Спосіб підвищення стійкості сіянців сосни звичайної до інфекційного вилягання

Реферат: Спосіб підвищення стійкості сіянців сосни звичайної до інфекційного вилягання, у якому для захисту сіянців від фузаріозного вилягання використовують суспензію бактерій Pseudomonas abietaniphila P57. Для підвищення стійкості сіянців сосни звичайної застосовується штам Pseudomonas abietaniphila P57 у картопляно-декстрозному бульйоні для передпосівної оброблення насіння шляхом його замочування і поливання сіянців сосни звичайної двічі щомісяця в період їх активної вегетації. UA 118204 U (12) UA 118204 U UA 118204 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується галузі лісового господарства, зокрема біотехнологічних прийомів боротьби із інфекційними хворобами деревних рослин. Запропонований спосіб підвищення стійкості сіянців сосни звичайної може бути використаний у лісовому господарстві для біологічного захисту садивного матеріалу від інфекційного вилягання, яке спричиняють фітопатогенні гриби. Зазвичай, для боротьби зі збудниками грибкових інфекцій сосни звичайної застосовуються хімічні засоби [8]. Вагомим недоліком застосування пестицидів є те, що такі сполуки часто повністю не розкладаються і накопичуються у ґрунті та різних органах рослин, що призводить до забруднення довкілля і завдає шкоди здоров'ю людини. Одним з найбільш перспективних і екологічно чистих способів боротьби із хворобами рослин є використання біопрепаратів на основі живих штамів непатогенних бактерій, які є екологічно безпечними для природних та штучних фітоценозів. Виявлення позитивного впливу різноманітних непатогенних бактерій на стійкість рослин до ураження інфекційними захворюваннями дало змогу розробити на основі цих мікроорганізмів низку біопрепаратів, які ефективно застосовуються у процесі вирощування сільськогосподарських культур [7]. Цілком ймовірно, що такий позитивний ефект від застосування бактеріальних суспензій можна досягнути і при вирощуванні цінних лісоутворюючих порід, зокрема сосни звичайної. Однією з основних проблем при вирощуванні сіянців сосни звичайної є їх масове вилягання, спричинене фітопатогенними грибами родів Fusarium, Botrytis, Pythium, Alternaria та ін. Ці збудники уражають проростки у ґрунті, а також сіянці до моменту формування у них міцних механічних бар'єрів [8]. На сьогодні знайдено чималу кількість штамів ризосферних псевдомонад, які пригнічують ріст і розвиток фітопатогенних грибів та бактерій. Крім цього окремі види роду Pseudomonas можуть синтезувати широкий спектр вторинних метаболітів, серед яких гормони, які регулюють ріст і розвиток рослин. Деякі штами Pseudomonas здатні фіксувати атмосферний азот та індукувати у рослин стійкість до фітопатогенів [1]. Важливим є те, що бактерії роду Pseudomonas є типовою мікробіотою сосни звичайної, яка супроводжує її протягом усього онтогенезу [2]. Біопрепарати, до складу яких входять бактерії роду Pseudomonas, застосовуються для підвищення стійкості рослин проти хвороб. Зокрема, відомий спосіб біологічного захисту картоплі включає обробку бульб на всіх етапах агроценозу штамами Pseudomonas fluorescence AP-33, Agrobacterium radiobacter 204, Enterobacter nimipressuralis 32-3 [5]. Показано, що Pseudomonas fluorescence є факультативним патогеном для сосни звичайної і може викликати бактеріоз однорічних сіянців [3], що робить ризикованим використання цього штаму у боротьбі з інфекційними хворобами садивного матеріалу цієї рослини. Відомий спосіб застосування біопрепарату "БіоКСІН" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами. Цей препарат містить активні штами бактерій Pseudomonas aureofaciens 