Спосіб діагностики ступеня кальцифікації вінцевих артерій і загрози розвитку гострого коронарного синдрому у хворих з ішемічною хворобою серця

Реферат: Спосіб діагностики кальцифікації вінцевих артерій і загрози розвитку гострого коронарного синдрому (ГКС) включає визначення ступеня стенозу вінцевих артерій. Додатково проводять дослідження нативних мазків периферичної крові, які фарбують за методикою Мак-Гі-Рассела насиченим спиртовим розчином барвника алізаринового червоного S, з наступною світловою мікроскопією червоних кров'яних тілець. Оцінюють результати цитохімічного дослідження еритроцитів та підраховують в полі зору мікроскопа кількість клітин, що містять депозити солей кальцію, і залежно від кількості еритроцитів з депозитами солей кальцію роблять висновок про ступінь кальцифікації коронарних артерій, тяжкість ішемічної хвороби серця (ІХС) та загрозу розвитку ГКС (нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда без або з елевацією сегмента ST) і життєво-небезпечних ускладнень упродовж найближчого часу. UA 117963 U (12) UA 117963 U UA 117963 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, зокрема кардіології, і може бути використана для скринінгу кальцифікації вінцевих артерій і прогресування ішемічної хвороби серця (ІХС). На сьогоднішній день доведений вплив різних факторів ризику ІХС на апоптоз клітин крові, що має безпосереднє відношення до прогресування і розвитку атеросклерозу. Запрограмована клітинна смерть (апоптоз) посідає важливе місце в імунній відповіді організму при селекції, регуляції чисельності, а також елімінації відпрацьованих, пошкоджених та неспецифічно активованих клітин крові при більшості хвороб внутрішніх органів [Біохімічні механізми апоптозу: Навчальний посібник/ Л.І. Остапченко, Т.Б. Синельник, Т.В. Рибальченко, В.К. Рибальченко. - К.: Видавничо-поліграфічний центр "Київський університет", 2010. - С. 8-9]. Дезрегуляція імунологічних процесів за наявності порушеного життєвого циклу імунокомпетентних клітин крові призводить до ушкодження ендотелію судин, формування атероматозних бляшок, кальцифікації судинної стінки та агрегації форменних елементів на фоні активації системи зсідання крові. Існує чітка залежність між ступенем кальцифікації коронарних артерій, наявністю депозитів солей кальцію у формених елементах крові та активністю їх апоптозу, що дає підстави вважати кальцій універсальним маркером запрограмованої смерті клітин. Особливого значення процеси кальцифікації набувають в патогенезі розвитку атеросклерозу, при якому депозити кальцію присутні в складі атеросклеротичних бляшок та стінках артерій як на макро-, так і на мікроскопічному рівні. Класичними морфологічними ознаками апоптозу клітин є конденсація ядерного гетерохроматину і вакуолізація цитоплазми, каріопікноз та рексис ядер, ущільнення, зморщення та дегідратація цитоплазми при збереженні цілісності зовнішньої цитоплазматичної мембрани, а також фрагментація клітин з утворенням апоптичних тілець. Проте, перелічені ознаки апоптозу стосуються переважно лейкоцитів і не можуть бути виявлені при оцінці стану таких високоспеціалізованих, а тому без'ядерних, клітин крові як еритроцити. Останні ж належать до найбільшої популяції клітин периферичної крові. Вони не містять органел і не мають здатності до відновлення своєї клітинної стінки, а також міграції за межі судинного русла. За цих умов активація процесів апоптозу еритроцитів є доволі специфічною. Виконуючи високоспеціалізовану функцію по переносу кисню та вуглекислого газу в організмі та маючи досить тривалий термін життя, їх зміни за активації процесів апоптозу носять стійкий та вірогідний характер. Запрограмована загибель еритроцитів часто зумовлена впливом різних патофізіологічних механізмів, властивих для ІХС, а саме: енергодефіцитом, оксидативним стресом, порушенням вуглеводного та ліпідного обміну, що супроводжується трансформацією оксигемоглобіну в метгемоглобін і підвищенням активності внутрішньоклітинних каспаз та протеаз, екстерналізацією фосфатидилсерину, а також збільшенням кількості внутрішньоклітинного кальцію [Carbon Monoxide-Sensitive Apoptotic Death of Erythrocytes / Elisabeth Lang, Syed M. Qadri, Kashif Jilani [et al.] // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology.