Спосіб визначення активності холінестерази крові

Реферат: Спосіб визначення активності холінестерази крові полягає у фотометричному вимірюванні швидкості ензимного гідролізу субстрата ацетилхоліну за його залишком у середовищі буферу з використанням індикатора на ацетильну групу. Як індикатор на ацетильну групу використовують 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, реакцію ензимного гідролізу та визначення субстрату проводять при рН 8,3, а швидкість ензимного гідролізу ацетилхоліну вимірюють через 10 хв. UA 117829 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ АКТИВНОСТІ ХОЛІНЕСТЕРАЗИ КРОВІ UA 117829 U UA 117829 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медичної біохімії, а саме до методів дослідження біохімічних процесів, зокрема до способів визначення активності холінестерази крові (ChE) і може знайти застосування у клініко-біохімічних лабораторіях для діагностики живих організмів ссавців, вражених речовинами антихолінестеразної дії, а також для діагностики та з'ясування ступеня тяжкості хворого гепатитом, цирозом, або саркомою з метастазами у печінці. У теперішній час опрацьовано безліч різноманітних способів визначення активності сироваткової ChE, частина котрих знайшла практичне застосування у клінічній лабораторній практиці. Найпоширенішими є спектрофотометричні та фотоколориметричні методики, котрі у свою чергу підрозділяються на прямі, в яких як субстрат біохімічної реакції використовується бензоїлхолін або його похідне, та посередні (непрямі), в котрих переважно використовується як субстрат власне ацетилхолін. Прямий УФ-метод Kalow [1], а також його модифікації [2] полягають у безпосередньому вимірюванні витрати субстрату бензоїлхоліну (або його похідних), завдяки різниці у спектрах світлопоглинання субстрату та продуктів його ензимного гідролізу. Активність ChE визначають шляхом реєстрації зменшення світлопоглинання реакційної суміші за довжини хвилі, що відповідає максимуму поглинання субстрату ензимної реакції в УФ ділянці спектра при 235-240 нм. Однак цей метод характеризується вузьким концентраційним інтервалом лінійності, що обумовлено впливом компонентів плазми чи сироватки. Інші проблеми пов'язані з так званим субстратним гальмуванням, а також з помітною швидкістю реакції неензимного гідролізу субстрату за умов оптимального значення величини рН середовища для ензимної реакції. Цей метод найбільш придатний для оцінювання активності бутирилхолінестерази у плазмі крові. Відома низка інших способів визначення активності холіноестераз у крові за непрореагованою частиною ацетилхоліну у ензимній реакції. До таких ранніх фотометричних методів визначення активності ацетилхолінестерази крові належить гідроксаматний метод (метод Хестрина) [3]. В основу методу покладена здатність гідроксил аміну взаємодіяти в лужному середовищі з ацетилхоліном після осадження білку за допомогою трихлорацетатної кислоти. В результаті реакції утворюється гідроксамова кислота, яка в кислому середовищі дає з ферум (III) хлоридом розчинний жовто-коричневий комплекс. Інтенсивність його забарвлення пропорційна концентрації ACh. Активність ензиму визначають за різницею між кількістю ACh взятого для інкубування (контрольний ACh) та ACh непрогідролізованим за час інкубування. Вимірювання оптичної густини розчину здійснюють на фотоелектроколориметрі з зеленим світлофільтром проти води (540 нм; товщина кювети 5 мм). Переваги методу Хестрина при визначенні активності ChE полягають у можливості дослідження кінетики ензимної реакції за різних умов, метод достатньо чутливий і дозволяє працювати у широкому інтервалі концентрацій субстрату, є зручним для визначення активності холінестераз різного походження за стандартних умов (певні концентрації ензиму та субстрату, стандартний час реакції за умов дотримання нульового порядку). Але сьогодні в клінічній практиці він практично не застосовується внаслідок невисокої точності, адже отримання задовільних результатів можливе лише при зміні концентрації ацетилхоліну не менше, як на 25 %, тому не дозволяє досліджувати початкову ділянку кінетичної кривої. Метод має низьку репродуктивність (відтворюваність), трудомісткий, не має неможливості використання інших субстратів, крім висококоштовного ацетилхолину [4]. Найближчим до заявленого способу є спосіб оцінювання активності холінестераз за залишком ацетилхоліну в ензимній реакції за допомогою системи двох спряжених реакцій: пергідролізу ацетилхоліну (реакція з надлишком гідроген пероксиду) та індукованої нею реакції пероксикислотного окиснення індикаторної речовини о-діанізидину