306 та Pseudomonas aureofaciens 111 y живильному середовищі, до складу якого входять сірчанокислий амоній, калій фосфорнокислий, меляса бурякова, кукурудзяний екстракт та магній сірчанокислий [4]. Цей препарат рекомендований для боротьби з фітопатогенами плодових дерев, овочів і зернових культур, його ефективність щодо підвищення стійкості сіянців сосни до збудників інфекційного вилягання не встановлена. Найбільш близьким за суттю до заявленого способу є спосіб захисту сіянців сосни звичайної від збудників "дитячої" хвороби з використанням біофунгіцидів Алірин-С (препарат на основі штаму Streptomyces felleus - 8 - ВИЗР) та Гамаїр (діюча речовина препарату - живі клітини та комплекс метаболітів штаму бактерії - антагоніста Bacillus subtilis M-22). Спосіб включає використання цих препаратів як окремо, так і в суміші у співвідношенні 1:1 для обприскування сіянців у три прийоми [6]. Суттєвим недоліком вищевказаного способу (прототипу) є те, що ці біофунгіциди використовуються тільки для обробки сходів сосни для захисту їх від інфекційного вилягання і не включає передпосівної обробки насіння сосни звичайної, яке може містити патогенну мікробіоту. Крім цього штами Bacillus subtilis та Streptomyces felleus належать до ґрунтових сапрофітів, активна дія яких обмежена ризосферою. Не вивчено вплив препаратів на проростання насіння і на стимулювання ростових процесів сосни звичайної. В основу корисної моделі поставлено задачу створити ефективний спосіб захисту сіянців сосни звичайної від збудників інфекційного вилягання з використанням непатогенних бактерій штаму Pseudomonas abietaniphila Р57, який би підвищував енергію проростання насіння і стимулював ріст сіянців. Поставлена задача вирішується шляхом оброблення насіння і сіянців сосни використовується 18-ти годинна культура бактерії Pseudomonas abietaniphila P57 у картопляно 1 UA 118204 U 7 5 10 15 20 25 30 декстрозному бульйоні (КДБ), яка розведена до 6×10 клітин/мл для захисту сходів від інфекційного вилягання, спричиненого фітопатогенними грибами. Насіння сосни на своїй поверхні часто містить збудників інфекційних захворювань, які уражають проростки до моменту появи сім'ядолей над рівнем ґрунту. Нами було показано, що штам Pseudomonas abietaniphila Р57 пригнічує ріст Fusarium sp., одного із основних збудників фузаріозу сіянців сосни звичайної [9]. Тому для забезпечення захисту проростків у ґрунті доцільно здійснювати попередню обробку насіння суспензією цих бактерій. Використання для обробки насіння і сіянців бактеріальної суспензії у КДБ дозволяє розширити спектр біологічної активності препарату за рахунок фітогормонів та корисних для захисту рослин метаболітів, які накопичуються у середовищі під час культивування Pseudomonas abietaniphila. Загальними ознаками прототипу і запропонованого способу є те, що для оброблення сіянців сосни звичайної використовують суспензію бактерій, які володіють протигрибковою активністю. Водночас, запропонований спосіб відрізняється від прототипу тим, що ним передбачено використання штаму Pseudomonas abietaniphila P57 для передпосівного обробляння насіння шляхом замочування протягом п'яти годин і для поливання бактеріальною суспензією сіянців двічі щомісяця протягом вегетації. Крім антифунгального ефекту, штам підвищує енергію проростання насіння, сприяє елонгації гіпокотилів і збільшенню фітомаси проростків сосни звичайної. Переваги застосування бактерії Pseudomonas abietaniphila для оброблення сосни звичайної у тому, що ця рухома паличка із джгутиками поширена не лише у ґрунті, але й виявлена на поверхні хвої сосни. Також, бактерії роду Pseudomonas виявлені серед