-2012. - № 111. - P. 348355]. За вказаних порушень гомеостазу специфічним шляхом відбувається апоптоз еритроцитів, означений як "ериптоз", відмінний від апоптозу клітин, що мають ядра [Erythrocyte: Programmed Cell Death, Anemia / Donald Silverberg, Daniela Vittori, Daiana Vota, Alcira Nesse (Ed.).-2012.Available from:http://www.intechopen.com/books/anemia/erythrocyte-programmed-cell-death]. Наведені вище біохімічні та патофізіологічні процеси ще раз підтверджують особливе значення іонів кальцію у запрограмованій загибелі клітин крові, зокрема еритроцитів, цитохімічним доказом чого є їх кальцифікація (поява депозитів кальцію). Існуючі способи індикації процесів апоптозу клітин периферичної крові найчастіше базуються на імунологічних методиках. Проте вони є або дороговартісними і не призначеними для ідентифікації апоптозу таких без'ядерних клітин, як еритроцити (набір ApoLect) [Macrophages Discriminate Glycosylation Patterns of Apoptotic Cell-derived Microparticles. / R.O. Bilyy, T. Shkandina, A. Totnin [et al.] // J. Biol. Chem.-2012. - № 287:496. - P.50], або ж потребують специфічної апаратури (проточний флуорометр-аналізатор для виявлення на поверхні еритроцитів фосфатидилсерину) чи флуоресцентних барвників (аднексин-V для виявлення + 2+ внутрішньоклітинного Са ) [Oxidative damage increases intracellular free calcium [Ca ] concentration in human erythrocytes incubated with lead / M.A. Quintanar-Escorza, M.T.GonzalezMartinez, M.P. Intriago-Ortega, J.V. Calderon-Salinas// Toxicol. in Vitro.-2010.-Vol. 24.- P. 13381346], які є малодоступними для практичної медицини. Навіть електронно-мікроскопічне дослідження не виявляє ознак ериптозу, за винятком фрагментації еритроцитів (шизоцитоз) [Martinez M.M. Detection of apoptosis: A review of convetional and novel techniques / M.M. Martinez, R.D. Reif, D. Pappas // Analytical methods.-2010. № 2. - P. 996-1004]. 1 UA 117963 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Найближчим аналогом прогнозування ризику виникнення серцево-судинних ускладнень у хворих з ІХС є відомий спосіб визначення кальцифікації вінцевих артерій і загрози розвитку гострого коронарного синдрому шляхом проведення мультиспірального комп'ютернотомографічного (МСКТ) дослідження серця з 3-D моделюванням анатомії вінцевих артерій після внутрішньовенного введення водорозчинних йодовмісних рентген-контрастних речовин та візуалізацією типу коронарного кровопостачання серця, виявленням ступеня стенозу чи оклюзії гілок вінцевих артерій, зокрема підрахунку кальцієвого індексу, який корелює з ймовірністю та ступенем загрози виникнення інфаркту міокарда та його ускладнень [Діагностика ураження коронарних артерій у хворих на ішемічну хворобу серця за допомогою мультизрізової комп'ютерної томографії/ О.С.Никоненко, А.О.Никоненко, Б.С.Гавриленко, A.I. Лозовий// Запорізький медичний журнал.-2015.- № 1(88). - С 4-8]. Проте вказаний спосіб, поряд з наявністю ряду безсумнівних переваг, має суттєві недоліки, такі, як інвазивність обстеження, можливість виникнення у пацієнтів алергічних реакцій на введення рентген-контрастних речовин та висока вартість дослідження, що пов'язано з необхідністю використання високовартісного обладнання, у зв'язку з чим на практиці МСКТ як рутинний метод обстеження не використовується. В основу корисної моделі поставлена задача пошуку ефективного, чутливого та доступного способу виявлення кальцифікації формених елементів крові, зокрема еритроцитів, як маркера їх апоптозу, з метою прогнозування перебігу ІХС та стратифікації пацієнтів у групи ризику щодо розвитку гострого коронарного синдрому (ГКС). Поставлена задача вирішується тим, що у способі діагностики кальцифікації вінцевих артерій і загрози розвитку гострого коронарного синдрому, що включає визначення ступеня стенозу вінцевих артерій, згідно з корисною моделлю, проводять дослідження нативних мазків периферичної крові, які