Спосіб оцінки морфології та локалізації мейотичного веретена поділу в ооцитах людини

Реферат: Спосіб оцінки морфології та локалізації мейотичного веретена в ооцитах людини включає культивування отриманих ооцитів в культуральному середовищі з додаванням 10 % людського альбуміну, вкритого мінеральною олією, денудацію ооцитів та виявлення за допомогою поляризаційної системи наявності мейотичного веретена поділу, його морфології та локалізацію мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла, з наступною оцінкою морфологічних варіантів мейотичного веретена поділу: А - компактне, ромбоподібне, з чіткими краями; В - змінена форма, розмиті краї; С - слабка візуалізація; D - візуалізація на межі першого полярного тіла і цитоплазми (телофаза І); Е - не візуалізується; F - зміна орієнтації осі веретена відповідно до першого полярного тіла; G - збільшене в розмірі, та з оцінкою локалізації мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла за наступними варіантами кутів його розміщення: UA 119210 U (12) UA 119210 U а - 0°-20°; b - 21°-45°; с - 46°-90°; d - 91°-180°. UA 119210 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до репродуктивної медицини, і може бути використана для оцінки якості ооцита людини в допоміжних репродуктивних технологіях, та може використовуватись в галузі біології, зокрема в репродуктивній біології. Аналіз та вивчення тільки морфологічних параметрів ооцита є недостатнім, щоб спрогнозувати якість та імплантаційний потенціал ембріона [1]. Наявність першого полярного тіла не завжди є критерієм зрілості яйцеклітини [2]. В науковій літературі відсутня класифікація морфологічних характеристик та локалізації мейотичного веретена поділу, яка б дозволила використовувати їх для прогнозування якості та імплантаційного потенціалу майбутнього ембріона. Адже порушення у структурі мейотичного веретена поділу можуть свідчити про аномальну сегрегацію хромосом після запліднення ооцитів, а це, в свою чергу, приводить до формування анеуплоїдії у хромосомному наборі ембріонів. В основу корисної моделі поставлена задача розробки способу оцінки морфології та локалізації мейотичного веретена поділу в ооцитах людини шляхом виявлення наявності мейотичного веретена, визначення його структури та розміщення відповідно до першого полярного тіла, що дозволяє розробити чітку класифікацію морфологічних форм мейотичного веретена поділу ооцита та його розташування. Технічний результат полягає в тому, що оцінка та виявлення особливостей структури та локалізації мейотичного веретена поділу дозволить прогнозувати якість запліднення, наявність хромосомних порушень та передбачити морфологічну якість та потенціал раннього ембріона та запобігти перенесення нежиттєздатних ембріонів до порожнини матки. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб оцінки морфології та локалізації мейотичного веретена поділу в ооцитах людини характеризується тим, що включає культивування отриманих ооцитів в культуральному середовищі з додаванням 10 % людського альбуміну, вкритого мінеральною олією, денудацію ооцитів та виявлення за допомогою поляризаційної системи наявності мейотичного веретена поділу, його морфології та локалізацію мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла, з наступною оцінкою морфологічних варіантів мейотичного веретена поділу: А - компактне, ромбоподібне, з чіткими краями; В - змінена форма, розмиті краї; С - слабка візуалізація; D - візуалізація на межі першого полярного тіла і цитоплазми (телофаза І); Е - не візуалізується; F - зміна орієнтації осі веретена відповідно до першого полярного тіла; G - збільшене в розмірі, та з оцінкою локалізації мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла за наступними варіантами кутів його розміщення: а - 0°-20°; b-21°-45°; с - 46°-90°; d-91°-180°. Оцінювання морфологічних характеристик мейотичного веретена поділу та його локалізації можна використовувати для прогнозу якості та зрілості ооцита до його запліднення при застосуванні допоміжних репродуктивних технологій. Також даний підхід відкриває нові можливості для жінок репродуктивного віку у збереженні своїх статевих клітин для використання їх з метою запліднення у найоптимальніший період свого життя. Суть корисної моделі пояснюють зображення, отримані за допомогою інструментів програми Oosight Meta поляризаційної системи, DIC контраст; х400, де: на Фіг. 1 представлені морфологічні варіанти (A, B, C, D, E, F, G) мейотичного веретена поділу; на Фіг. 2 схематично показано розподіл варіантів локалізації (a, b, c, d) за кутом розміщення мейотичного веретена поділу відносно першого полярного тіла; на Фіг. 3, як приклад, показано ооцит з локалізацією мейотичного веретена поділу (2) відповідно до варіанту "b" з кутом 41,09°, який виміряний за допомогою програмного забезпечення поляризаційної системи, відносно першого полярного тіла (1), з морфологічним варіантом В веретена; на Фіг. 4, як приклад, показаний варіант "с" з кутом локалізації мейотичного веретена поділу (2) відносно першого полярного тіла (1) 61,92°, з морфологічним варіантом А веретена поділу. Спосіб здійснюють наступним чином. Дослідження було