ендофітної мікробіоти насіння сосни звичайної [2]. Джерелом живлення для Pseudomonas abietaniphila можуть бути трициклічні дитерпеноїди, що містяться у живиці сосни. Крім цього, бактерії роду Pseudomonas синтезують фітогормони і водночас пригнічують ріст фітопатогенних грибів. Ефективність запропонованого способу підтверджується прикладами. Приклад № 1. Рістстимулювальні властивості штаму Pseudomonas abietaniphila P57. Для порівняння впливу P. abietaniphila P57 із іншими штамами бактерій, які були виділені із різних органів сосни звичайної, на ріст проростків, семидобові проростки на чашках Петрі обприскували суспензіями бактерій. Через 72 год. після оброблення вимірювали довжину і масу проростків. У таблиці 1 показано, що із п'яти досліджуваних штамів лише P. abietaniphila P57 позитивно впливав на морфометричні показники десятидобових проростків. За контроль слугували проростки, обприскані культуральним середовищем. Таблиця 1 Морфометричні показники десятидобових проростків сосни звичайної після обробки бактеріальними суспензіями Штам бактерій Ізолят P1 (Bacillus subtilis) Ізолят Р2 (Bacillus licheniformis) Ізолят Ρ10 (Bacillus pumilus) Ізолят Р26 (Paenibacillus xylanexedens) Ізолят Р57 (Pseudomonas abietaniphila) Контроль 35 40 Довжина, мм M±m 36,72±12,4 37,46±10,1 32,47±6,9 31,33±10,5 46,30±10,7 41,40±12,7 Вага, мг M±m 10,94±4,2 12,05±5,1 13,10±1,2 14,80±1,7 16,40±1,1 12,30±2,2 Приклад № 2. Вплив P. abietaniphila P57 на проростання насіння сосни звичайної. Культуру бактерій нарощували у КДБ за температури 30 °C протягом 18 годин та розводили 7 дистильованою водою до 6×10 клітин/мл. В експерименті використано насіння урожаю різних років із 6 лісництв Львівської області. Насіння витримували протягом п'яти годин у бактеріальній суспензії P. abietaniphila P57, після чого однократно промивали дистильованою водою і висівали на змочений водою фільтрувальний папір у чашки Петрі. Контрольні проростки замочували у воді. Після пророщування насіння протягом семи діб за температури 25 °C, визначали енергію проростання насіння та довжину гіпокотилів. Результати досліджень, наведені у таблиці 2, показують, що енергія проростання насіння у середньому збільшується на 53 % порівняно з контролем, а також збільшувалась довжина гіпокотилів. 45 2 UA 118204 U Таблиця 2 Показники енергії проростання насіння та елонгації гіпокотилів сосни звичайної за впливу штаму P. abietaniphila Р57 Рік Енергія Походження № п/п збору проростання насіння (лісництво) насіння насіння, % 1 2 3 4 5 6 5 10 15 2015 2015 2013 2012 2012 2009 Соснівське Добротвірське Розточанське Низівське Нивицьке Бойківське 58 94 35 25 24 23 Збільшення енергії проростання насіння після обробки Р57, % 40 1 47 50 71 57 Довжина семидобових проростків, мм Контроль, мм Обробка Р57, M±m мм М±m 20,3±4,8 24,5±5,6 16,7±5,5 11,0±4,9 10,7±5,1 8,0±5,3 27,2±5,9 28,1±9,0 25,3±9,3 26,4±6,7 22,3±6,1 23,5±5,2 Приклад 3. Вплив штаму P. abietaniphila P57 на стійкість проростків та сіянців сосни звичайної до грибкової інфекції. Суспензію бактерій для замочування насіння і оброблення сіянців сосни звичайної готували так, як описано у попередньому прикладі. Частину насіння висівали в чашки Петрі для визначення інфікування проростків міцелієм фітопатогенних грибів, другу частину насіння висівали у відкритий ґрунт у першій декаді травня. Після появи сходів у відкритому грунті сіянці поливали бактеріальною суспензією 100 мл на 1 погонний метр. Наступні оброблення здійснювали двічі щомісяця в період їх активної вегетації. Облік кількості сіянців проводили на початку вересня. В лабораторних умовах і у відкритому ґрунті виявлено