утвореною надацетатною кислотою в середовищі фосфатного буферу при рН 7,2 [5]. Активність ензиму оцінюють за концентрацією непрогідролізованого за час інкубування з ензимом ACh, яку визначають за наперед побудованою градуювальною залежністю світлопоглинання продукту окиснення індикаторної реакції від концентрації взятого ацетилхоліну після інкубування його за відсутності ензиму (контрольний ACh 0,04-0,4 мг). Вимірювання оптичної густини розчину здійснюють на фотоелектроколориметрі через 4 хв. після додавання до суміші 1 мл стандартного водноацетонового (1:1) розчину ацетилхоліну, 3 мл 0,1 % в ацетоні розчину о-діанізидину та 1 мл 3 % гідроген пероксиду 1 мл 0,05 моль/л тризаміщеного натрій фосфату. Недоліком способу можна вважати використання як індикаторна о-діанізидину, який володіє канцерогенними властивостями, а тому робота з ним створює шкідливі умови праці і порушує принцип "Зеленої хімії". Задача корисної моделі полягає в створенні способу визначення активності холінестерази крові, який би дозволив забезпечити необхідну точність та відтворюваність результатів аналізу, а також створити безпечні умови праці при виконанні аналізу. 1 UA 117829 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі визначення активності холінестерази крові, що полягає у фотометричному вимірюванні швидкості ензимного гідролізу субстрату ацетилхоліну за його залишком у середовищі буферу з використанням індикатора на ацетильну групу, корисною моделлю передбачено, що як індикатор на ацетильну групу використовують 3,3',5,5-тетраметилбензидин, реакцію ензимного гідролізу та визначення субстрату проводять при рН 8,3, а швидкість ензимного гідролізу ацетилхоліну вимірюють через 10 хв. Всі параметри заявленого способу визначені дослідним шляхом. 3,3',5,5-Тетраметилбензидин не токсичний та водночас більш стійкіший в розчинах при зберіганні в присутності кисню повітря, ніж о-діанізидин. у якості індикатора дозволяє забезпечити безпечні умови праці та отримувати більш точні достовірні результати. рН середовища становить 8,3 і є оптимальним для реакції гідролізу ацетилхоліну в присутності ензиму холінестерази, адже досягається найбільша швидкість окиснення індикаторної речовини. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Виготовлення розчинів: Використовували 3,3',5,5'-тетраметилбензидин дигідрохлорид моногідрат (ТМБ), 98,5 % (SIGMA). Робочий 0,02 моль/л розчин виготовляли шляхом розчинення точної наважки об'ємно-ваговим методом у 40 % (об./об.) суміші етанолу з двічі дистильованою водою при нагріванні до +45 °C, який зберігали у щільно закоркованому флаконі з темного скла у прохолодному місці. Етанол 96 % фармакопейної чистоти. Розчин ацетилхоліну хлориду вихідної концентрації 5,4·10-3 моль/л виготовляли шляхом розчинення 40,0 мг ацетилхоліну хлориду у 40,0 мл двічі дистильованою водою. Як стандарт використовували очищений препарат ензиму холінестерази сироватки коня К.Ф. 3.1.1.8 (VI клас) з питомою активністю 28 АО/мг (за сертифікатом). Розчину робочого стандартного зразка (РСЗ): точну наважку порошку холінестерази (80 мг) розчиняли у 20,0 мл двічі дистильованої води при слабкому нагріванні на водяному огрівнику. Розчин випробуваного зразка холінестерази виготовляли аналогічно. Термін придатності розчинів 1 доба. 10 % розчин гідроген пероксиду виготовляли з 50 % розчину о.с.ч. шляхом відповідного розбавлення двічі дистильованою водою. Концентрацію робочого розчину гідроген пероксиду контролювали перманганатометрично. Для виготовлення буферного розчину з рН 8,3 у мірній колбі на 1 л 28,2 г натрій фосфату двозаміщеного розчиняли у 900 мл двічі дистильованої води і додавали 20 мл 0,2 моль/л наперед виготовлено з фіксаналу стандарт-титру розчину хлоридної кислоти і об'єм доводили до 1000 мл. Світлопоглинання вимірювали на КФК-3 (світлофільтр № 3, l=3 см). Швидкість реакцій характеризували значенням величини оптичної густини розчину за 10 хв. (методом фіксованого часу). Вимірювання здійснювали при +37 °C, температуру реакційної суміші забезпечували водяним термостатуванням, рН розчинів контролювали за допомогою скляного електроду. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. Фотометричне визначення активності холiнестерази крові. 