Спосіб біодозиметрії віддаленого радіаційного впливу

Спосіб біодозиметрії віддаленого радіаційного впливу шляхом аналізу хромосом лімфоцитів периферичної крові методом флуоресцентної in situ гібридизації та обчислення дози опромінення, який відрізняється тим, що додатково визначають частоту повних стабільних хромосомних обмінів, які виникли без утворення супутнього ацентричного фрагмента і зустрілися у метафазах з наявністю всього хромосомного матеріалу, здійснюють співс 3 11689 4 цій в лімфоцитах периферичної крові і співвіднебільшого значення ексцесу надспонтанної частоти сення рівня нестабільних обмінних аберацій з кригарантовано стабільних аберацій. вою "доза-ефект" з урахуванням швидкості еліміПоставлене завдання вирішується таким чинації аберантних клітин при екстраполяції оцінки ном: у відомому способі біодозиметрії віддаленого рівня хромосомних аберацій на момент закінчення радіаційного впливу шляхом дослідження хроморадіаційного впливу [Пат. №40409А UA, МПК сомних аберацій в лімфоцитах периферичної крові А61В10/00, G01N33/53. Спосіб біодозиметрії радіметодом флуоресцентної in situ гібридизації та аційного впливу / Інститут медичної радіології ім. обчислення дози опромінення додатково визнаС.П.Григорьева АМН України. - З. №20010110184; чають частоту повних стабільних хромосомних Заявл. 10.01.2001; Опубл. 16.07.2001]. Спосіб дообмінів, які виникли без утворення супутнього зволяє використати результати цитогенетичного ацентричного фрагменту і зустрілися у метафазах обстеження для ретроспективної біодозиметрії, а з наявністю всього хромосомного матеріалу, здійсаме - визначення дози опромінення за поточною снюють зіставлення значення частоти повних стачастотою нестабільних аберацій у віддалені стробільних обмінів з кривою "дозa-eфeкт" та визначаки (до 10 років) після радіаційного впливу. ють значення частоти повних стабільних обмінів за До недоліків способу слід віднести його обмеформулою: женість в діапазоні ''час-ефект", що пов'язане з ПСО=tAb+Ba+tBa+tBa(FP)+tAb(tBa(FP)/tBa)+insAba+insBab неминучим зниженням частоти аберантних лімфоде: цитів до спонтанного рівня, потребу в емпіричному ПСО - повні стабільні обміни; встановленні кількісних параметрів елімінаційного tAb+Ba - реципрокні трансзюкації. процесу для кожних певних умов опромінення, а tAb - усі неповні транслокації з перенесенням також недоцільність використання при наявності фяуорещенто-міченого фрагмента на немічену ознак розвитку віддаленої генетичної нестахромосому; більності. tBa - усі неповні транслокації з перенесенням Найближчим до способу, що заявляється, за неміченого фрагмента на мічену хромосому; технічною суттю та ефектом, який досягається, є tBa(FP) - неповні транслокації з перенесенням спосіб біодозиметрії радіаційного впливу шляхом неміченого фрагмента на візуально повну мічену дослідження хромосомних аберацій в лімфоцитах хромосому без утворення ацентричного фрагпериферичної крові методом флуоресцентної іn мента; situ гібридизації з визначенням частоти лише реinsAba - інсерції флуоресцентно-міченого фрагципрокних транслокацій в усіх клітинах, або сумамента у немічену хромосому, рної частоти реципрокних і неповних транслокацій insBab - інсерції неміченого фрагмента у мічену лише в "стабільних" клітинах без нестабільних хромосому. аберацій [прототип - The 60Co gamma ray doseПри побудові кривих ''доза-ефект" in vitro було response for chromosomal aberrations in humari встановлено, що зростання частоти аберацій з lymphocytes analysed by FISH; applicability to дозою опромінення відбувається у випадку реципbiological dosimetry / Finnon P. Moquet J.E., рокних транслокацій, неповних транслокацій tAb, Edwards A.A., Lloyd D.