підвищення стійкості рослин, оброблених штамом P. abietaniphila P57, до ураження фітопатогенними мікроорганізмами. Кількість інфікованих проростків у чашках Петрі в експериментальних групах не перевищувала 2 %, а у контрольних - коливалась від 3 % до 80 %. Виживання сіянців у відкритому ґрунті збільшилося у середньому на 60 % у порівнянні з контролем (табл. 3). Таблиця 3 Показники стійкості проростків та сіянців сосни звичайної до грибкового інфікування за впливу штаму P. abietaniphila P57 № п/п 1 2 3 4 5 6 20 25 Рік збору насіння 2015 2015 2013 2012 2012 2009 Ураженість міцелієм семидобових проростків Походження насіння (лісництво) Контроль, % 5 3 11 80 77 18 Соснівське Добротвірське Розточанське Нивицьке Низівське Бойківське Обробка Р57, % 0 0 0 2 1 0 Збільшення виживання тримісячних сіянців відносно контролю, % 60 73 57 45 65 59 Отже, наведені результати свідчать, що з метою захисту сіянців сосни звичайної від масового інфекційного вилягання у розсадниках доцільно здійснювати передпосівне замочування насіння у бактеріальній суспензії штаму P. abietaniphila P57 і обробляти цією ж суспензією сіянці в період активного вегетативного росту. Джерела інформації: 1. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений / А.М. Воронин // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - № 10. - С. 25-31. 3 UA 118204 U 5 10 15 20 25 30 2. Гвоздяк Р.І. Аутомікрофлора насіння сосни звичайної та її системна взаємодія: теоретикоприкладний аспект / Р.I. Гвоздяк, А.Ф. Гойчук, В.В. Розенфельд. // Лісове і садово-паркове господарство. - 2012. - № 2. - Режим доступу: http://nbuv.gov.ua/UJRN/licgoc_2012_2_4. 3. Гойчук А.Ф. Бактеріальні хвороби сосни звичайної / А.Ф. Гойчук, В.В. Розенфельд // Наукові праці Лісівничої академії наук України: збірник наукових праць. - Львів: РВВ НЛТУ України. - 2011. - Вип. 9. - С. 130-136. 4. Декл. патент на корисну модель U UA № 77503, МПК A01N 63/02. Біопрепарат "Біоксін" для захисту рослин від хвороб, викликаних фітопатогенними грибами / С.І. Кравченко. - Опубл. 11.02.2013, бюл. №3. 5. Декл. патент на корисну модель U UA № 102284, МПК А01N 63/00. Спосіб біологічного захисту рослин картоплі / В.А. Колтунов, Μ.Д. Мельничук, В.В. Бородай, Т.В. Данілкова. - Опубл. 26.10.2015, бюл. №20. 6. Розенфельд В.В. Особливості використання біологічних фунгіцидів у лісових розсадниках / В.В. Розенфельд // Науковий вісник Національного університету біоресурсів і природокористування України. - 2014. - Вип. 198, Ч. 2. - С. 223-228. 7. Ткаленко Г. Біопрепарати в боротьбі зі шкідниками / Агробізнес сьогодні. 2013. № 4. Доступ: http://www.agrobusiness.com.ua/agronomiia-siogodni/1475-biopreparaty-v-borotbi-zishkidnykamy.html 8. Методичні рекомендації щодо захисту сіянців сосни від вилягання та шютте у відкритому та закритому грунті. - Харків, 2010. - 12 с. 9. Шаловило Ю.І. Ростостимулювальні та протигрибкові властивості штаму Pseudomonas abietaniphila / Ю.І. Шаловило // Миколаївська заочна конференція 2013 року. Секція "Лісове господарство". - С. 40-41. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб підвищення стійкості сіянців сосни звичайної до інфекційного вилягання, у якому для захисту сіянців від фузаріозного вилягання використовують суспензію бактерій Pseudomonas abietaniphila P57, який відрізняється тим, що для підвищення стійкості сіянців сосни звичайної застосовують штам Pseudomonas abietaniphila P57 у картопляно-декстрозному бульйоні для передпосівної обробки насіння шляхом його замочування і поливання сіянців сосни звичайної двічі щомісяця в період їх активної вегетації. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4