Спосіб одержання цитохрому-с

Реферат: Спосіб одержання цитохрому-С включає екстрагування подрібненого серцевого м’яза ВРХ. Здійснюють екстракцію розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням. Відновлення цитохрому-С здійснюють додаванням калію залізоціанистого або калію фериціаніду. UA 120087 U (54) СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ЦИТОХРОМУ-С UA 120087 U UA 120087 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології одержання біологічно активних з'єднань, саме цитохрому-С, що може бути використаний в фармацевтичній промисловості та медицині для виготовлення антигіпоксичних лікарських засобів для нормалізації тканинного дихання, а також у науково-дослідницькій роботі. Відомий спосіб виділення цитохрому-С, що включає екстрагування подрібненого серцевого м'яза ссавців водним розчином сульфатів, підлужування, очищення на іонообмінних смолах з наступним виділенням цільового продукту. З метою поліпшення якості цільового продукту, екстракцію проводять 0,25-0,75 % розчином сульфату амонію, потім підкислюють сірчаною кислотою при рН 4-5 і підлужують гідроокисом барію до рН 8-9 (Патент України № 1110). Недоліками відомого способу є невисокий ступінь очищення цільового продукту, так як заявлені в свідоцтві етапи очищення цитохрому-С є недостатніми для очищення продукту від іонів сульфату амонію, яким проводять осадження, це викликає необхідність в додаткових способах очищення продукту. Також відомий спосіб одержання цитохрому-С, що включає знежирення сердець свиней, великої рогатої худоби або коней. Підготовлену сировину подрібнюють з одержанням фаршу, потім екстрагують 2,5 % розчином трихлороцтової кислоти при температурі 10-15 °C і рН 3,94,2. Відокремлюють екстракт і здійснюють його сорбцію на катіоніті, урівноваженому дистильованою водою. Після завершення сорбції катіонів промивають дистильованою водою і аміачно-амонійний буферним розчином. Потім проводять елюцію цитохрому C з катіоніту розчином сульфату амонію з наступним очищенням його діафільтрацією до повного видалення іонів сульфату амонію і концентрування цитохрому С ультрафільтрацією (Патент РФ № 2528061). Даний спосіб вибраний за прототип. За відомий спосіб очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію шляхом діафільтрації та ультрафільтрації розчину цитохрому-С із застосуванням мембран чи касет з порогом відсікання 5 кДа. Недоліком відомого способу є значні втрати цільового продукту при проведенні очищення цитохрому-С від іонів сульфату амонію шляхом ультрафільтрації із застосуванням мембран чи касет з порогом відсікання 5 кДа. В основу корисної моделі поставлена задача за рахунок зміни процесу очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію отримати продукт з вищим ступенем чистоти та збільшити вихід цитохрому-С. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м'яза великої рогатої худоби (ВРХ), відповідно до якого екстракцію здійснюють розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, відповідно до корисної моделі, відновлення цитохрому-С здійснюють додаванням калію залізоціанистого або калію фериціаніду. Очищення здійснюють шляхом проведення адсорбції та десорбції на катіоннообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт, з наступним заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі, розчиненням отриманого ліофілізату в 9 % розчині натрію хлориду, проведенні діафільтрації, ультрафільтрації та стерилізуючої фільтрації готового продукту. Здійснюють також додаткове очищення шляхом проведення повторного осадження баластних білків сульфатом амонію, що проводять двічі, та повторного очищення цільового продукту на катіонообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт. При проведенні ультрафільтрації застосовують мембрани з порогом відсічення 100 кДа та проводять стерилізуючу фільтрацію отриманого розчину крізь мембрани з розміром пор 0,22 мкм. Одержують цитохром-С наступним чином. Перероблені на фарш серця КРС вносять у реактор з підготовленим розчином амонію сульфату 2 %, вимішують та охолоджують до температури від 2 °C до 8 °C. Встановлюють рН 5 % розчином сірчаної кислоти (4,3±0,05), проводять екстракцію цитохрому при постійному перемішуванні у реакторі при температурі від 2 °C до 8 °C. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. В отриманому екстракті проводять осадження баластних білків розчином гідроокису барію при рН (8,5±0,05) та температурі від 2 °C до 8 °C. Після осадження розчин декантують та проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізоціанистого або 0,01 М калію фериціаніду. Для відновлення цитохрому-С розчин окислюють використовуючи калій залізоціанистий або 0,01 M калію фериціанід. Цитохром-С негайно відновлюється, і розчин змінює колір від червонувато-оранжевого до яскраво-рожевого. Цитохроми у відновленій формі дають дуже чіткі смуги поглинання у видимій області спектра. Це дає змогу візуально 1 UA 120087 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контролювати процес адсорбції та десорбції при хроматографічному очищенні цитохрому-С на кат іонообмінних колонках. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіоннообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Після одержання елюату цитохрому проводять додаткове очищення, що включає в себе осадження розчином амонію сірчанокислого протягом 12 годин при температурі від 2 °C до 8 °C. Відділення баластних білків фільтрацією на лійці Бюхнера, осадження цитохрому при рН (4,2±0,05) бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду при температурі від 2 °C до 8 °C. Отриманий осад відділяють центрифугуванням. Процес осадження повторюють та направляють отриманий розчин на очищення із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Отриманий розчин цитохрому-С заморожують та ліофілізують у вакуумі. Отриманий ліофілізат цитохрому-С розчиняють в розчині натрію хлориду 9 % та очищують шляхом проведення діафільтрації та ультрафільтрації розчину крізь касетні мембрани з порогом відсікання 100 КДа та проведенням стерилізуючої фільтрації крізь фільтруючу мембрану 0,22 мкм. Таким чином вихід цільового продукту зростає, що є особливо суттєвим при промисловому виробництві цитохрому-С, та має вищий ступінь чистоти за рахунок відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізоціанистого або 0,01 М калію феррицианіду та проведення додаткового очищення. Ефективність способу підтверджується наступними прикладами: Приклад 1 200 кг очищеного від крові жиру та сполучної тканини серцевого м'яза ВРХ подрібнюють та перероблюють на фарш та, при постійному перемішуванні, завантажують в реактор з підготовленим охолодженим до температури 2-8 ºС розчином 2 % сульфату амонію в кількості 50 л. Суміш в реакторі перемішують протягом 10-15 хв. при температурі 2-8 ºС та обертах мішалки 25±2 об/хв. Встановлюють рН суміші 4,3±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти та проводять екстракцію цитохрому-С при температурі 2-8 ºС протягом 1,5 год. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. Отриманий екстракт збирають в другий реактор та проводять осадження баластних білків шляхом нейтралізації екстракту гідроокисом барію, в кількості 3 кг, при рН 8,5±0,05 протягом 12-18 годин. При додаванні барію гідроокису в осад випадає сульфат барію та баластні білки, ізоелектрична точка яких нижче 8,5. В отриманому розчині проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізносинеродистого, в кількості 0,001 кг. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіоннообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію цитохрому-С при рН 8-9, а потім десорбцію розчину, додаванням 15 л розчину 1 М натрію хлориду в 0,02 М натрій-фосфатному буфері. Для досягнення повної десорбції розчин витримують на колонках протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Отриманий елюат збирають в скляні ємності та проводять додатковий етап очищення, що полягає в повторному осадженні та очищенні цитохрому-С. Осадження баластних білків проводять додаючи 5,6 кг амонію сірчанокислого при перемішуванні та витримують розчин протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Відділяють осад фільтруванням на лійці Бюхнера, розчин збирають в скляні ємності та осаджують в ньому цитохром-С бінарним комплексом кадмію хлориду та калію йодиду (в кількості 0,25 л на 1 л розчину) при рН (4,2±0,05). Витримують протягом 302 хвилин та відділяють утворений осад центрифугуванням при 2500 об/хв. Отриманий осад розчиняють у воді очищеній та встановлюють рН 4,2±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти. Процес осадження бінарним комплексом проводять іще раз. Після осад розчиняють в 8 л води очищеної, встановлюють рН 7,5±0,05 3 % розчином аміаку, для відновлення цитохрому додають 1 г калію залізоціанистого, перемішують та фільтрують розчин на лійці Бюхнера. Розчин очищують із застосуванням катіоннообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,450,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину цитохрому-С 3 % розчином аміаку. Отриманий розчин цитохрому-С розливають у флакони по 50 мл та проводять заморожування до температури (-65 ºС) та ліофілізацію при температурі (35±3) ºС та величині вакууму (48±12) mT. Отриманий ліофілізат збирають в єдину серію та розчиняють в 15 л 9 % розчину натрію хлориду, встановлюють рН 6,5-7,0. Розчин піддають діафільтрації та ультрафільтрації крізь мембрани з порогом відсікання 100 КДа та наступній стерилізуючій фільтрації крізь мембрану з розміром пор 0,22 мкм. Таким чином вихід цитохрому-С складає 0,89 г з 1 кг серцевого м'яза ВРХ, а показник чистоти складає 1,36 при (А550/А280). 2 UA 120087 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад 2 200 кг очищеного від крові жиру та сполучної тканини серцевого м'яза ВРХ подрібнюють та перероблюють на фарш та, при постійному перемішуванні, завантажують в реактор з підготовленим охолодженим до температури 2-8 ºС розчином 2 % сульфату амонію в кількості 50 л. Суміш в реакторі перемішують протягом 10-15 хв. при температурі 2-8 ºС та обертах мішалки 25±2 об/хв. Встановлюють рН суміші 4,3±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти та проводять екстракцію цитохрому-С при температурі 2-8 ºС протягом 1,5 год. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. Отриманий екстракт збирають в другий реактор та проводять осадження баластних білків шляхом нейтралізації екстракту гідроокисом барію, в кількості 3 кг, при рН 8,5±0,05 протягом 12-18 годин. При додаванні барію гідроокису в осад випадає сульфат барію та баластні білки, ізоелектрична точка яких нижче 8,5. В отриманому розчині проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання 0,01 М калію феррицианіду, в кількості 0,001 кг. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіоннообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію цитохрому-С при рН 8-9, а потім десорбцію розчину, додаванням 15 л розчину 1 М натрію хлориду в 0,02 М натрій-фосфатному буфері. Для досягнення повної десорбції розчин витримують на колонках протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Отриманий елюат збирають в скляні ємності та проводять додатковий етап очищення, що полягає в повторному осадженні та очищенні цитохрому-С. Осадження баластних білків проводять додаючи 5,6 кг амонію сірчанокислого при перемішуванні та витримують розчин протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Відділяють осад фільтруванням на лійці Бюхнера, розчин збирають в скляні ємності та осаджують в ньому цитохром-С бінарним комплексом кадмію хлориду та калію йодиду (в кількості 0,25 л на 1 л розчину) при рН (4,2±0,05). Витримують протягом 302 хвилин та відділяють утворений осад центрифугуванням при 2500 об/хв. Отриманий осад розчиняють у воді очищеній та встановлюють рН 4,2±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти. Процес осадження бінарним комплексом проводять ще раз. Після осад розчиняють в 8 л води очищеної, встановлюють рН 7,5±0,05 3 % розчином аміаку, для відновлення цитохрому додають 1 г калію феррицианіду, перемішують та фільтрують розчин на лійці Бюхнера. Розчин очищують із застосуванням катіоннообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,450,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину цитохрому-С 3 % розчином аміаку. Отриманий розчин цитохрому-С розливають у флакони по 50 мл та проводять заморожування до температури (-65 ºС) та ліофілізацію при температурі (35±3) ºС та величині вакууму (48±12) mT. Отриманий ліофілізат збирають в єдину серію та розчиняють в 15 л 9 % розчину натрію хлориду, встановлюють рН 6,5-7,0. Розчин піддають діафільтрації та ультрафільтрації крізь мембрани з порогом відсікання 100 КДа та наступній стерилізуючій фільтрації крізь мембрани з розміром пор 0,45 мкм та 0,22 мкм. Таким чином вихід цитохрому-С складає 0,88 г з 1 кг серцевого м'яза ВРХ, а показник чистоти складає 1,32 при (А 550/А280). Відповідно до технології, що заявляється, додаткове очищення, що включає осадження розчином амонію сірчанокислого протягом 12 годин при температурі від 2 °C до 8 °C, відділення баластних білків фільтрацією на лійці Бюхнера, осадження цитохрому при рН (4,2±0,05) бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду при температурі від 2 °C до 8 °C, наступним відділенням осаду центрифугуванням. Процес осадження повторюють та направляють отриманий розчин на очищення із застосуванням катіоннообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Отриманий розчин цитохрому-С заморожують та ліофілізують у вакуумі. Отриманий ліофілізат цитохрому-С розчиняють в розчині натрію хлориду 9 % та очищують шляхом проведення діафільтрації та ультрафільтрації розчину крізь касетні мембрани з порогом відсікання 100 КДа та проведенням стерилізуючої фільтрації крізь фільтруючу мембрану 0,22 мкм. Запропоновані зміни в технології одержання цитохрому-С полягають в додатковому очищенні продукту та дозволяють отримати більший вихід цільового продукту, що є особливо значущим в промисловому виробництві при напрацюванні великих об'ємів продукту. Таким чином, показники якості, зокрема показник чистоти, свідчать про вискоку якість готового продукту. Таким чином, застосування даних змін в технології дозволило отримати продукт з показником чистоти, що складає 1,32 при (А550/А280), а вихід цільового продукту склав 0,88-0,89 г цитохрому-С з 1 кг серцевого м'яза ВРХ. 3 UA 120087 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 1. Спосіб одержання цитохрому-С, що включає екстрагування подрібненого серцевого м'яза ВРХ, відповідно до якого екстракцію здійснюють розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, який відрізняється тим, що відновлення цитохромуС здійснюють додаванням калію залізоціанистого або калію фериціаніду. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що очищення здійснюють шляхом проведення адсорбції та десорбції на катіонообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт, наступним заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі, розчиненням отриманого ліофілізату в 9 % розчині натрію хлориду, проведення діафільтрації, ультрафільтрації та стерилізуючої фільтрації готового продукту. 3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що здійснюють додаткове очищення шляхом проведення повторного осадження баластних білків сульфатом амонію, що проводять двічі, та повторного очищення цільового продукту на катіонообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт. 4. Спосіб за п. 2 або 3, який відрізняється тим, що при проведенні ультрафільтрації застосовують мембрани з порогом відсічення 100 кДа та проводять стерилізуючу фільтрацію отриманого розчину крізь мембрани з розміром пор 0,22 мкм. Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4