Штам bacillus amiloliquefaciens imb b-7571 з альгіцидною активністю

Реферат: Штам Bacillus amiloliquefaciens IMB В-7571 з альгіцидною активністю щодо мікроскопічних водоростей. UA 117885 U (12) UA 117885 U UA 117885 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології та біотехнології, а саме до нового штаму на основі бактерій роду Bacillus, що характеризується альгіцидною активністю по відношенню до мікроскопічних водоростей. Зокрема, заявлений штам Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 може використовуватися для одержання біопрепаратів, які є направленими на знешкодження росту мікроскопічних водоростей у водоймах, басейнах. Цвітіння води стало серйозною проблемою у всьому світі. Мікроскопічні водорості наносять значну шкоду будь-яким водним джерелам, як природним, так технологічним і штучним. Це явище часто призводить до масової загибелі риб, морських ссавців, молюсків і ін. через виснаження кисню та токсини, які продукують водорості. Використання різних фізичних та хімічних альгіцидів для обробки водойм обмежено за санітарно-гігієнічними нормами у зв'язку з небезпекою для людини і тварин, а також несприятливо позначається на життєдіяльності інших мешканців водойм (гідробіонтів). Як альтернатива хімічним і фізичним засобам контролю росту водоростей все частіше розглядаються бактерії та їх метаболіти, що мають антагоністичний (альгіцидний) ефект на водорості. Насьогодні виділений ряд мікроорганізмів, які характеризуються альгіцидним ефектом: Flavobacterium, Cytophaga, Sphingomonas, Bacillus, Achromobacter, Pseudomonas, Alteromonas. Описаний штам бактерій Brevibacillus laterosporus, який пригнічує ріст мікроскопічних водоростей (RU2323968, опубл. 02.11.2006). Як зазначено в описі, штам був виділений шляхом багатоступеневої селекції із природного штаму Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-8287 та задепонований у Всеросійській колекції промислових мікроорганізмів під номером ВКПМ В9405. Штам характеризується альгіцидною і альгістатичною активністю по відношенню до мікроскопічних водоростей Nostoc та Anabaena. Проте вказаний штам характеризується тривалим часом культивування (96 год.) та має низьку альгіцидну активність щодо мікроскопічних водоростей Microcystis. Є відомим штам Pseudomonas aeruginosa з високою альгіцидною активністю Н. Ren at al. The potential use of bacterium strain R219 for controlling of the bloom-forming cyanobacteria in freshwater lake. - World J. Microbiol. Biotechnol, 26.-2010-P. 465-472). Штам був виділений із водних ресурсів озера Тай (Китай) з подальшим вирощуванням на агаризованому середовищі LB (Luria-Bertani). Культуральну рідину вказаного штаму використовували для дослідження його альгіцидних властивостей. Штам Pseudomonas aeruginosa R219 характеризувався високою альгіцидною активністю щодо мікроскопічних водоростей Microcystis aeruginosa та був запропонований як потенційний засіб для біоконтролю росту одноклітинних водоростей. Проте основним недоліком зазначеного штаму є те, що він продукує токсичні речовини, які можуть негативно впливати на інші водорості, найпростіші, риби, які є невід'ємною частиною стійкої екосистеми. Задача даної корисної моделі полягає в одержанні нового більш ефективного та нешкідливого штаму бактерій з альгіцидною активністю для контролю росту мікроскопічних водоростей. Вказана задача вирішується за рахунок широкомасштабного дослідження значної колекції мікроорганізмів, зокрема представників виду Bacillus. В результаті був відібраний штам Bacillus amiloliquefaciens 10.1 і депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України як Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571. Вказаний штам характеризується високою альгіцидною активністю щодо мікроскопічних водоростей Anabaena hassalii, Microcystis aeruginosa, M. pulvereae та призначений для одержання препарату для біологічного контролю чисельності мікроводоростей. Заявлений штам був ізольований з ґрунту у м. Києві 2010 р. Спосіб одержання штаму: штам отримують шляхом посіву на поживні середовища: МПА, сусло-агар, картопляний агар, середовище Громико та ін. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму: грампозитивні аеробні спороутворюючі палички, які продукують каталазу. На МПА, сусло-агарі, середовищі Громико, картопляному агарі відмічено значний ріст. На МПА утворює круглі складчасті колонії з фестончатим краєм пастоподібної консистенції, бежевого матового кольору. На сусло-агарі утворює округлі складчасті колонії з рівним краєм, бежевого матового кольору, пастоподібної консистенції. На картопляному агарі - колонії світло-бежевого кольору, матові, ріст бактерій по штриху ризоїдний, пастоподібної консистенції. На середовищі Громико - колонії бежевого кольору, складчасті, з підвищеним центром, краї хвилясті, пастоподібної консистенції. 1 UA 117885 U 5 10 1520 25 30 35 40 45 50 В мазках з колоній, які виросли на МПА, через 18 годин можна побачити прямі паличковидні клітини 1,9×0,5 мкм, які розташовані поодиноко, попарно та зрідка ланцюгом. Клітина при спороутворенні не роздувається, після росту на глюкозному агарі в протоплазмі вакуолі не утворюються. На МПБ культура утворює плівку. Штам ферментує глюкозу, арабінозу, маніт, ксилозу, галактозу, сахарозу з утворенням кислоти, дає позитивну реакцію Фогес-Проскауера, гідролізує крохмаль, казеїн, желатину, росте при 7 % NaCl, утилізує цитрат, не використовує пропіонат. Каталазна та оксидазна реакції позитивні. Культура не росте в анаеробних умовах і при 10 % NaCl, не утворює газ з NO3- в анаеробних умовах, не проявляє лецитиназної активності, не утворює індол та сірководень. Відомості про патогенність: штам не патогенний для теплокровних тварин. Спосіб, умови та склад середовища для культивування штаму: штам зберігається на МПА, середовищі Громико, агаризованому середовищі Гаузе № 2 під шаром стерильного вазелінового масла. Пересів 1 раз на рік. До унікальних особливостей штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 слід віднести його здатність проявляти антагоністичну (альгіцидну) активність щодо мікроскопічних водоростей, які викликають цвітіння води. Заявлений штам відрізняється від прототипу коротким часом культивування (24 год.) та більш швидким альгіцидним ефектом - лізис ціанобактерій наступає вже через 18 год. культивування. Це свідчить про більш високу ефективність штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 щодо мікроскопічних водоростей. Дана корисна модель далі буде проілюстрована приведеними нижче прикладами конкретного здійснення. Приклад 1. Вирощування штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 Культивування штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 проводили в періодичних умовах у колбах на 750 мл при струшуванні 200 об./хв при 37 С впродовж 24 годин в рідкому LB (LuriaBertani) середовищі наступного складу (г/л): пептон 10,0 дріжджовий екстракт 5,0 NaCl 10,0 рН середовища 7,0. Як посівний матеріал використовували добову культуру вказаного штаму, вирощеного на МПА. Оптична густина мікробної суспензії становила 10 од. за стандартом мутності ДІСК ім. Л.А. Тарасевича. Приклад 2. Культивування мікроскопічних водоростей Для дослідження альгіцидних властивостей використовували штами синьо-зелених азотфіксуючих нитчастих видів ціанобактерій - Аnabaenа hassalii та штами, що не фіксують азот - Microcystis aeruginosa, M. pulvereae. Досліджені штами водоростей надані Інститутом гідробіології та екології НАН України. Штами синьо-зелених мікроводоростей культивували в скляних плоскодонних колбах ємністю 250 мл в 100 мл рідкого середовища BG-11 при кімнатній температурі 25-30 °C без аерації і освітленні день-ніч. Приклад 3. Дослідження альгіцидної активності штаму Bacillus amiloliquefaciens IMB В-7571 Культуру Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 вирощували так, як описано у Прикладі 1. Рідку культуру заявленого штаму центрифугували 15 хв. при 6000 г. Одержану культуральну рідину використовували для специфічного біотестування. Штами синьо-зелених мікроводоростей вирощували так, як описано в Прикладі 2. Альгіцидну активність досліджували при сумісному культивуванні штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 і мікроскопічних водоростей. Для кількісної оцінки альгіцидного ефекту до рідкої культури синьо-зелених водоростей додавали культуральну рідину штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 у співвідношенні 1: 1 і визначали остаточну оптичну густину (ОГ) за формулою: Альгіцидна активність (%) = ОГп - ОГт/ОГп  100, де ОГп оптична густина початкова, ОГт - оптична густина після інкубації протягом Т год. відповідно. ОГ вимірювали на спектрофотометрі при довжині хвилі 580 нм в нульовий момент і після сумісного культивування. Контролем слугувало рідке LB середовище. Альгіцидну активність заявленого штаму оцінювали по зниженню оптичної густини. Лізуюча активність вважалась високою, якщо оптична густина дорівнювала або була більша за 50 % у порівнянні з контролем. Відповідно, менше ніж 50 % - лізуючу активність вважали низькою. 