Спосіб виготовлення інактивованої культуральної вакцини проти хвороби ауескі

1, СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИБИРОВАННОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ВАКЦИ НЫ ПРОТИВ ВОЛЕЗНИ АУЭСКИ, включающий выращивание вируса болезни Ауэски на культуре клетки СПЭВ, инактивацию формалином, адсорбцию на геле гидроокиси алюминия и консервирование глицерином, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения иммуно^ генности вакцины, инактивацию вируса формалином проводят после его консервирования глицерином, 2. Способ по п.!, о т л и ч а ю щийся тем, что, адсорбцию вируса проводят на геле гидроокиси алюминия, содержащего 0,60-0,62% сухого вещества при 4-8 в течение 18-20 часов. 3. Способ по п,1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что инактивацию вируса осуществляют формалином при 1830 С в течение 5-15 суток. (Л Q 00 1 11 10168 2 Изобретение относится к ветери7-Ю дней после однократной прививки] нарной вирусологии, а именно к спосои на продолжительное время (до 6бу приготовления анактивированных 11,5 месяцев после прививки). культуральных вакцин, применяемых для Недостатком этой вакцины является профилактики болезни Ауэски свиней, 5 не полностью надежный режим инактиваовец, и пушных зверей. ции высококонцентрированного вируса, поскольку в этом режиме не предусмотИзвестно, что качество инактивирено наряду с химическими веществамированных противовирусных вакцин (имфактора прогревания. Это может привомуногенная активность, безопасность, срок годности) во многом зависит от 10 дить к случаям производства небезвредных серий вакцины. концентрации исходного вируса, а также метода его инактивации в вакцине. Целью изобретения является повыПри изготовлении анактивированных шение иммуногенности вакцины. вакцин против болезни Ауэски со сравЦель в способе приготовления инакнительно невысокой концентрацией ви- 15 тивированной культуральной вакцины руса (менее 10 ЛД 5 о /мл для кроликов} против болезни Ауэски, включающем выдля инактивации вируса успешно примеращивание вируса болезни Ауэски на няются разные химические вещества в культуре клеток СПЭВ, инактивацию условиях никзотемпературного режима формалином, адсорбцию на геле гидроинкубации [1J . 20 окиси аллюминия и .консервирования глицерином, достигается тем, что инИзвестен способ приготовления инактивацию вируса формалином проводят активированной вакцины против болезпосле его консервирования глицерини • Ауэски из вирулентного высококонном. центрированного вируса М О ' ЛД е _/мл { выше) , заключающийся в одноименном 25 и Цель также достигается тем, что смешивании вирус"осодержащей культу." инактивацию вируса осуществляют форральной жидкости, гидроокиси алюмималином при 18-30 С в течение 5ния в 2%-ном разведении на фосфорно15 сут. буферном растворе, формалина, содерАдсорбционные свойства гидроокиси жащего 37-40% формальдегида, в коли- 30 алюминия изучали во взвесях при кочестве 0 s 05% и выдерживании этой сменечной концентрации сухого вещества си при температуре не выше Ю С в те0,2-0,4-0,6-0,8 и IX и количестве виру- , чение 5 дней [2] . са 60% в расчете на весь объем вакцины. Адсорбцию вируса проводили при 4°С в теЭта вакцина выгодно отличается от 35 чение 18 ч.Затем каждый образец центри-, вакцин, приготовленных другими спофугировали при 3000 об/мин в течение собами, тем, что она обеспечивает 60 мин и в супернатанте определяли тит- ' образование прочного иммунитета про'рованием на культуре клеток СПЭБ концен? тив болезни Ауэски у разных видов житрацию вируса болезни Ауэски (табл. 1). вотных в более короткие сроки (через Т а б л и ц а І Результаты изучения адсорбционных свойств гидроокиси алюминия в отношении вируса болезни Ауэски Гидроокись алюминия во взвеси 0,2 _ 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Титр вируса в супернатанте, ТЦЦ 50 /мл 7,25 4 2,5 1,25 1,5 1в5 Показатель отрицательной степени'десятичного логарифма Результаты опытов свидетельствуют 55 .санных условиях происходит при кон; о том, что максимальная адсорбция центрации сухого вещества 0,6%. культурального вируса болезни Ауэски Температурный режим инактивации на гидроокиси алюминия (99,9%) в опивируса изучали в образцах вакцины, з п 10168 содержащей 60% культурального вируса болезни Ауэски (концентрация е 10 Л Д 5 0 /мл для кроликов), 0,6% гидроокиси алюминия, 20% х.