Спосіб оцінки потенційної оцінки стійкості сосни звичайної до фітопатогенного ураження

Реферат: Спосіб оцінки потенційної стійкості сосни звичайної до фітопатогенного ураження, що включає визначення дефензину в насінні імуноензимним методом, причому диференціація за стійкістю зразків насіння здійснюється без їхнього пророщування за вмістом дефензинів. UA 89282 U (12) UA 89282 U UA 89282 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі лісового господарства, зокрема до способів оцінки посівного матеріалу щодо стійкості до хвороб, і може бути використана у лісовому насінництві і селекції хвойних порід. Успішне виконання масштабних робіт по відновленню лісів та лісорозведенню тісно пов'язано із впровадженням у практику лісового господарства інтенсивних методів вирощування високоякісного садивного матеріалу. Сосна звичайна відновлюється виключно насіннєвим шляхом, і тому якість насіння визначально впливає на формування біологічно стійких і високопродуктивних насаджень цієї лісотвірної породи. При вирощуванні садивного матеріалу сосни у теплицях і розсадниках значну проблему становить вилягання сіянців, яке викликають гриби родів Fusarium, Botrytis, Pythium, Altemaria та ін. Збудники хвороби уражують проростки насіння у ґрунті, а також сходи, що вже з'явилися на поверхні ґрунту у перші 3-4 тижні росту [1]. При проростанні насіння розвиток патогенної мікрофлори на проростках пригнічується антимікробними сполуками, які виділяються рослиною. Логічно припустити, що висока концентрація у насінні сполук із антимікробними властивостями буде сприяти підвищенню його життєздатності і забезпечить стійкість проростків до ґрунтових патогенних мікроорганізмів. У насінні сосни звичайної, як і у інших видів покритонасінних і голонасінних рослин, містяться антимікробні сполуки, які належать до різних груп протеїнів, пов'язаних із патогенезом (PR-протеїнів). Одну із груп PR-протеїнів утворюють дефензини - це група катіонних пептидів із широким спектром біологічної активності [2]. Ці антимікробні сполуки накопичуються в насінні в процесі його дозрівання і їхній вміст може слугувати показником потенційної стійкості насіння і проростків до ураження патогенними мікроорганізмами. Відомі способи визначення стійкості рослин до фітопатогенів: за вмістом ненасичених жирних кислот у насінні льону [3], у проростках соняшника - за активністю каталази [4], а у паростках суниці - за вмістом нуклеопротеїдів [5]. Основним недоліком цих методів є недостатня точність, оскільки сполуки, вміст яких використовується як критерій оцінки на стійкість, безпосередньо не задіяні у захисних механізмах відповіді рослин на фітопатогенний вплив. Найбільш близьким по суті до заявленого способу є спосіб оцінки генотипів пшениці на стійкість до фузаріозу, описаний у патенті на винахід 12639 A UА, МПК А01Н 1/04, 1997 р. [6]. Відомий спосіб включає пророщування насіння пшениці протягом двох діб на стерильному середовищі (контроль) і на провокаційному середовищі (саліцилова кислота), висушування, визначення вмісту інгібітору трипсину та ідентифікацію стійких генотипів за перевищенням вмісту інгібітору трипсину в насінні, вирощеному на провокаційному середовищі, не менше ніж у 1,2 рази порівняно з контролем. Суттєвим недоліком прототипу є недостатня інформативність для визначення стійкості рослин такого показника, як активність інгібітору трипсину у вирощеному на саліциловій кислоті насінні. По-перше, така активність властива низці протеїнів, регуляція яких відбувається різними сигнальними шляхами, відмінними від саліцилатзалежного. По-друге, основною біологічною функцією інгібітору трипсину при проростанні насіння є не захист від патогенів, а регуляція активності власних ендогенних протеаз, завдяки яким відбувається гідроліз запасних протеїнів на фоні зменшення вмісту інгібіторів протеаз. В основу корисної моделі поставлена задача розробки ефективного та інформативного способу оцінки стійкості сосни звичайної до фітопатогенів на ранніх етапах постембріогенезу. Вказаний технічний результат досягається шляхом використання способу оцінки потенційної стійкості сосни звичайної до фітопатогенного