Спосіб кількісної оцінки нейротоксичної дії ртуті (на культурі нервових клітин людини)

Реферат: Спосіб кількісної оцінки нейротоксичної дії ртуті (на культурі нервових клітин людини) шляхом розрахунку кількості живих та мертвих клітин, визначення індексів цитопатичних змін за мертвими (ICCD) та за живими клітинами (ICCL), індексів проліферації за мертвими (ІРd), за живими клітинами (IPd) та за загальною кількістю клітин (IPg). UA 68137 U (54) СПОСІБ КІЛЬКІСНОЇ ОЦІНКИ НЕЙРОТОКСИЧНОЇ ДІЇ РТУТІ (НА КУЛЬТУРІ НЕРВОВИХ КЛІТИН ЛЮДИНИ) UA 68137 U UA 68137 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється, належить до медицини, а саме до токсикології та професійних патології, гігієни та морфології, і може бути використана для визначення наявності нейротоксичної дії сполук ртуті на клітини нервової тканини. Проблема нейротоксичності важких металів залишається остаточно невирішеною [7, 8]. У той же час актуальність та значимість її велика: обсяги виробництва хімічних речовин та їх викидів у навколишнє середовище постійно зростають, а ефективність класичних методів дослідження ступеня їх токсичності і небезпечності недостатня, що обумовлює розвиток нових напрямків оцінки токсичності речовин, таких як визначення цитотоксичної дії на культуру нервових тканин людини [6]. Нейробластома та гліобластома є типовими представниками ембріональних злоякісних пухлин нервової системи, проте вони здатні до спонтанної регресії; за певних умов можуть слідувати програмі диференціювання нейрона, демонструють синтез нейромедіаторів і специфічних ферментів, наявність електричної і хімічної збудливості мембрани. Основна властивість клітин нейробластоми та гліобластоми полягає у можливості прижиттєвого аналізу динаміки морфологічних і функціональних змін цих клітин в умовах in vitro під впливом біологічно активних речовин, які вводяться в культуральне середовище. У літературі [3, 4] описані способи кількісної оцінки нейротоксичності, однак вони мають недоліки і не завжди відповідають вимогам до оцінки результатів експериментальних моделей цитонейротоксичності. Відомий спосіб визначення кількісних показників дії хімічних речовин на нервову систему, суть якого полягає у розробці визначення відсотків живих та мертвих клітин, після культивування живі та мертві клітини підраховували в гемоцитометрі за допомогою барвника трипанового синього [1]. Недоліком цього способу є не врахування таких явищ, як руйнування мертвих клітин та здатність до поділу живих клітин, що утруднює порівняльну оцінку цитотоксичної дії речовин на клітини у динаміці. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб оцінки цитонейротоксичних ефектів [5], вибраний нами як прототип, суть якого полягає у розробці визначення у відсотках кількості Hoechst-позитивних клітин, які підраховували на 100 клітин кожної проби. Недоліком цього способу є неврахування вірогідності руйнування мертвих клітин та здатність до поділу живих клітин і, як наслідок, неможливість об'єктивної характеристики змін оцінки цитотоксичної дії речовин на клітини у часі. Задача, яка поставлена в основу способу, що заявляється, полягає в підвищені точності кількісної оцінки нейротоксичної дії ртуті за умов експозиції важкими металами (хлорид ртуті). Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який включає розрахунок відсотків живих та мертвих клітин, згідно з корисною моделлю, додатково визначають індекси цитопатичних змін за мертвими клітинами (ICCD) та за живими клітинами (ICCL), індекси проліферації за мертвими (IPd), за живими клітинами (ІР1) та за загальною кількістю клітин (IP g) і при зміні їх кількості оцінюють нейротоксичну дію ртуті. Запропонований засіб виконується наступним чином. Цитотоксична дія хлориду ртуті вивчалась методом двократних серійних розведень на постійних лініях клітин IMR-32 (нейробластома людини) та U-373 MG (гліобластома людини), які були вирощені за стандартних умов і утворювали моношар. Культури отримані з банку культури клітин Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Е. Кавецького НАН України. Вибір культур клітин обумовлений походженням з клітин організму людини, порівняною легкістю культивування, а також нейрогенним