ч. глицерина и 0,05% формалина. При этом сначала вирУс адсорбировали на гидроокиси алюминия при +4 G в течение 18 ч, за тем добавляли глицерин и формалин и помещали образцы при 8-Ю, 18-20 и 30°С. Периодически (через 3,5; 10, 15 сут) пробы каждого образца вакцины для проверки на полноту инактивации вируса вводили подкожно в дозе 3,0 мл двум кроликам (табл,2). Т а б л и ц а 2 Результаты изучения температурных режимов инактивации вируса болезни Ауэски •4 4-х месячного возраста и овцах 618-меслчного возраста. Поросят иммунизировали вакциной двухкратно с интервалом между прививками в 7-8 дней 5 в дозах 2,5-5 мл. Овцам вакцину вводили однократно в дозах 1-8 мл. Напряженность иммунитета у вакцинированных животных испытывали через 2-3 недели после окончания иммунизации пу10 тем заражения вирулентным вирусом поросят интрацеребрально, а овец подкожным способом. При этом наиболее высокая иммуногенная активность, установлена в вак15 цине, содержащей 60% исходного вируса. 20 Показатель Температурный режим, С 8-Ю Срок полной инактивации вируса в вакцине, сут 18-20 в тече- 15 30 25 ние 15 сут вирус не инактивировалСЯ 3S Данные табл,2 свидетельствуют о том, что в предлагаемой вакцине надежная инактивация вируса происходит при 30 С уже через 5 сут. Этот режим наиболее приемлемый в технологическом отношении по сравнению с 40 другими изучаемыми режимами, был принят нами при изготовлении основных серий препарата. Сравнительное изучение нммуногенной активности предлагаемой вакцины, 45 содержащей различное количество исходного вируса, было проведено путем ^приготовления образцов вакцины» в состав которой входили гидроокись алюминия в количестве 0,6%, глицерин в 50 количестве 20%, формалин в количестве 0,05% и исходный вирус (концентрация 10 ЛД 5 о /мл для кроликов) в количествах 10-25-50% и 60% (инактивацию вируса в вакцинах проводили при 55 температуре 30 С в течение 5 суток), и испытания этих образцов на иммуногенность в опытах 'на поросятах 2 Таким образом, вакцина, приготовленная по предлагаемому способу, содержит следующие компоненты, %: Вируссодержащая культуралъная жидкость с концентрацией вируса І 0 - 1 0 Й 1 ? Л Д ^ / м л доя 60 кроликов Гидроокись алюминия с содержанием сухого вещества (6,010 ) Фосфатный буфер рН 7,6 10 Глицерин нейтральный х.ч, 20 ' Формалин„ содержащий 40% формальдегида 0,05 Последовательтюсть в составлении вакцины: вирус добавляют к смеси гидроокиси алюминия и фосфатного буфера, щуттелируют 15 вд, выдерживают при 4-8 С в течение 18-20 ч, добавляют глицерин, шуттелируют 15 мин, добавляют формалин, шуттелируют 15 мин, выставляют для инактивации при 1830 С в течение 5-15 сут. Всего по предлагаемому способу было приготовлено 10 серий вакішн, из них 8 - в лабораторных условиях и 2 опытные серии в усповиях производства Ставропольской биофабрики» Бее серии вакцины были стерильными, безвредными и высокоиммуногенными. Иммунологическую активность лабораторной серии вакцины изучатш в опытах на кроликах, поросятах 2-4 месячного возраста, овцах 6-18 месячного возраста. Вакцина предохраняла от заболевания и гибели 100% кроликов, вакцини- ' 5 1П01 68 6 рованных однократно в дозе 8 мл при матрас - всего 760 матрасов). Заразаражении их вирулентным вирусом боженные клетки в матрасе инкубировали лезни Ауэски в дозе 3-10 ЛД ? 0 /мл для в стационарном положении в термоста>кроликов, те при 37 С до полной дегенерации и Из 25 поросят, иммунизированных и сползания клеточного монослоя 5 вакциной двукратной в дозах 2,5-5 мл вследствие цнтопатического действия после интерацеребрального заражения вируса, что происходило через 24вирусом болезни Ауэски осталось здо36 ч после заражения. Затем вируссоровыми 21 голова (84%), при заболесодержащую жидкость из каждых двух вании 11 из 14 голов (78,6%) конт10 матрасов переливали во флаконы объерольных животных, мом 500 мл и производили высевы на питательные среды для проверки на В опытах на 10 поросятах, иммунибактериальную и микозную стериль- I зированных вакциной, приготовленной ность, а йлаконы на период инкубации по предлагаемому способу со сроком посевов (і 0 сут) выставляли в вертихранения 16 месяцев, после интра15 кальном положении в холодильнике при церебрального заражения осталось здо4-6 С (для отстаивания вируссодержаровыми 9 голов (90%), при заболеващей жидкости и осаждения клеточного нии 7 из 10 голов (70%) контрольных детрита), Оставшуюся вируссодержа— животных. щую жидкость со стерильных флаконов В опытах на 55 овцах, иммунизиро- 20 сливали в один сосуд, а оставшийся ванных однократно вакциной, приготовосадок со всех флаконов центрифугиленной по предлагаемому способу в д о ровали при 2000 об/мин в течение зах от 1-8 мл, после заражения виру20 мин и полученный супернатант долунтным вирусом осталось здоровыми бавляли к общей массе исходного ви53 головы (96,3%), при гибели всех 25 руса. Всего получено стерильного, 14 голов контрольных овец, освобожденного