55 2 UA 117885 U Таблиця 1 Альгіцидна активність штаму IMB В-7571 щодо мікроскопічних водоростей. Штами ціанобактерій Microcystis aeruginosa Microcystis pulvereae Anabaena hassalii 5 10 15 20 25 30 35 Значення ОГ % суміші ціанобактерій/бацила 70,4±3,1 75,9±2,1 65,9±2,0 Так, було продемонстровано, що штам Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 проявляє альгіцидну дію щодо мікроскопічних водоростей. Рівень лізису тест-культур ціанобактерій даним штамом бацил знаходився на рівні 65-75 % (табл. 1). Приклад 4. Візуальна оцінка альгіцидної дії штаму Bacillus amiloliquefaciens IMB В-7571 за зміною забарвлення інкубаційних сумішей Культуру Bacillus amiloliquefaciens ІMB В-7571 вирощували так, як описано у Прикладі 1. Рідку культуру заявленого штаму центрифугували 15 хв. при 6000 g. Одержану культуральну рідину використовували для специфічного біотестування. Штами синьо-зелених мікроводоростей вирощували так, як описано в Прикладі 2. Мікроскопічні водорості синтезують різні пігменти, які визначають їх колір. Ціанобактерії Microcystis'aeruginosa, Microcystis pulvereae, Anabaena hassalii мають зелене забарвлення культури. Альгіцидну дію культуральної рідини штаму Bacillus amiloliquefaciens 1MB В-7571 щодо мікроскопічних водоростей оцінювали візуально за зміною забарвлення інкубаційних сумішей планктонних форм ціанобактерій. При сумісному культивуванні мікроскопічних водоростей та культуральної рідини штаму Bacillus amiloliquefaciens ІMB В-7571 спостерігається знебарвлення інкубаційної суміші вже через 2 год. культивування, що свідчить про лізис ціанобактерій. При цьому колір суміші змінювався із зеленого до світло-жовтого. При оптичній мікроскопії виявляли лізис вегетативних клітин досліджуваних мікроводоростей. Приклад 5. Вивчення альгіцидної активності безклітинного фільтрату та біомаси штаму Bacillus amiloliquefaciens ІMB В-7571. Культуру Bacillus amiloliquefaciens ІMB В-7571 вирощували так, як описано у Прикладі 1. Рідку культуру заявленого штаму центрифугували 15 хв. при 6000 g. Одержану культуральну рідину та двічі промиту фізіологічним розчином біомасу штаму Bacillus amiloliquefaciens ІMB В7571 використовували для специфічного біотестування. Штами синьо-зелених мікроводоростей вирощували так, як описано в Прикладі 2. Для кількісної оцінки альгіцидного ефекту до рідкої культури синьо-зелених водоростей додавали: в одному випадку культуральну рідину, в другому випадку - двічі промиту фізіологічним розчином біомасу штаму Bacillus amiloliquefaciens ІMB В-7571 у співвідношенні 1: 1 і визначали остаточну оптичну густину (ОГ) так, як описано в Прикладі 3. Як видно з представлених даних, альгіцидна активність проявлялася лише в безклітинному фільтраті, а біомаса була неактивною. Таким чином, в культуральній рідині (безклітинному фільтраті), звільненій від бактеріальних клітин, присутні певні бактеріальні метаболіти, які і забезпечують альгіцидну активність штаму Bacillus amiloliquefaciens ІMB В-7571. Таблиця 2 Альгіцидна активність безклітинного фільтрату та біомаси штаму Bacillus amiloliquefaciens 10.1 Штами ціанобактерій Microcystis aeruginosa Microcystis pulvereae Anabaena hassalii 40 Значення ОГ % суміші ціанобактерій/бацила Безклітинний фільтрат Біомаса 57,2±2,4 0 53,2±2,8 0 52,2±2,6 0 Таким чином, заявлений новий штам Bacillus amiloliquefaciens ІMB B-7571 проявляє виражену альгіцидну активність щодо мікроскопічних водоростей. 3 UA 117885 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Штам Bacillus amiloliquefaciens IMB В-7571 з альгіцидною активністю щодо мікроскопічних водоростей. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4