походженням, що дає змогу екстраполювати результати на нейрони in vivo [2]. Досліджувані клітини культивували в повному поживному середовищі RPMI-1640 (SIGMA, США), що містило 4 ммоль/л L-глютаміну, 10 % ембріональної сироватки теляти (SIGMA, США), у зволоженій атмосфері з 5 % CО2 при 37 C. Пересів клітин здійснювали за допомогою розчину версена (0,02 %, "БіоТест-лабораторія", Україна) при утворенні клітинами на субстраті суцільного моношару (4-та доба росту) заміщали середовищем, яке містило хлорид ртуті (II) в концентраціях від 1000 до 0,1 мкМоль/мл. Кожне розведення хімічного агента досліджувалось у 4 паралельних серіях. За контроль взяли клітини без додавання хімічних сполук. Чутливість клітин до дії хлориду ртуті в присутності досліджуваних антидотів вивчали за інгібіцією цитотоксичного ефекту ртуті при фарбуванні клітин трипановим синім, підрахунок клітин здійснювали за допомогою гемоцитометра. При цьому клітини висівали на 24-лункові 4 планшети з концентрацією 4×10 клітин/лунку (в 1 мл середовища), через 24 години вносили хлорид ртуті з антидотами та інкубували протягом 48 годин за стандартних умов. Підрахунок клітин здійснювали за допомогою гемоцитометра, фарбували клітини вітальним барвником 1 UA 68137 U 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 0,4 % трипановим синім, кількість клітин визначали за формулою: А/80 × 2=Х×10 (клітин в мілілітрі середовища), де А - кількість клітин, що була порахована у камері Горяєва (в 5-ти квадратах); × 2 - розведення з трипановим синім (1:1). Забарвлені клітини рахували за допомогою світлового мікроскопа. Для приготування цитологічних препаратів готували 6 суспензію досліджуваних клітин у фізіологічному розчині в концентрації від 0,2 до 0,3×10 клітин/мл, в цитоцентрифугальні кювети вносили по 50 мкл даної суспензії та центрифугували протягом 10 сек. при 1500 об./хв., висушували та фарбували. Для цього наносили на препарат барвник Майн-Грюнвальда на 3 хв., покривали скло зверху дистильованою водою рівномірно "гіркою", залишали ще на 3 хв., пpомивали дистильованою водою та наносили барвник Романовського розведений 1:10 дистильованою водою на 20 хв. Промивали препарат під дистильованою, а потім проточною водою та висушували. Аналізували під світловим мікроскопом (AxioStarPlus (Carl Zeiss, Німеччина). Вивчення кожного об'єкта дослідження здійснювалось чотирикратно. Для підвищення об'єктивної оцінки отриманих результатів розроблені такі показники, як відсотковий вміст клітин, індекси цитопатичних змін та індекси проліферації. У зв'язку з тим, що відбувався поділ живих та руйнування мертвих клітин, визначали такі середні показники: відсотки живих (нейробластів та нейрогліобластів) (L, %), індекси цитопатичних змін за мертвими клітинами (ICC D) та за живими клітинами (ICCL), індекси проліферації за мертвими (IPd), за живими клітинами (IP1) та за загальною кількістю клітин (IPg). Розрахунки показників проводили наступним чином: Lех=1/g×100 %, де l - кількість живих клітин; g - кількість всіх клітин у дослідженні. Dex=d/g×100 %, де d - кількість мертвих клітин; g - кількість всіх клітин у дослідженні. Для досліджень з різними дозами хлориду ртуті: ICCL=Lex/Lhg, де Lex - відсотки живих клітин від загальної кількості клітин у досліді з хлоридом ртуті; Lhg - відсотки живих клітин від загальної кількості клітин у контролі. ICCD=Dex/Dhg, де Dex - відсотки мертвих клітин від загальної кількості клітин у досліді з хлоридом ртуті; Dhg - відсотки мертвих клітин від загальної кількості клітин у контролі. = IPG gex/gk; IPL=lex/gk; IPD=dex/gk, де gex - кількість всіх клітин у досліді з хлоридом ртуті; gk - кількість всіх клітин у контролі; lех - кількість живих клітин у досліді з хлоридом ртуті; dex - кількість мертвих клітин у досліді з хлоридом ртуті. Статистичну обробку результатів вимірів структур спинного мозку та чутливих вузлів, а також даних досліджень in vitro проводили з використанням пакета статистичних програм Statistica 4.0 (Statistica Inc. США), Biostat і MS Excel. Відмінності між групами встановлювали використанням непараметричного критерію Манна-Утні-Вілкоксона. Достовірними вважали відмінності з рівнем значущості більше 95 % (р