от клеточного детрита В опытах на 30 овцах, предлагаемая вируса - 96 л (титр этого вируса при вакцина испытывалась на скорость наспоследующей титрации(на кроликах соступленияи продолжительность создаватавил 10- а > 5 ЛД т о /мл)1 ' емого ею иммунитета. После контроль- 30 ного заражения все вакцинированные Вакцину составляли в баллонах овцы - 5 голов через 7 дней и 5 г о объемом 18 л. Общий объем вакцины в лов через 14 дней после однократной каждом баллоне равнялся 1 0 л , Вначале вакцины, а также 6 голов - через 6 в баллон вносили по 1 л гидроокиси месяцев и 4 головы - через 9 месяцев 35 алюминия, с концентрацией сухого вепосле двукратной прививки остались щества 6,2% - для первой серии и 6% здоровыми, при гибели от болезни для второй серии вакцины, и фосфатноАуэски всех 8 невакцинированных овец. го буфера рН 7,6 и эту смесь стерилиНа Ставропольской биофабрике по зовали путем автоклавирования при заявляемому способу приготовлено 2 40 120 С в течение-60 мин. После остыопытных серии вакцины следующим обра-1 вания в баллоны с гидроокисью алюмиэом. ния добавляли исходный вирус в колиКультуру перевиваемых клеток линии СПЭВ, выращенную в виде монослоя в 4 матрасах объемом 1500 мл на ростовой ^ питательной среде (среда 199, содержащая 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотики - пенициллина по 100 Ед/мл и стрептомицина по 100 мкг/мл), после смены ростовой 5 0 Рсредына поддерживающую(среда 199 с антибиотиками), заражали вирусом Ауэски 23-го пассажа (для вакцины с е рии № 1) и 24-го пассажа (для вакцины серии № 2) на клетках СПЭВ с множест- 5 5 венностью заражения 0,7 ТЦД ? 0 /клетка (5 мл вируса с титром 1 0 ' S l S ТЦД 50 /мл на 145 поддерживающей среды в каждый честве по 6 л, смесь шуттелировали 15 мин и выдерживали для адсорбции при 4°С в течение 18 ч для вакцины серии № 1 и - 20 ч для вакцины серии № 2, Затем в баллоны к адсорбированному вирусу добавляли по 2 л стерильного х,ч, нейтрального глицерина (глиг церин стерилизовали накануне в автоклаве при 110°С в течение 60 мин), шуттелировали 15 мин, добавляли формалин в количестве 5 мл (0,05%) и снова шуттелировали 10 мин. Всего было составлено 8 баллонов вакцины 1-й серии и 8 баллонов вакцины 2-й серии. Баллоны с вакциной для инактивации поместили в термостат при 30±0,1 С 7. Н Ю 168 8 туральной вакцины против болезни на 120 ч, ежедневно содержимое балАуэски, которая по сравнению с ваклонов дважды перемешивали. По истечецинами, приготовленными известными нии срока инактивации вакцину из 8 способами, имеет следующие преимущебаллонов первой серии и отдельно из ства: полностью безопасна и безвред8 баллонов второй серии смешивали в 5 на в виду абсолютной надежной инакреакторе и расфасовали во флаконы тивации в ней исходного вируса; имеет объемом 200 мл, которые герметически срок годности не менее 16 месяцев закупоривали, этикетировали и выставипосле изготовления против 7-10 месяли для хранения при +4 С, По 15 флаконов вакцины обеих серий были 10 цев у известных вакцин; обусловливает образование прочного иммунитета у • отобраны государственным контролем всех вакцинированных животных к 7 дню Ставропольской биофабрики в контрольпосле однократного введения против ную лабораторию, где они были иссле7-1Q дней и больше у известных вакдованы на стерильность (путем высевов на питательные среды), безвредность »5 цин; создает прочный иммунитет у вакцинированных животных продолжи(путем подкожного введения вакцины тельностью более 9 месяцев после двув дозе 5 мл двум кроликам, массой кратной прививки против 6-11,5 меся[і,8-2 кг) и иммуногенную активность ' цев у известных вакцин, (путем внутримышечного введения вакцины в дозе 5 мл трем овцам и после- 20 Это значительно повышает иммунодующего их заражения через 2 недели логическую и экономическую эффективвирулентным вирусом одновременно с ность вакцинопрофилактики болезни двумя контрольными овцами), По реАузски у свиней, овец и пушных звезультатам исследования контрольной рей. лаборатории обе серии вакцины были 25 Предложенный способ вполне подгостерильные, безвредные и иммуногентовлен для промышленного использованые ^все вакцинированные овцы остания на биофабриках МСХ СССР, произлись живыми и здоровыми, а контрольводящих биопрепараты против болезни ные овцы погибли от болезни Ауэски).' Предлагаемый способ обеспечивает 30 Ауэски, где и целесообразна его реализация. приготовление инактивированной куль Редактор С.Тимонина Составитель Техред Л.Сердгокова С. Светльшев Корректор Е.Рошко Заказ 1177/ДСП Тираж 367 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытии 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4