С. // mt J. Radial Bid. -1999. tBa(FP), tBa+ac та інсерцій, але не у випадку неповних Vol.75, №10. -P.1215-1222]. Відомий спосіб дозвотранслокацій tBa(MP) з перенесенням неміченого ляє визначати поглинуту дозу опромінення у випафрагмента на візуально укорочену мічену хромодках віддаленого за часом радіаційного впливу сому з втраченим фрагментом, і в усьому дослі(щонайменше до 11 років після опромінення в дозі дженому діапазоні доз зберігається константне 0,5-0,7Гр). співвідношення неповних транслокацій tAb:tBa зі До недоліків відомого способу варто віднести значенням 1,1:1. той факт, що при обмеженні аналізу лише реципПри дослідженні цитогенетичних показників рокними транслокаціями не враховуються інші методом флуоресцентної in situ гібридизації в осіб, види стабільних радіаційно-індукованих хромосоякі зазнали опромінення у високих чи малих дозах, мних обмінів, що істотно знижує чутливість методу було встановлено, що у віддалені строки після внаслідок малого виходу показника на одиницю променевоговпливу спостерігається істотно піддози, а при аналізі сумарної частоти реципрокних і вищена частота реципрокних транслокацій, неповнеповних транслокацій тільки в "стабільних" клітиних транслокацій tAb, tBa(FP) та інсерцій, але не існує нах некоректно враховуються всі неповні транслозначущого надспонтанного зростання неповних кації, частина яких не має езксклюзивності до ратранслокацій tBa+ac, які безперечно перетворюютьдіаційного чинника і стабільності з плином часу ся на радіаційно-неспецифічні перебудови tBa(MP) після опромінення, що істотно обмежує специфіччерез втрату супутніх ацентриків у послідовних ність і точність методу. мітозах лімфоцитпрекурсорів. В основу корисної моделі поставлене завданБуло емпірично показано, що спонтанна часня створення способу біодозиметрії віддаленого тота реципрокних і неповних транслокацій та інсерадіаційного впливу, в якому додаткове визначенрцій зростає з віком людини за квадратичним заня частоти повних стабільних хромосомних обміконом. Шляхом моделювання було встановлено, нів, які виникли без утворення супутнього ацентщо за критеріями дози опромінення, яка подвоює ричного фрагменту і зустрілися у метафазах з спонтанний рівень аберацій, і дози, яка викликає наявністю всього хромосомного матеріалу, дозвовірогідне підвищення аберацій при аналізі 1000 лить підвищити специфічність методу внаслідок геном-еквівалентів, радіаційно-індукований вихід урахування лише радіаційно-індукованих перебукомпенсує вікове накопичення спонтанного рівня дов, чутливість і точність оцінки дози за рахунок значно ефективніше у випадку повних стабільних 5 11689 6 обмінів ніж реципрокних транслокацій, особливо в Частота окремих видів аберацій, яка спостеріумовах пролонгованого опромінення. гається, конвертується у частоту повних стабільСпіввідношення tBa(FP/tBa, як показали наші доних обмінів за формулою; слідження, є незалежним коригувальним фактоПСО=tAb+Ba+tBa+tBa(FP)+tAb(tBa(FP)/tBa)+insAba+insBab ром, урахування якого забезпечує визначення де: фракції раціаційно-специфічних і водночас стабіПСО - повні стабільні обміни; льних перебудов серед неповних транслокацій tAb. tAb+Ba - реципрокні транслокації. Включення до складу ПСО інсерцій, які є радіаційtAb - усі неповні транслокації з перенесенням но-специфічними і стабільними перебудовами, флуоресценто-міченого фрагмента на немічену підвищило чутливість і точність ретроспективної хромосому; дозиметри. Використання розробленого матемаtBa - усі неповні транслокації з перенесенням тичного апарату дозволяє здійснити найбільш неміченого фрагмента на мічену хромосому; адекватну оцінку рівня стабільних хромосомних tBa(FP) - неповні транслокації з перенесенням аберацій у відпалені строки після радіаційного неміченого фрагмента на візуально повну мічену впливу. Використання усієї сукупності суттєвих хромосому без утворення ацентричного фрагменознак, які заявляються, забезпечило можливість та; здійснити точну ретроспективну біодозиметрію insAba - інсерції флуоресцентно-міченого фраградіаційного впливу в будь-які терміни після його мента у немічену хромосому, закінчення, з урахуванням природного підвищення insBab - інсерції неміченого фрагмента у мічену спонтанного рівня стабільних аберацій з віком люхромосому. дини. Далі з обчисленого значення частоти ПСО віЦей спосіб реалізують таким чином. У індивідраховують спонтанний рівень, що визначається да, який у минулому мав контакт з іонізувальною за кривою ''вік-ефект", і отриманий результат співрадіацією, визначають частоту повних стабільних відносять з дозо-ефектною кривою, побудованою хромосомних обмінів методом флуоресцентної in in vitro та модифікованою згідно з тривалістю situ. гібридизації в метафазах 50-годинної культуопромінення in vivo. ри лімфоцитів периферичної крові. Культивування Нижче наведено приклади конкретного виколімфоцитів периферичної крові проводиться за нання способу. стандартною методикою. Цільну гепаризовану Приклад 1 кров переносять до культурального флакону, доГромадянин Тр-ов С.А., 1953 р.н., І.Х №80881. дають середовище Ігла та сироватку великої рогаЛіквідатор з терміном перебування в зоні ЧАЕС тої худоби у співвідношенні 4:1, вносять фітогема05-12.1986 p. Звернувся до IMP АМНУ (м. барків) у глютинін і культивують у термостаті при 37°С січні 1997 p. Біологічна оцінка дози опромінення за протягом 50 годин. На 47 годині додають розчин результатами прямої біодозиметрії, проведеної у колхіцину у фінальній концентрації 0,1мкг на 1мл 1986 році цитогенетичним методом, становила культури. Фіксацію клітин проводять у суміші ме0,53Гр. Для верифікації дози опромінення було танолу і крижаної оцтової кислоти у співвідношенні призначено проведення повторного цитогенетич3:1. Суспензію клітин наносять на предметне скло і ного аналізу. Інтервал між опроміненням і повторпроводять на ньому флуоресцентну in situ гібридиним обстеженням становив 10 років. За результазацію обраної комбінації хромосом та центромір за тами біодозиметрії екстраполяційним методом протоколом, що надається фірмою-виробником було встановлено дозу опромінення 0,57Гр. При хромосомних зондів. хромосомному аналізі методом флуоресцентної in Аналіз препаратів проводять під флуоресценsitu гібридизації на виявлення стабільних аберацій тним мікроскопом з масляною імерсією. Розпіхромосом у даного індивіда була встановлена назнання цитогенетичних порушень проводять за ступна частота аберацій: відомими світовими критеріями з використанням tAb+Ba - 0,70 на 100 геном-еквівалентів, гібридної класичної/РАІNТ номенклатури. РеєстtAb - 0,90 на 100 геном-еквівалентів, рують реципрокні транслокації, неповні транслоtBa - 0,60 на 100 геном-еквівалентів, кації tAb з перенесенням флуоресцентно-міченого tBa(FP) - 0,15 на 100 геном-еквівалентів, фрагмента на немічену хромосому, неповні трансinsAba - 0,15 на 100 геном-еквівалентів, локації tBa(FP) з перенесенням неміченого фрагменinsBab - 0,15 на 100 геном-еквівалентів. та ва візуально повну мічену хромосому без утвоЗа способом, який заявляється, було проверення ацентричного фрагмента:, неповні