Спосіб одержання засобу імуномодулюючої дії з трави підмаренника справжнього

Реферат: Спосіб одержання засобу імуномодулюючої дії включає екстракцію рослинної сировини 96 % спиртом етиловим. Як рослинну сировину використовують траву підмаренника справжнього (Galium verum L.). Екстракцію здійснюють при нагріванні на водяній бані при загальному співвідношенні сировина:екстрагент - 1:10, тричі по 30 хвилин, потім об'єднують зливи і концентрують під вакуумом до співвідношення сировина:готовий продукт 1:1. UA 120554 U (12) UA 120554 U UA 120554 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до хіміко-фармацевтичної галузі, а саме до способів одержання з рослинної сировини біологічно активних комплексів з імуномодулюючою активністю, які можуть бути використані як активні субстанції при створенні лікарських препаратів зазначеної фармакологічної активності у різних лікарських формах. Останнім часом спостерігається зниження показників здоров'я і ріст захворюваності населення внаслідок ряду об'єктивних причин, серед яких важливе місце займає погіршення екологічної ситуації, велике інформаційне та нервово-емоційне навантаження, зниження соціальної захищеності населення та багато інших факторів. Люди зі зниженою активністю імунної системи входять в групу ризику за станом здоров'я, відмічається зниження природної резистентності та імунологічної реактивності організму, яке пов'язане з ослабленням імунних, детоксикаційних та інших захисних адаптаційних механізмів. Для корекції імунодефіцитних станів використовуються лікарські засоби як синтетичного, так і рослинного походження. Завдяки комплексу біологічно активних речовин (БАР) рослинні засоби діють на організм в цілому насамперед шляхом активації функцій не тільки імунної, а й стабілізації нервової та ендокринної систем. На фармацевтичному ринку України імуномодуляторів рослинного походження нараховується незначна кількість. Тому актуальним для медицини та фармації є пошук та розробка вітчизняних ефективних лікарських засобів рослинного походження з імуномодулюючою дією. Відомий спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії [1] шляхом багаторазової екстракції трави підмаренника справжнього хлороформом при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:(10-12) до знебарвлення розчинника, при постійно підтримуваній температурі 55-60 °C, з рециркуляцією екстрагенту у замкненому циклі протягом 28-32 годин. До недоліків способу можна віднести використання леткого отруйного розчинника, а також багатостадійність і тривалість процесу. Крім того, спосіб не дозволяє одержати БАР з імуномодулюючою дією. Відомий спосіб одержання ліпофільного екстракту [2] шляхом екстракції трави підмаренника справжнього, подрібненого до розміру часток 0,5-1,5 мм з вологістю до 10 %, під тиском зрідженим газом, переважно дифторхлорметаном, при співвідношенні сировина:екстрагент 1:(220), переважно 1:(4-8), при температурі 10-50 °C, переважно 30-40 °C, протягом принаймні 2 годин, причому протягом перших 40 хв питома витрата екстрагенту становить 100 мл/хв на 1 кг сировини, а решту часу питому витрату екстрагенту зменшують вдвічі. До недоліків способу можна віднести складність, потребу у спеціальному обладнанні. Крім того, спосіб не дозволяє отримати БАР з імуномодулюючою дією. Відомий спосіб комплексної переробки рослинної сировини [3] для отримання засобу з імуномодулюючою дією шляхом попередньої багаторазової послідовної обробки трави маренки восьмилисткової хлороформом, сумішшю етилацетат:спирт (8:2) та водою; екстракцію хлороформом здійснюють при загальному співвідношенні сировина: екстрагент - 1:8-1:10, етилацетатно-спиртовою сумішшю (8:2) при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:10-1:12, водою - при загальному співвідношенні сировина: екстрагент - 1:4-1:5, тричі по 30 хвилин, а потім здійснюють видалення білково-полісахаридного комплексу при загальному співвідношенні водна витяжка:96 % етанол - 1:3, та упарювання отриманого фільтрату до видалення екстрагенту. До недоліків способу можна віднести його трудомісткість, багатостадійність та довготривалість. Спосіб потребує додаткових енергозатрат та використання різних органічних розчинників, що не завжди економічно доцільно. Задачею корисної моделі є створення способу одержання засобу з імуномодулюючою дією, який, завдяки використанню як рослинної сировини трави підмаренника справжнього (Galium verum L.) і проведення екстракції 96 % спиртом етиловим при нагріванні, дозволяє одержати субстанцію з вираженою фармакологічною дією, на основі якої може бути створений ряд фармацевтичних