Спосіб одержання полівалентної грипозної вакцини типу “а”

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии и иммунологии, может быть использовано в производстве гриппозной вакцины с выраженным защитным эффектом ко многим штаммам вируса серотипа А, а также при получении иммунобиологических противогриппозных препаратов с широким спектром специфической активности. Известны инактивированные гриппозные вакцины, приготовленные путем культивирования выделенных или рекомбинантных штаммов вируса гриппа в куриных эмбрионах, концентрации и хроматографической очистки на микропористом стекле, инактивации ультрафиолетовым облучением с последующим контролем ряда параметров, в частности иммуногенности на животных. Таким образом приготовлены вакцины из штаммов А (Ленинград) 399/76 (H3N2)и рекомбинатного-NlB-6(H1N1). В иммуногенном отношении обе вакцины при испытании на мышах оказались высокоактивными [1]. Хроматографическая инактивированная дифакцина из тех же штаммов вируса гриппа с высоким положительным эффектом испытана на людях [2]. Однако высокоактивные гриппозные вакцины из любых штаммов вируса гриппа уже через 1-3 года становятся мало- или неэффективными из-за антигенного дрейфа циркулирующих вирусов гриппа. В основу изобретения поставлена задача получения поливалентной гриппозной вакцины, позволяющей повысить ее иммуногенность и протективную активность поливалентной гриппозной вакцины. Поставленная задача решается тем, что в способе получения поливалентной гриппозной вакцины типа А путем культивирования исходных эталонных штаммов вирусов, концентрированния и очистки их с последующим смешиванием, согласно изобретению, в качестве исходного материала используют иммуноселективные варианты штаммов вирусов А (Хабаровск) 4/1 (H1N1), А (Гонконг) 3/il (H3N2), А (Виктория) 2/1 (H3N2), А (Техас) 4/1 (H3N2). Способ осуществляют следующим образом. Из вариантов штаммов вируса гриппа, приготовленных методом иммуноселекции [3], обладающих повышенной иммуногенной активностью и способностью к широким антигенным перекрестам: А (Хабаровск) 4/1 (HtNI), А (Гонконг) 3/II (H3N2), А (Виктория) 2/IH3N2) и А (Те хас) 4/1 (H3N2), готовят концентрированные, очищенные, мнактиви-рованные, одинаковые по содержанию гемагглютинина моновакцины, равные объемы которых сводят в конечный препарат-поливалентную вакцину. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Готовят три вакцины из эталонных штаммов (ЭШ) вируса гриппа А (Хабаровск) 74/77 (H1N1). А (Гонконг) 1/68 (H3N2), А (Виктория) 35/72 (H3N2) и селекци-онированных из них вариантов (А (Хабаровск) 4/1, А (Гонконг) 3/II и А (Виктория) 2/1). Указанными штаммами и вариантами вируса гриппа заражают куриные эмбрионы. Полученные через 48 ч инкубации аллан-тоисные жидкости с титром гемагглютинина не ниже 1:128 сводят в п улы объемом 1000 мл, Концентрацию осуществляют центрифугированием вирусосодержащей взвеси при 20000 об/мин в течение 2 ч. Осадок ресус-пендируют в 50 мл растворителя (апироген-ный физиологический раствор с 0,2% плацентарного альбумина человека). Очистку концентрированной взвеси проводят методом колоночной хроматографии на микропористом стекле, инактивацию - облучением лампой БУФ-30 на расстоянии 17 см в течение 30 мин. Контроль полученных препаратов проводят согласно ТУ-42.14. "Вакцина гриппозная хроматографическая жидкая" МЗ СССР, 22.12.78 г. Гемагглютинирующая активность полученных моновакцин от 2048 до 32768 ГЕ/0,2 мл. Все вакцины с титром выше 1:2048 ГЕ/0,2 мл с помощью разбавителя доводят до данного титра и путем смешивания равных объемов моновакцин готовят тривакцины из ИСВ и ЭШ. Иммуногенную активность - уровень аи-тигемагглютинииов (АГ А) и длительность их сохранения в сыворотках кроои определяют на белых мышах массой 12-15 г путем вн ут-рибрюшинного введения вакцин по 0,3 мл. В обеих группах содержится по 170 мышей. На 10-е, 20-е, 30-е, 40-е и 50-е сутки после вакцинации от 30 мышей каждой группы получают кровь из венозного синуса у медиального угла глаза для исследования АГА. Сыворотки прогревают при 56°C 30 мин и титруют 2-кратные разведения в РТГА с диагностикумами из соответствующи х вакцинных штаммов вируса и 1%-ной взвесью куриных эритроцитов (табл.1). Данные таблицы свидетельствуют о том, что тривакцина из ИСВ вызывает выработку более высоких титров АГ А (от 2 до 4 раз) ко всем компонентам вакцины, которые сохраняются на защитном уровне до 40-а суток с момента прививки. При введении вакцины из ЭШ титры антител к штамму А (Хабаровск) 74/77 не достигают защитного уровня, к штамму А (Гонконг) 1/68 снижаются уже с 20-х, а к штамму А (Виктория) 35/72 - 40-х суток после прививки, т.