виявляється перш за все в ендотелії. У той же час в групі тварин з модельованою атопією імунореактивність eNOs виявляється і з позасудинною локалізацією, при цьому така картина спостерігається і у власній пластинці слизової, і підлягаючій м'язовій пластинці. При проведенні морфометричного дослідження виявляється, що рівень активності eNOs достовірно не відрізняється в судинній стінці різних груп тварин, в той час як позасудинна локалізація eNOs достовірно вище в групі тварин з модельованою атопією (табл. 1). Таблиця 1 Морфометричні показники активності різних фракцій синтази оксиду азоту Групи Інтактні тварини Тварини з модельованою атопією eNOs в стінці судин, ум. од 0,87±0,06 eNOs позасудинної локалізації, ум. од. 0,17±0,04 0,79±0,11 0,27±0,04* iNOs, ум. од 0,24±0,05 0,49±0,07* Примітка * - р