ураження, що включає визначення в екстракті насіння сосни звичайної вмісту дефензинів імуноензимним методом із використанням специфічних антитіл і потенційна стійкість зразків оцінюється за вмістом в насінні дефензинів. При проведенні патентного пошуку заявником знайдене технічне рішення [6], що містить спільні суттєві ознаки із заявленим рішенням: для аналізу використовують насіння, спосіб включає визначення у насінні сполук, які належать до PR-протеїнів та за величиною їхнього вмісту здійснюється оцінка потенційної стійкості до фітопатогенів. Відмінними від прототипу ознаками у заявленій корисній моделі є: метод визначення антимікробного протеїну; визначення антимікробного компоненту у насінні без його пророщування; критерій, за яким ідентифікують стійкі зразки. Пропонований спосіб ґрунтується на тому, що дефензини сосни звичайної, які володіють високою активністю щодо збудників інфекційного вилягання сіянців, накопичуються у зародках і ендоспермі зрілого насіння [7]. Вміст цих антимікробних пептидів варіює і визначається як генетичними, так і епігенетичними чинниками. Насіння із вищим вмістом дефензину повинно 1 UA 89282 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 мати вищу схожість у відкритому ґрунті, оскільки пептиди із антимікробними властивостями будуть забезпечувати стійкість проростків до ґрунтових патогенів. Реалізацію заявленої корисної моделі здійснювали наступним чином. Насіння сосни розділяли на дві частини: першу частину висівали у відкритий ґрунт за умов природного інфекційного фону і через 45 днів визначали схожість, а в другій - визначали вміст дефензину імуноензимним методом на мікропланшетах із 96 лунками із оптично прозорого полістиролу із наступною спектрофотометрією реакційної суміші за довжини хвилі 405 нм згідно зі стандартною методикою [8]. Для проведення імунологічної реакції використовували моноспецифічні анти-дефензинові антитіла [9]. Вміст дефензину визначався в умовних одиницях відносно контролю (оптичне поглинання розчину без екстракту). Встановлено тісний кореляційний зв'язок між ґрунтовою схожістю насіння і вмістом дефензинів (r0,95=0,9). Дефензини насіння збільшували відсоток пророслих насінин внаслідок виживання насіння до винесення сім'ядолей над рівнем ґрунту і забезпечували стійкість проти збудників вилягання сіянців. Технічна завдання моделі - на основі порівняльного аналізу схожості насіння із різних лісонасінних ділянок і вмісту в ньому дефензину визначити показник кількісного вмісту цього пептиду, за яким можна прогнозувати потенційну стійкість насіння і сіянців сосни звичайної до інфекційного вилягання. Технічний результат заявленого способу полягає в тому, що його використання дозволить об'єктивно оцінити посівні якості насіння, більш точно визначити норму висіву насіння і спрогнозувати вихід садивного матеріалу. Приклад здійснення заявленого способу. Об'єктами досліджень слугували партії нормального, за селекційною характеристикою, насіння першого класу із 9 лісонасінних ділянок різних лісництв Львівської і Івано-Франківської області. По 400 насінин із кожної партії висівали у відкритий ґрунт і на 45 день підраховували кількість сіянців. Паралельно у зразках із кожної партії насіння визначали вміст дефензину імуноензимним методом. Для чого 0,2 г насіння сосни звичайної подрібнювали до порошкоподібного стану і додавали до нього 1 мл ЗФР (забуферений фізіологічний розчин). Суміш інкубували протягом 30 хв за 4 °С і центрифугували 30 хв при 14000 об/хв. 100 мкл освітленого екстракту (1 мг/мл) наносили в лунки імунологічного планшету, в контрольну лунку вносили 100 мкл ЗФР. Планшети інкубували 12 годин при 4 °C, після чого тричі промивали ЗФР. В кожну лунку вносили 100 мкл 0,5 % розчину альбуміну бика у ЗФР, інкубували 1 год. при 37 °C, тричі відмивали ЗФР. Потім у лунки додавали 100 мкл моноспецифічних антидефензинових антитіл (титр 1:500) і інкубували 2 год. при 37 °C, тричі відмивали ЗФР. Вносили 100 мкл розчину антитіл проти IgG кроля ("Promega"), кон'югованих із пероксидазою хрону, планшети інкубували 1 год. при 37 °C, тричі відмивали ЗФР. Пероксидазу детектували додаючи 100 мкл 0,1 % розчину ABTS (2,2'-азіно-біс(3-етилбензо-тіазолін-6-сульфонової кислоти) діамонієвої солі) та 0,05 % Н2О2 у кожну лунку і вимірюючи оптичну густину при 405 нм за допомогою фотометричного аналізатора мікропланшетів (ВіоТек, США). Нормалізацію сигналу здійснювали використовуючи рівень сигналу у контрольній лунці. Кожний експеримент проводили у трьохкратній повторності. За результатами імуноензимного аналізу встановлено, що вміст дефензинів у насінні урожаю 2009 року із різних лісонасінних ділянок варіював у досить широких межах (від 238,0±28,0 у.