дено визначення частоти ПСО, що мало вигляд; транслокації tBa+ac з перенесенням неміченого ПСО=tAb+Ba+tBa+tBa(FP)+tAb (tBa(FP)/tBa)+insAba+insBab= фрагмента на візуально укорочену мічену хромо=0,70+0,15+0,90 (0,15/0,60)+0,15+0,15=1,38 на 100 сому з утворенням ацентричного фрагмента, негеном-еквівалентів. повні транслокації tBв (мр) з перенесенням неміченоСпонтанний рівень ПСО для осіб даного віку, го фрагмента на візуально укорочену мічену визначений за емпіричною кривою "вік-ефект", хромосому з втраченим ацентричним фрагментом, дорівнював 0,63 на 100 геном-еквівалентів. Після інсерції флуоресцентно-міченого фрагмента у невідрахування контрольного рівня, надспонтанний мічену хромосому та інсерції неміченого фрагменексцес частоти ПСО у даної особи становив 0,75 та у мічену хромосому. Для кожної особи аналізуна 100 геном-еквівалентів. Виходячи з даного знають до 1500 метафаз (500 геном-еквівалентів). чення індукованого рівня повних стабільних обміВизначають частоту кожного виду хромосомних нів, середня доза опромінення, що розраховуваперебудов на 100 геном-еквівалентів. лася відповідно до методичних рекомендацій МАГАТЕ (IAEA, 2001) за лабораторною кривою 7 11689 8 "доза-ефект", модифікованою з урахуванням тридицентрики - 0, валості радіаційного впливу, дорівнювала 0,54Гр tAb+Ba - 0,25 на 100 геном-еквівалентів, тотального пролонгованого гамма-опромінення. tAb - 0,25 на 100 геном-еквівалентів, Дане значення дози добре відповідало клінічній tBa - 0,25 на 100 геном-еквівалентів, симптоматиці у пацієнта і практично збігалася з tBa(FP) - 0, результатами прямої та екстраполяційної цитогеinsAba - 0.25 на 100 геном-еквівалентів. нетичної дозиметрії за частотою нестабільних Оцінка дози опромінення за способомхромосомних аберацій (0,53-0,57Гр). аналогом з екстраполяційним визначенням перПриклад 2 винно-індукованої частоти дицентриків була неГромадянка Ал-ко А.Н., 1985р.н., амб. обст. можливою внаслідок відсутності різниці показника №1396. Мешканка м. Прип'ять, евакуйована до з контролем. Оцінка дози опромінення за спосоХарківської обл. 27.04.1986р. Звернулася до IMP бом-прототипом з визначенням частоти реципрокАМНУ (м. Харків) у лютому 2001р. Для визначення них транслокацій була неможливою внаслідок мадози опромінення було призначено проведення лого значення ексцесу показника вад спонтанним цитогенетичного аналізу. Інтервал між опроміненрівнем, який для осіб даного віку дорівнював 0,22 ням і обстеженням становив 14,83 p. При хромона 100 геном-еквівалентів. сомному аналізі методом флуоресцентної in situ За способом, що заявляється, було проведено гібридизації у даної особи була встановлена така визначення частоти ПОО, яке мало вигляд: частота аберацій: ПСО=tAb+Ba+tBa+tBa(FP)+tAb (tBa(FP)/tBa)+insAba+insBab= дицентрики - 0,14 на 100 геном-еквівалентів, =0,25+0+0,25 (0/0,25)+0,25+0=0,50 на 100 геномtAb+Ba - 0,56 на 100 геном-еквівалентів, еквівалентів. tAb - 0,28 на 100 геном-еквіваленгів, Спонтанний рівень ПСО для осіб даного віку, tBa - 0,28 на 100 геном-еквівалентів, визначений за емпіричною кривою "вік-ефект", tBa(FP) - 0,14 на 100 геном-еквіваленгів, ins - 0. дорівнював 0,22 на 100 геном-еквівалентів. Після Оцінка дози опромінення за способомвідрахування контрольного рівня, надспонтанний аналогом з екстраполяційним визначенням перексцес частоти ГЮО у даної особи становив 0,28 винно-індукованої частоти дицентриків була нена 100 геном-еквівалентів. Виходячи з даного знаможливою внаслідок елімінації показника до субчення індукованого рівня повних стабільних обміконтрольного значення і перевищення