виконано на 84 донорських ооцитах. Середній вік донорів жіночих гамет склав 27,7±3,35 р. Ооцити отримували під час пункції фолікулів в циклах ДРТ. Ооцити культивували в чашках зі скляним дном (FluoroDish, World Precision Instruments, Китай), що містили 15 мкл культурального середовища Global (LifeGlobal, США) з додаванням 10 % 1 UA 119210 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 людського альбуміну (LifeGlobal, США), вкритого мінеральною олією (LifeGlobal, США). Для попередження деполімеризації веретена в чашку розміщували не більше 3-х ооцитів. Після денудації ооцити перевіряли на наявність мейотичного веретена, візуалізацію якого проводили за допомогою поляризаційної системи Oosight (Hamilton Thorne, США) під мікроскопом Nikon Eclipse Ti-U (Японія) з мікроманіпуляторами Narishige в чашках зі скляним дном (FluoroDish, World Precision Instruments, Китай). Візуалізацію мейотичного веретена проводили на термостолику (TokaiHit, Японія) з підігрівом 37 °C. Температура в ембріологічній лабораторії була не нижчою за 28 °C. Оцінювали наявність мейотичного веретена, його морфологію та локалізацію веретена відповідно до першого полярного тіла. Для попередження помилок, під час візуалізації за допомогою піпеток Holding K-НРІР-1035 та Micro-Injection K-MPIP-1035 (COOK, США) ооцит виставляли в ракурс найоптимальнішої візуалізації морфології мейотичного веретена з чіткою візуалізацією полярного тіла. Кут розміщення веретена по відношенню до першого полярного тіла виміряли за допомогою інструментів програми Oosight Meta (Hamilton Thorne, США). Відносно морфології та локалізації веретена оцінювали кількість ембріонів на стадії дроблення, бластоцисти категорії А і кількість еуплоїдних і анеуплоїдних ембріонів. Біопсію ембріонів для проведення преімплантаційного дослідження виконували на третю або п'яту добу після запліднення, зразки фіксували і діагностували із застосуванням методу флуоресцентної in situ гібридизації (FISH) на хромосоми 13, 16, 18, 21, 22, X, Y. Статистичний аналіз здійснювали за допомогою тесту на нормальність Шапіро-Уілка, кореляції Спірмена і критерія χ-квадрат. За результатами досліджень та статистичного аналізу розроблені критерії оцінки морфологічних варіантів мейотичного веретена поділу (Фіг. 1): А - компактне, ромбоподібне, з чіткими краями; В - змінена форма, розмиті краї; С - слабка візуалізація; D - візуалізація на межі першого полярного тіла і цитоплазми (телофаза І); Е - не візуалізується; F - зміна орієнтації осі веретена відповідно до першого полярного тіла; G - збільшене в розмірі, та критерії оцінки локалізації мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла за наступними варіантами кутів його розміщення (фіг. 2): а - 0°-20°; b-21°-45°; с - 46°-90°; d-91°-180°. Результати дослідження показали, що оцінка веретена ооцита за структурою та розміщенням надає можливість передбачити якість та еуплоїдність майбутнього ембріона. Візуалізація веретена може бути запроваджена у повсякденну практику клінік допоміжних репродуктивних технологій як процедура, яка допоможе раціонально використовувати біологічний матеріал пацієнтів і витратні матеріали, а також робити достовірні прогнози, що задовольнять очікування пацієнтів. Спосіб був запробований в ТОВ "Медичний центр ІГР". Отримані результати підтверджують очікувані переваги розробленого способу і дозволяють рекомендувати запропонований спосіб оцінки мейотичного веретена людських ооцитів до впровадження в репродуктивну медицину, у відділи допоміжних репродуктивних технологій для прогнозу якості та зрілості яйцеклітин. Джерела інформації: 1. Tilia L. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy. A prospective cohort study / L. Tilia, С. Venetis, S. Kilani // Fertil. Steril. - 2016. - Vol. 105 (4). - P. 1085-1092 2. Asa E. Relationship between meiotic spindles visualization and intracytoplasmic sperm injection outcomes in human oocytes. / Asa E., Tabatabaee R., Farrokhi A., Nejatbakhsh R. // Anat Cell Biol. 2017. Vol. 50. P. 26-32. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб оцінки морфології та локалізації мейотичного веретена в ооцитах людини, який характеризується тим, що включає культивування отриманих ооцитів в культуральному середовищі з додаванням 10 % людського альбуміну, вкритого мінеральною олією, денудацію ооцитів та виявлення за допомогою поляризаційної системи наявності мейотичного веретена поділу, його морфології та локалізацію мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла, з наступною оцінкою морфологічних варіантів мейотичного веретена поділу: А - компактне, ромбоподібне, з чіткими краями; В - змінена форма, розмиті краї; С - слабка візуалізація; 2 UA 119210 U 5 D - візуалізація на межі першого полярного тіла і цитоплазми (телофаза І); Е - не візуалізується; F - зміна орієнтації осі веретена відповідно до першого полярного тіла; G - збільшене в розмірі, та з оцінкою локалізації мейотичного веретена поділу відповідно до першого полярного тіла за наступними варіантами кутів його розміщення: а - 0°-20°; b - 21°-45°; с - 46°-90°; d - 91°-180°. 3 UA 119210 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4