засобів у різних лікарських формах, придатних до ефективного та безпечного тривалого вживання з лікувально-профілактичною метою пацієнтами різних вікових груп. Поставлена задача вирішується тим, що у способі одержання засобу з імуномодулюючою дією шляхом екстракції рослинної сировини 96 % спиртом етиловим, згідно з корисною моделлю як сировину використовують траву підмаренника справжнього (Galium verum L.), екстракцію здійснюють при нагріванні на водяній бані при загальному співвідношенні сировина: екстрагент - 1:10, тричі по 30 хвилин, потім об'єднують зливи і концентрують під вакуумом до співвідношення сировина - готовий продукт 1:1. Корисною моделлю передбачено, що як рослинна сировина використовується трава підмаренника справжнього. Підмаренник справжній (Galium verum L.) багаторічна трав'яниста 1 UA 120554 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рослина родини маренові (Rubiaceae), широко використовується у народній медицині з лікувальною метою, а також входить до складу вітчизняного препарату "Тазалок", що використовується при клімактеричних розладах. Заявлений спосіб дозволяє вилучити з трави підмаренника справжнього біологічно активні речовини, які мають невідому досі для даної сировини імуномодулюючу дію, вперше досліджену авторами. Усі параметри заявленого способу визначено експериментальним шляхом з урахуванням біологічної активності одержаного засобу, ефективності, доступності та нешкідливості реактивів, практичного відтворення способу у промислових умовах. Сукупність ознак заявленого способу є новою, невідомою із джерел інформації. Експериментальним шляхом встановлено, що доцільним при здійсненні заявленого способу є використання трикратної екстракції сировини 96 % спиртом етиловим співвідношення сировини до екстрагента 1:10 та концентрування витяжки до співвідношення сировина:готовий продукт 1:1. При цьому, якщо співвідношення менше 1:10, то не забезпечується достатня екстракція БАР, що призводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Якщо співвідношення більше 1:10, то це призводить до ускладнення та подовження технологічного процесу, збільшення енерговитрат. Корисну модель здійснюють наступним чином: заготовлену у фазі цвітіння подрібнену траву підмаренника справжнього поміщають у екстрактор, заливають 96 % етанолом при загальному співвідношенні сировина: екстрагент 1:10 і екстрагують методом настоювання на киплячій водяній бані з використанням зворотного холодильника. Одержаний екстракт (при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10) зливають, а сировину ще двічі екстрагують за аналогічних умов. Екстракти об'єднують і концентрують у вакуумі до співвідношення сировина:готовий продукт 1:1. Отримана субстанція являє собою темно-брунатну рідину, яка містить 4,07 % гідроксикоричних кислот та 0,28 % флавоноїдів. У результаті здійснення заявленого способу одержують субстанцію рослинного походження з імуномодулюючою дією, нетоксичну, придатну до тривалого застосування. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. 1,0 кг заготовленої у фазу цвітіння і подрібненої трави підмаренника справжнього завантажували у екстрактор, заливали 10,0 л 96 % спирту етилового та настоювали на киплячій водяній бані з використанням зворотного холодильнику протягом 30 хвилин. Одержаний екстракт зливали. Сировину ще двічі заливали по 10,0 л 96 % спиртом етиловим та проводили екстракцію у тих же умовах. Зливи об'єднували і концентрували на роторно-вакуумному апараті до 1 кг. Приклад 2. Імуномодулюючу дію субстанції з трави підмаренника справжнього, одержаного за заявленим способом, вивчали in vitro шляхом вивчення їх впливу на функціональну активність лімфоцитів в реакції бластної трансформації лімфоцитів (РБТЛ) [4-7]. Як матеріал для тестування субстанцій використовували мононуклеарні клітини (лімфоцити), які були вилучені з венозної гепаринізованої крові шляхом центрифугування з використанням градієнта щільності фіколл-верографіна (щільність 1,077 г/мл), як описано за стандартною методикою [4, 5]. Отримані клітини культивували в середовищі 199, яке було доповнене 10 % розчином ембріональної телячої сироватки, 2 мл L-глутаміну, 100 мкг/мл гентаміцину. Суспензію (1млн. клітин в 1 мл культурального середовища з додаванням субстанцій) інкубували протягом 15-18 годин в термостаті при 37 °C, з 5 % СО2, в атмосфері насиченої водяної пари. Перед постановкою РБТЛ готували розведення екстракту, одержаного за заявленим способом, у співвідношеннях 1/20 та 1/200. По 100 мкл розведених субстанцій вносили до 100 мкл первинних культур імунокомпетентних клітин. Інтенсивність