фарбують за методикою Мак-Гі-Рассела насиченим спиртовим розчином барвника алізаринового червоного S, з наступною світловою мікроскопією червоних кров'яних тілець, оцінюють результати цитохімічного дослідження еритроцитів та підраховують в полі зору мікроскопа кількість клітин, що містять депозити солей кальцію, і залежно від кількості еритроцитів з депозитами солей кальцію роблять висновок про ступінь кальцифікації коронарних артерій, тяжкість ішемічної хвороби серця та загрозу розвитку ГКС (нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда без або з елевацією сегмента ST) і життєво-небезпечних ускладнень упродовж найближчого часу. Поставлена задача вирішується тим, що при відсутності депозитів кальцію в еритроцитах мазків периферичної крові або при виявленні поодиноких депозитів в окремих клітинах не у кожному полі зору препарату роблять висновок про прогностично сприятливий перебіг ІХС з низьким ризиком виникнення потенційно небезпечних серцево-судинних ускладнень, при виявленні депозитів кальцію у деяких клітинах кожного поля зору (до 40 % еритроцитів від загальної кількості клітин в полі зору) підтверджують про помірний ризик виникнення серцевосудинних ускладнено ІХС, при виявленні депозитів кальцію в багатьох еритроцитах (від 40 до 80 % кожного поля зору препарату) - про високий ризик виникнення ГКС в майбутньому, а при виявленні солей кальцію в усіх чи майже всіх клітинах (більше 80 % еритроцитів кожного поля зору препарату) - підтверджують про дуже високий ступінь кальцифікації вінцевих артерій і відповідний ризик розвитку ГКС. Запропонований спосіб ґрунтується на цитохімічному визначенні солей кальцію в альвеолярних макрофагах та еозинофілах, який полягає в мікроскопічному дослідженні біоматеріалів шляхом зафарбування нативного препарату насиченим спиртовим розчином барвника алізаринового червоного S за методом Мак-Гі-Рассела [Целуйко С.С. Предполагаемые механизмы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме: Метод, рекомендации / С.С. Целуйко, СВ. Зиновьев. - ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия, г. Благовещенск, 2013.-С. 17] з наступним мікроскопічним дослідженням отриманих препаратів за допомогою світлового мікроскопа. Для дослідження клітин периферичної крові, зокрема еритроцитів, цей спосіб не використовувався. Суть корисної моделі пояснюють креслення. На Фіг. 1 представлено світлову мікроскопію множинних депозитів кальцію в переважній більшості еритроцитів периферичної крові (97 % клітин в полі зору з включеннями кальцію, 3 ступінь за S.F. Nagueh, 1999. На Фіг. 2 - МСКТ того ж пацієнта: кальцифікація вінцевих артерій при ІХС, кальцієвий індекс 1599 од. Стеноз передньої міжшлуночкової гілки лівої коронарної артерії на 90 %, стеноз огинаючої гілки лівої коронарної артерії на 60 %, стеноз правої коронарної артерії на 90 %, що свідчить про важке ураження атеросклеротичним процесом основних гілок коронарних артерій та вимагає ургентного стентування двох вінцевих артерій або аорто-коронарного шунтування, 2 UA 117963 U 5 10 15 20 25 30 35 аби на 50 % зменшити ризик розвитку інфаркту міокарда та його ускладнень упродовж короткого часу. Спосіб здійснюють таким чином. Нативні мазки периферичної крові фарбують за методикою Мак-Гі-Рассела насиченим спиртовим розчином барвника алізаринового червоного S. Проводять дослідження під світловим мікроскопом під малим та великим збільшенням (1×100) (імерсійна система) та виявляють депозити солей кальцію в еритроцитах, які зафарбовуються у інтенсивно-червоний або коричневий колір на фоні інтенсивно-червоного тла або на фоні блідорожевого тла, характерного для нейтрофільних гранулоцитів. Підраховують кількість еритроцитів та лейкоцитів, що містять гранули, у відсотках відносно до загальної кількості клітин у полі зору, а також кількість гранул внутрішньоклітинних депозитів і визначають їх розміри. За результатами дослідження роблять висновок: "депозити кальцію у деяких клітинах крові (до 40 %) кожного поля зору", "депозити кальцію у багатьох клітинах кожного поля зору (4080 %)", "депозити кальцію майже в усіх