о до 486,0±2,0 у.о) і прямо пропорційно корелював із фунтовою схожістю насіння, що дозволяє досить точно диференціювати насіння за потенційною ґрунтовою схожістю і стійкістю проростків до інфекційного вилягання (табл. 1). На основі порівняння схожості насіння у відкритому ґрунті за умов природного інфекційного фону і вмісту в ньому дефензинів встановлено, що більша за 50 відсотків схожість характерна для насіння, в якому вміст дефензинів перевищував 350 у.о. Отже, використання заявленого способу дозволить більш точно і об'єктивно прогнозувати стійкість насіння сіянців сосни до фітопатогенного ураження. Тому використання в якості показника кількісного вмісту дефензину у насінні є перспективним. 2 UA 89282 U Таблиця 1 Вміст дефензинів і схожість насіння сосни звичайної із різних лісонасінних ділянок (збір 2009 р) № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 5 10 15 20 25 30 Походження насіння (лісництво) Дібровське Брюховицьке Лопатинське Витківське Лопатинське Ожидівське Сасівське Любельське Осмолодське Схожість насіння, % Вміст дефензинів, у.о. 33,4±3,1 27,9±2,1 31,3±3,4 38,8±3,1 37,7±5,0 51,2±6,7 50,6±2,5 55,2±6,7 67,2±5,5 253,7±50,9 238,0±28,0 273,8±9,1 287,0±52,0 329,5±12,5 372,0±48,5 380,7±37,4 455,3±12,0 486,0±2,0 Запропонований спосіб надає можливість протягом двох днів оцінити посівну якість декількох десятків партій насіння щодо потенційної стійкості до фітопатогенів, визначивши показник вмісту дефензину в ньому. Джерела інформації:. 1. Методичні рекомендації щодо захисту сіянців сосни від вилягання та шютте у відкритому та закритому ґрунті. - Харків, 2010. - 12 с. 2. Thomma BPHJ, Cammue BPA, Thevissen К. Plant defensins// Planta. - 2002. - 216. - P. 193202. 3. Декл. патент на винахід 10366 A UA, МПК А01Н 1/04. Спосіб визначення стійкості льонудовгунця до фітопатогенного ураження/ Й.Ф. Рівіс, С.Г. Слушняк, В.О. Величко, Б.Б. Данилик Опубл. 25.12.1996, бюл. № 4. 4. Декл. патент на корисну модель 79519 U UA, МПК А01Н 1/04. Спосіб прискореного визначення стійкості зразків соняшнику до вовчка (Orobanche cumana Wallr.)/ Т.В. Чигрин, О.А. Задорожна - Опубл. 25.04.2013, бюл. № 8. 5. Декл. патент на корисну модель 65705 U UA, МПК А01К 67/00. Спосіб визначення успадкування стійкості суниці до збудника фітофторозу Phytophtora cactorum Schroet/ A.M. Скорейко, А.Г. Зеля, П.О. Мельник, Т.О. Андрійчук, В.В. Хом'як, М.М. Кирик - Опубл. 12.12.2011, бюл. № 23. 6. Декл. патент на винахід 12639 A UA, МПК А01Н 1/04. Спосіб оцінки генотипів пшениці на стійкість до фузаріозу/ В.Г. Адамовська, С.В. Вовчук, О.О. Молодченкова, А.П. Левицький, Л.Т. Бабаянц; О.В. Гонтаренко - Опубл. 28.02.1997, бюл. № 1. 7. V. Kovaleva, R. Kiyamova, R. Cramer, H. Krynytskyy, I. Gout, V. Filonenko, R. Gout. Purification and molecular cloning of antimicrobial peptides from Scots pine seedlings// Peptides2009. - 30. - P. 2136-2143. 8. Егоров А.И., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. -М.: Высшая школа, 1991. - 288 с. 9. Kovaleva V, Krynytskyy H, Gout I, Gout R. Recombinant expression, affinity purification and functional characterization of Scots pine defensin 1// Appl Microbiol Biotechnol. - 2011. - 89. - № 4. P. 1093-1101. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб оцінки потенційної стійкості сосни звичайної до фітопатогенного ураження, що включає визначення дефензину в насінні імуноензимним методом, який відрізняється тим, що диференціація за стійкістю зразків насіння здійснюється без їхнього пророщування за вмістом дефензинів. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3