критичного нів, середня доза опромінення, що розраховуватерміну 10 років інтервалом часу між опроміненлася відповідно до методичних рекомендацій ням та обстеженням. МАГАТЕ (IAEA, 2001) за лабораторною кривою За способом, що заявляється, було проведено "доза-ефект", модифікованою з урахуванням тривизначення частоти ПСО, що мало вигляд: валості радіаційного впливу, дорівнювала 0,20Гр ПСО=tAb+Ba+tBa+tBa(FP)+tAb (tBa(FP)/tBa)+insAba+insBab= тотального хронічного опромінення. Дане значен=0,56+0,14+0,28 (0,14/0,28)+0+0=0,84 на 100 геня дози добре відповідало клінічній симптоматиці, ном-еквівалентів. у пацієнтки і результатам оцінки сумарної поглинуСпонтанний рівень ПСО для осіб даного віку, тої дози зовнішнього та внутрішнього опромінення, визначений за емпіричною кривою "вік-ефект", отриманої шляхом математичного моделювання, дорівнював 0,18 на 100 геном-еквівалентів. Після виходячи з рівня радіоактивного забруднення давідрахування контрольного рівня, надспонтанний ної місцевості (0,10-0,15Гр). ексцес частоти ПСО у даної особи становив 0,38 Щоб довести переваги способу біодозиметрії на 100 геном-еквівалентів. Одходячи з даного знавіддаленого радіаційного впливу, який заявляєтьчення індукованого рівня повних стабільних обміся, були проаналізовані результати обстеження нів, середня доза опромінення, що розраховуватрьох груп осіб чорнобильського контингенту - 16 лася відповідно до методичних рекомендацій учасників ліквідації аварії на ЧАЕС, 18 евакуйоваМАГАТЕ (IAEA, 2001) за лабораторною кривою них мешканців 30-км зони ЧАЕС і 21 мешканець "доза-ефект", модифікованою з урахуванням трирадіоактивне забруднених територій (РЗТ), які валості радіаційного впливу, дорівнювала 0,22Гр були обстежені методом флуоресцентної in situ тотального пролонгованого гамма-опромінення. гібридизації у віддалені строки після аварії ЧАЕС. Дане значення дози добре відповідало клінічній В усіх трьох групах було проведено біодозиметрію симптоматиці у пацієнтки і результатам прямої відповідно до аналогу (екстраполяційне визначенцитогенетичної дозиметрії, проведеної у 1986p. ня первинно-індукованого рівня дицентриків), про(0,3Гр) за частотою нестабільних хромосомних тотипу (за частотою реципрокних транслокацій) та аберацій у мешканців м. Прип'ять з аналогічним способу, що заявляється (за частотою повних статерміном евакуації (2 доби після аварії ЧАЕС). більних обмінів). Результати порівняльного аналіПриклад 3 зу наведено в Таблиці 1. Пацієнтка Q12, 1980р.н. Мешканка м КалінкоВиявилося, що за технічними характеристикавичі (Білорусь), рівень забруднення місцевості ми спосіб, який заявляється, перевершує найблирадіонуклідами 137Сs 43,7кБк/м2. Обстежена аножчий аналог за критерієм більшого виходу показнімно в межах наукової тематики у травні 2000p. ника на одиницю дози та за критерієм нижчої межі Тривалість проживання в умовах підвищеного радетекції дози. Цій спосіб перевершує водночас діаційного фону до моменту цитогенегичного обаналог і найближчий аналог за рахунок меншої стеження становила 14 p. При хромосомному анапрацеємкості та розширеного часового діапазону лізі методом флуоресцентної in situ гібридизації у ефективного застосування. Спосіб не поступаєтьданої особи була встановлена така частота абеся найближчому аналогу та аналогу в аспекті морацій: 9 11689 10 жливості використання при поєднаному хемопроДля додаткового порівняння чутливості біодоменевому впливі. зиметрії віддаленого радіаційного впливу за найПри практичному тестуванні в групах осіб чорближчим аналогом (реципрокні транслокації) та нобильського контингенту було