80,0 мг випробованого препарату холінестерази розчиняли у 20,00 мл двічі дистильованої води. У пробірку з притертим корком на 15 мл послідовно вносили 5 мл 0,2 моль/л фосфатного буферного розчину з рН 8,3 і термостатували пробірку у компараторі 5 хв., потім додавали 0,50 мл випробуваного водного розчину холінестерази, ретельно збовтують і за допомогою піпетки вносили 1,00 мл розчину ацетилхоліну. Одразу отриману суміш інтенсивно перемішували шляхом перевертання пробірки 5-7 разів та вмикали хронометр (секундомір) та термостатували при +37-38 °C 10 хв. Потім до одержаної суміші на 10 хвилині додавали 5,00 мл 10 % розчину гідроген пероксиду і знову термостатували при +37 °C ще 10 хв. Далі на 20 хвилині додавали 3 мл 96 % етанолу і одразу 0,50 мл розчину ТМБ розшифрувати і перемішували. Термостатували за температури +37-38 °C далі ще 10 хв. На 30-й хвилині вмістиме пробірки переносили у кювету фотометра фотоелектричного КФК-3 на 3 см та вимірювали оптичну густину реакційної суміші А при λеф.=400 нм (світлофільтр № 3). Дослід повторювали ще чотири рази. За усередненим п'ятьма значенням величини оптичної густини за допомогою рівняння градуювального графіка знаходили питому активність випробуваного зразка ензиму (U), у міжнародних одиницях (АО) - кмоль/хв до 1 мг субстанції. За усередненим з п'яти визначень значенням оптичної густини випробуваного розчину за допомогою градуювального графіка знаходили питому активність ензиму (U). Вона становила 27,9 АО/мг. RSD=1,8 %. Правильність - 0,5 %. Побудова градуювального графіка. У кожну з 5 пробірок з притертим корком на 15 мл вносили 5 мл 0,2 моль/л фосфатного буферного розчину з рН 8,3 і термостатували у 2 UA 117829 U 5 10 15 20 25 30 35 40 компараторі 5 хв., потім додавали 0,50 мл водного стандартного розчину холінестерази з концентрацією 4 мг/мл (пробірка № 1), 3 мг/мл (пробірка № 2), 2 мг/мл (пробірка № 3), 1 мг/мл (пробірка № 4) та 0,5 мг/мл (пробірка № 5), ретельно збовтували і за допомогою піпетки вносили 1,00 мл розчину ацетилхоліну. Відразу отриману суміш інтенсивно перемішували шляхом перевертання пробірки 5-7 разів та вмикали хронометр (секундомір) та термостатували при +37-38 °C 10 хв. Потім до одержаної суміші на 10 хвилині додавали 5,00 мл 10 % розчину гідроген пероксиду і знову термостатували при +37 °C ще 10 хв. Далі на 20 хвилині додавали 3 мл 96 % етанолу і одразу 0,50 мл розчину ТМБ і перемішували. Термостатували за температури +37-38 °C далі ще 10 хв. На 30-й хвилині (через 10 хв. термостатування) вмістиме пробірки переносили у кювету фотометра фотоелектричного КФК-3 на 3 см та вимірювали оптичну густину реакційної суміші А при λеф.=400 нм (світлофільтр № 3). Дослід повторювали тричі з кожним розчином певної концентрації ензиму. За отриманими усередненими даними будували градуювальну залежність оптичної густини розчину від питомої активності, у міжнародних одиницях (АО/мг) - кмоль/хв до 1 мг субстанції. На фігурі 1 наведене рівняння градуювального графіка залежності оптичної густини від активності ензиму. Лінійна залежність оптичної густини від питомої активності ензиму (U) спостерігається в інтервалі 28-3,5 АО/мг. Метрологічні характеристики заявленого способу: RSD=1,8 %. Правильність - 0,5 %. Таким чином, заявлено новий спосіб визначення активності холінестерази крові характеризується високою чутливістю, достовірністю і відтворюваністю результатів, а також дозволяє створити безпечні умови праці при виконанні аналізу. Джерела інформації: 1. Kalow W., Lindsay H.A. A comparison of optical and manometric methods for the assay of human serum cholinesterase //Can J. Biochem Physio. - 1955; 33:568-574. 2. Kalow W., Genest K. A method for the detection of atypical forms of human serum cholinesterase; determination of dibucaine number //Canad. J. Biochem. Physiol. - 1957. - V. 3, № 6. P. 339-346. 3. Hestrin S. The reaction of cetylcholine and other carboxylic acid derivates with hydroxylamine, and its alytical applications // J. Biol Chem. - 1949. - V. 180. - P. 249-261. 4. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа. - М: Наука, 1965. - С. 144. 5. Hanker J.S., Gelberg A., Witten B. Colorimetric Estimation of Some Cholinergic Esters: Application to the Demonstration of Acetylcholinesterase Activity //J. Am. Pharm. Assoc. (Scientific ed.). - 1958. - Vol. 47, № 10. - P. 728-730. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення активності холінестерази крові, що полягає у фотометричному вимірюванні швидкості ензимного гідролізу субстрата ацетилхоліну за його залишком у середовищі буферу з використанням індикатора на ацетильну групу, який відрізняється тим, що як індикатор на ацетильну групу використовують 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, реакцію ензимного гідролізу та визначення субстрату проводять при рН 8,3, а швидкість ензимного гідролізу ацетилхоліну вимірюють через 10 хв. 3 UA 117829 U Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4