клітинах кожного поля зору (більше 80 %)". На основі кількості виявлених еритроцитів з депозитами кальцію у мазках периферичної крові роблять висновок про ступінь кальцифікації вінцевих артерій, відтак, про передбачувану тяжкість клінічного перебігу ІХС та імовірний прогноз щодо виникнення у близькому майбутньому ГКС, зокрема нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда без або з елевацією сегмента ST, а також про ймовірність виникнення життєво-небезпечних ускладнень захворювання. Такі висновки враховують виявлену нами кореляцію між кальцифікацією вінцевих артерій за результатами мультиспіральної комп'ютерної томографії (МСКТ) і наявністю депозитів кальцію в еритроцитах на основі цитохімічного дослідження. Клінічний приклад. Пацієнт Д., 72 p. Гострий повторний інфаркт міокарда. Набряк легень. Цукровий діабет 2-го типу, середньої важкості. Діабетична нефропатія. Хронічна ниркова недостатність. При цитохімічному дослідженні мазків периферичної крові пацієнта з пофарбуванням за Мак-Гі-Расселом барвником алізарином червоним S, 97 % еритроцитів в полі зору препарату із специфічними темно-червоними гранулами (внутрішньоклітинними включеннями кальцію) - дуже високий ступінь кальцифікації вінцевих артерій та ризик виникнення серцево-судинних ускладнень, що відповідає 3 ступеню ураження міокарда при ІХС за S.F. Nagueh, 1999 [Relation of the contractile reserve of hibernating myocardial structure in humans / S.F. Nagueh, I. Mikati, D. Weilbaecher [et al.] // Circulation.-1999. - Vol. 98, Suppl. -P. 490496] (Фіг. 1). На Фіг. 2 - МСКТ того ж пацієнта, на якій підтверджено наявність стенозу передньої міжшлуночкової гілки лівої коронарної артерії на 90 %, стенозу огинаючої гілки лівої коронарної артерії на 60 %, стенозу правої коронарної артерії на 90 %, що свідчить про важке ураження атеросклеротичним процесом основних гілок коронарних артерій. Кальцієвий індекс у даного хворого 1599 од., що свідчить про дуже високий ризик виникнення ГКС в майбутньому та вимагає активної інвазивної лікувальної тактики - стентування двох вінцевих артерій або аортокоронарного шунтування. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 55 60 1. Спосіб діагностики кальцифікації вінцевих артерій і загрози розвитку гострого коронарного синдрому (ГКС), що включає визначення ступеня стенозу вінцевих артерій, який відрізняється тим, що проводять дослідження нативних мазків периферичної крові, які фарбують за методикою Мак-Гі-Рассела насиченим спиртовим розчином барвника алізаринового червоного S, з наступною світловою мікроскопією червоних кров'яних тілець, оцінюють результати цитохімічного дослідження еритроцитів та підраховують в полі зору мікроскопа кількість клітин, що містять депозити солей кальцію, і залежно від кількості еритроцитів з депозитами солей кальцію роблять висновок про ступінь кальцифікації коронарних артерій, тяжкість ішемічної хвороби серця (ІХС) та загрозу розвитку ГКС (нестабільної стенокардії, інфаркту міокарда без або з елевацією сегмента ST) і життєво-небезпечних ускладнень упродовж найближчого часу. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що при відсутності депозитів кальцію в еритроцитах мазків периферичної крові або при виявленні поодиноких депозитів в окремих клітинах не у кожному полі зору препарату роблять висновок про прогностично сприятливий перебіг ІХС з низьким ризиком виникнення потенційно небезпечних серцево-судинних ускладнень, при виявленні депозитів кальцію у деяких клітинах кожного поля зору (до 40 % еритроцитів від загальної кількості клітин в полі зору) підтверджують помірний ризик виникнення серцевосудинних ускладнено ІХС, при виявленні депозитів кальцію в багатьох еритроцитах (від 40 до 80 % кожного поля зору препарату) - про високий ризик виникнення ГКС в майбутньому, а при 3 UA 117963 U виявленні солей кальцію в усіх чи майже всіх клітинах (більше 80 % еритроцитів кожного поля зору препарату) - підтверджують дуже високий ступінь кальцифікації вінцевих артерій і відповідний ризик розвитку ГКС. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4