встановлено, що способом, що заявляється (повні стабільні обміспосіб, який -заявляється, може бути використани), було проведено обчислення доз пролонгований в усіх трьох групах, на відміну від аналога, ного -опромінення, які б викликали дворазове який не міг застосовуватися внаслідок перевипідвищення зазначених показників відносно спонщення граничного терміну обстеження) і найближтанного рівня, та дози пролонгованого jчого аналогу в групі мешканців РЗТ (внаслідок опромінення, що викликає вірогідне підвищення слабкої відмінності від контролю). Оцінки середніх аберацій при аналізі 1000 геном-еквівалентів, з доз опромінення в групах осіб чорнобильського урахуванням накопичення спонтанного рівня абеконтингенту, отримані за способом, що заявляєтьрацій з віком людини. Результати представлені в ся, виявилися значно ближчими до результатів Таблиці 2. прямої біодозиметрії, ніж оцінки доз за прототипом. Таблиця 1 Характеристика способів біодозиметрії радіаційного впливу Показники Вид хромосомних пошкоджень Вихід на одиницю дози (10-2·Гр-1) Потенційна чутливість (нижня межа детекції дози для віку 40р.), Гр Працеємність (числю клітин, необхідне для вірогідної детекції нижньої межі дози) Часовий діапазон ефективного застосування Застосування при поєднаному хемопроменевому впливі Перевищення контролю, частота на 100 клітин Ліквідатори Евакуйовані Мешканці РЗТ Застосування для біодозиметрії в чорнобильських групах: - ліквідатори -евакуйовані - мешканці РЗТ Оцінка дози відносно прямої біодозиметрії: -ліквідатори -евакуйовані -мешканці РЗТ Спосіб біодозиметрії віддаленого радіаційного впливу аналог прототип що заявляється дицентрики і реципрокні повні стабільні кільця транслокації обміни 2,984 0449 1,401 0,030 0,210 0.190 12904 10р. можливе 2105 >10р. можливе 0,21 0,17 0,0 0,25 0.30 0,02 0,54 0,43 0,21 неможливе неможливе неможливе можливе можливе неможливе можливе можливе можливе не діє не діє не діє 22% 86% не діє 15% 20% 12% Таблиця 2 Підвищення чутливості біодозиметрії віддаленого радіаційного впливу за способом, що заявляється (повні стабільні обміни), відносно найближчий аналог (реципрокні транслокації) в залежності вад віку людини Вік, роки Теоретична чутливість: доза пролонгованого -випромінення, яка подвоює спонтанний рівень показника, Гр прототип 20 30 40 50 60 що заявляється 0,49 0,62 0,82 1,07 1,37 0,16 0,25 0,38 0.56 0,77 підвищення чутливості, % 67 60 54 48 44 Практична чутливість: доза пролонгованого -випромінення, яка статистично детектується при аналізі 1000 геном-еквівалентів, Гр підвищення чутпрототип що заявляється ливості, % 1,50 0,50 67 1,70 0,60 65 1,80 0,65 64 2,00 0.78 61 2,20 0,88 60 11 11689 Дані порівняльного аналізу, наведені в таблицях 112, свідчать про те, що використання способу біодозиметрії віддаленого радіаційного впливу, який заявляється, забезпечує: - найбільш адекватну оцінку рівня радіаційноіндукованих стабільних хромосомних аберацій у віддалені строки після радіаційного впливу; - можливість проведення біодозиметрії у строки понад 10 років після опромінення та в умовах поєднаного хемопроменевого впливу; Комп’ютерна верстка Н. Лисенко 12 - підвищення специфічності детекції саме променевого впливу внаслідок урахування лише радіаційно-індукованих перебудов; - збільшення точності оцінки дози за рахунок аналізу гарантовано стабільних аберацій; - збільшення чутливості детекції радіаційного впливу внаслідок визначення більшого значення ексцесу над контролем на фоні зростання спонтанної частоти стабільних аберацій з віком людини. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601