е. снижаются в среднем о 1,5-2 раза быстрее. Пример 2. Готовят вакцины, как и в опыте 1 из 3 ЭШ и их вариантов, но компоненты А(Хабаровск) 74/77 и А(Хабаровск) 4/1 вводят в тривакцину с титром 1:4096 ГЕ/0,2 мл. Для изучения иммуногенной активности мышам вводят вн утрибрюшинно по 0,3 мл соответствующей вакцины. Контрольные мыши получают в том же объеме плацебо - разбавитель. На 20-е и 30-е сутки после иммунизации у 20 мышей каждой группы получают кровь для исследования АГА и РТГА с диагностикумами из эталонных вакцинных штаммов и их вариантов (табл.2). Из приведенных в табл. 2 данных видно, что при иммунизации тривакциной из ИСВ титры АГА в оба срока исследования ко всем вакцинным штаммам серотипа А (H3N2) достоверно выше, чем у мышей, привитых вакциной из ЭШ, в частности к антигенам из Эталонных штаммов - от 2,5 до 3,7 раза. В данном опыте дополнительно изучают ступень защиты животных привитых обеими вакцинами, в отношении эталонных вакцинных штаммов вируса гриппа. Защитное действие определяют на 25-е сутки от начала иммунизации путем интраназального заражения по 10 мышей каждой группы, включая контрольную, неразведенной взвесью эталонных вакцинных штаммов, которую вводят животным по 0,05 мл. Через 48 ч после заражения изучают репродукцию вируса в легких 4-5 животных каждой группы в разведениях от 10° до 107. Результаты обрабатывают методом интерполяции по Риду и Менчу (табл.3). Данные табл. 3 свидетельствуют о том, что тривакцина из ИСВ, в отличие от вакцины из ЭШ, сообщает животным более высокую степень защиты в отношении исходных ЭШ вируса гриппа, в том числе и от штамма А (Хабаровск) 74/77 при недостоверном различии уровня АГА к данному антигену у обеих групп привитых животных. Таким образом, тривакцина из иммуноселекционированных вариантов вируса гриппа вызывает не только более высокий уровень АГА к собственным и исходным штаммам вируса гриппа, но обладает и более высоким защитным эффектом в отношении эталонных штаммов вируса гриппа. Пример 3. Вакцину готовят как в первых двух примерах, но, помимо вышеуказанных трех эталонных штаммов в селекционированных вариантов, используют еще штамм вируса А (Те хас) 1 /77 и его вариант А (Техас) 4/1, активность которых соответственно 4096 ГЕ/0,2 мл и 16384 ГЕ/0,2 мл. Иммуногенную активность и защитное действие тетравакцин определяют на белых мышах масой 12-15 г, которым вводят внутрибрюшинно по 0,4 мл вакцины. Контрольные мыши получают плацебо - разбавитель в том же объеме. В каждой группе содержится по 150 мышей. На 20-е сутки после иммунизации от 30 мышей каждой группы забирают кровь для исследования АГА к антигенам из вакцинных штаммов и иммуноселекционированных вариантов. Результаты изучения уровня АГА представлены в табл. 4. Защитное действие вакцин определяют также на 20-е сутки методом, описанным ранее. Для заражения используют как вакцинные штаммы, так и штаммы более поздних сроков выделения по отношению к вакционным: А (Англия) 42/72 (H3N2), штамм, выделенный через 4 года после начала циркуляции вируса А (Гонконг) 1/68, а также штаммы А (Порт Чалмерз) 1/73 (H3N2) и А (Виктория) 3/75 (H3N2), выделенные через 1 и 3 года после начала циркуляции вируса А (Виктория) 35/72, Тетравакцина из ИСВ вызывает выработку более высокого уровня АГА, чем вакцина из ЭШ, к исходным штаммам вируса, за исключением штамма А (Гонконг) 1/68, в 2,5-3 раза, к собственным вариантам - от 2,5 до 7 раз, а к более поздним штаммам вируса - в 2,5-13 раз. Степень защиты животных обеих групп в отношении соответствующи х штаммов вируса гриппа, в основном, совпадают с уровнем АГА к тем же штаммам. Вместе с тем, при высоком уровне антител к штамму А (Гонконг) 1 /68 у мышей, привитых вакциной из ЭШ, степень защиты к селекционированному из него варианту А (Гонконг) 3/II также, как и к более позднему штамму А (Англия) 42/72 - крайне низкая (0 и 0,75 Ig LD50) no сравнению с мышами, привитыми тетравакциной из ИСВ (2,25 и 2,62 1д LD50). Такая же закономерность наблюдается у животных привитых тетравакциной из ЭШ и ИСВ, в отношении варианта А (Виктория) 2/1, штаммов А (Порт Чалмерз) 1/73 и А (Виктория) 35/72 - 1,83; 1,42; 1.11 Ig LD50 и 2,83; 3,69; 2,68 Ig LD 50, соответственно. Таким образом, тетравакцина из имму-носелекционированных вариантов по сравнению с тетравакциной из эталонных штаммов, сообщает привитым более высокий уровень АГА и более высокую степень перекрестной защиты не только к собственным и исходным штаммам, но и к вирусам гриппа поздних сроков выделения.