проліферативної реакції оцінювали за показниками активації синтезу ДНК, яка фіксувалася шляхом обробки зразків моноклональними антитілами до білку S-періоду клітинного мітотичного циклу - бромдеоксіуридин (BrdU) Antibody (3H579) концентрацією 100 мг/мл (Santa Cruz Biotechnology). Після остаточної підготовки зразків для постановки проточноцитометричного аналізу з використанням флуоресцентного детектора отримали числові данні загальної кількості клітин та відсоток баластних форм у зразках. Як контроль використовували стимуляцію одного із зразків мітогеном ФГА в концентрації 2,5 мкг/мл. Експеримент містив постановку реакції РБТЛ без додавання дослідних субстанцій (спонтанна баластна трансформація). Одержані показники статистично обробляли за допомогою програми "Microsoft Excel" [7]. Результати досліджень наведено в таблиці. 60 2 UA 120554 U Таблиця Вплив субстанцій Galium verum L. на показники бластної трансформації лімфоцитів (X±m), n=5 Субстанції Екстракт Контроль (ФГА) Спонтанна Розведення екстракту 1/200 1/20 РБТЛ, (%) 63,1±2,2* 66,7±2,4* 49,2±2,3 8,3±0,6 Примітка: * - Р < 0,05 у порівнянні до показника контролю. 5 10 15 Аналіз результатів дослідження свідчить, що одержаний за заявленим способом екстракт з трави підмаренника справжнього значною мірою стимулює трансформаційну активацію мононуклеарних клітин периферичної крові. При використанні 100 мкл досліджуваної субстанції в розведенні 1/20 відзначається максимальна стимуляція трансформаційної активації імунокомпетентних клітин. Так, екстракт Galium verum у розведенні 1/20 збільшив трансформаційну активацію мононуклеарів на 58,4 % у порівнянні з інтактним контролем (спонтанною баластною трансформацією) та на 17,5 % у порівнянні з ФГА. Навіть при розведенні 1/200 отриманий за заявленим способом екстракт збільшує трансформаційну активацію мононуклеарів на 54,8 % у порівнянні з інтактним контролем та на 13,9 % у порівнянні з ФГА. Таким, чином екстракт підмаренника справжнього проявляє дозозалежну стимулюючу дію на трансформаційну активацію мононуклеарних клітин периферичної крові. Отже, заявлено спосіб отримання імуномодулюючого засобу з трави підмаренника справжнього шляхом екстракції рослинної сировини 96 % етанолом. Заявлений спосіб простий, економічний, є екологічно безпечним і може бути здійснений на будь-якому фармацевтичному підприємстві зі стандартним обладнанням. Комплекс БАР з трави підмаренника справжнього, одержаний за заявленим способом, виявляє виражену імуномодулюючу дію, є практично нетоксичним і може бути використаний як лікарська субстанція при створенні лікарських засобів зазначеної дії. 20 25 30 35 40 Джерела інформації: 1. Пат. 64792, Україна. МПК (2011.01) А61K 36/74 (2006.01), А61K 135/00, А61Р 31/04 (2006.01). Спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії. - з. № u201102089, заявл. 22.02.2012, опубл. 25.11.2011, бюл. № 22. 2. Пат. 105231, Україна. МПК (2014.01) А61K 36/74 (2006.01), А61K 35/00. Спосіб одержання ліпофільного екстракту шляхом екстракції із трави підмаренника справжнього. - з. № а201202799, заявл. 12.03.2012, опубл. 25.04.2014, бюл. № 8. 3. Пат. 100292, Україна. МПК А61K 36/74 (2006.01) А61Р 37/04. Спосіб комплексної переробки трави маренки восьмилисткової для отримання засобу з імуномодулюючою дією. - з. № u201412603, заявл. 24.11.14., опубл. 27.07.2015, бюл. № 14. 4. Киселева Е.П. Использование микрометода для бласттрансформации лимфоцитов человека и животных /Ε.П. Киселева, А.С. Цвейбах, Е.И. Гольдман, Н.В. Пигарева //Иммунология. - 1985. - № 1. - С.76-78. 5. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии /В.М. Никитин //Кишинев: Штинца. - 1982. - 304 с. 6. Патент UA 105324 України на корисну модель, МПК G01N 21/00. Спосіб оцінки функціональної активності лімфоцитів за допомогою біоаналізатора Agilent 2100 / ДУ "ІМІ НАМИ". - № u201509727; заявл. 07.10.2015; опубл. 10.03.2016. Бюл. № 5. 7. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel /С.Η. Лапач, А.В. Чубенко, П.Н. Бабич //Киев: Морион. - 2000. - 320 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб одержання засобу імуномодулюючої дії, що включає екстракцію рослинної сировини 96 % спиртом етиловим, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують траву підмаренника справжнього (Galium verum L.), екстракцію здійснюють при нагріванні на водяній бані при загальному співвідношенні сировина:екстрагент - 1:10, тричі по 30 хвилин, потім об'єднують зливи і концентрують під вакуумом до співвідношення сировина:готовий продукт 1:1. 3 UA 120554 U Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4