Спосіб детектування та визначення кількості аналітів, що базується на зменшенні відносної інтенсивності сигналу епр чутливої речовини у складі потрійних композитів при взаємодії з аналітами

1. Спосіб детектування та визначення кількості аналітів, в якому обробляють потрійні композити на основі стабільних органічних радикалів, нанесених на інертні носії, що містять внутрішній стандарт, досліджуваним розчином аналітів, визначають зменшення інтенсивності сигналу радикала в спектрі ЕПР композита, обробленого досліджуваним розчином, по відношенню до інтенсивності сигналу стандарту в цьому ж спектрі ЕПР, та визначають невідому концентрацію аналіту в досліджуваній системі шляхом співставлення отриманого значення відносного зменшення інтенсивності сигналу ЕПР радикала з калібрувальною кривою, U 2 (19) 1 3 25750 модії між парамагнітними молекулами кисню та молекулами мітки, яке лінійно пропорційне концентрації кисню. Варіюючи розчинність, заряд спінових міток, можна отримувати селективні парамагнітні сенсорні системи. Так, наприклад, для визначення концентрації кисню в позаклітинному середовищі у якості міток використовуються заряджені нітроксильні радикали, для визначення вмісту кисню в клітинах застосовують нейтральні нітроксили; така відмінність обумовлена неможливістю проходження заряджених радикалів крізь плазматичну мембрану клітини [3]. Поява сигналу в спектрі ЕПР при взаємодії з субстратами застосовується для детектування метаболіту NО в біологічних системах. С утність методу полягає у захопленні короткоживучого вільного радикалу NО пастками, які є комплексами заліза(ІІ) [4]. При взаємодії NО з такими пастками через високу спорідненість іонів заліза до молекул NО утворюються парамагнітні мононітрозильні комплекси заліза (ІІ) (S=1/2), які мають характерний триплетний сигнал в спектрі ЕПР (Т=77К) за рахунок взаємодії неспареного електрону з атомом азоту (І=1). Як приклад такої пастки, можна навести композит на основі диетилдитіокарбамату заліза (II), іммобілізованого на поверхні Y-цеоліту [5]. Поява сигналу в спектрі ЕПР мононітрозилдиетилдитіокарбаматного комплексу Fe (II), що утворюється при взаємодії даного композиту з NО, лежить в основі детектування даного субстрату. Недоліком цього методу є необхідність проведення визначення при 77К, що потребує охолодження системи рідким азотом. При визначенні концентрації аналітів в досліджуваних системах за допомогою методу ЕПР порівнюються значення подвійних інтегралів інтенсивності одних і тих самих піків в спектрах ЕПР стандартних зразків та зразків з невідомим вмістом аналіту. Так, кількісну оцінку вмісту радикалу NО при використанні описаної вище пастки для NО проводили шляхом порівняння подвійного інтегралу інтенсивності однієї з складових (g=2,035) частини триплетного сигналу ЕПР комплексу заліза(ІІ), що утворювався при взаємодії пастки з субстратом (NО), з подвійним інтегралом інтенсивності такої ж складової триплетного сигналу ЕПР стандартного розчину мононітрозилдиетилдитіокарбаматного комплексу Fe (II) [5]. В роботі [6] запропонована методика кількісного визначення хрому (V), що утворюється при взаємодії К2СrО4 з 1,2-дигідроксибензолом, яка базується на порівнянні значення подвійного інтегралу інтенсивності сигналу в спектрі ЕПР досліджуваних розчинів із значеннями подвійного інтегралу інтенсивності сигналів в спектрах ЕПР стандартних розчинів (2-етил-2-гідроксибутанато)оксохромату(V) натрію. Основним недоліком описаних вище методів кількісної оцінки аналітів (крім зазначеного вище недоліку окремого методу) є залежність отриманих результатів від умов проведення експерименту. А саме, для отримання точних, відтворюваних результатів необхідно дотримуватись ідентичних умов реєстрації спектрів ЕПР досліджуваних і ста 4 ндартних зразків, що є задачею, яка потребує спеціального рішення [5]. Прототипом даної корисної моделі є спосіб визначення нітратвідновлюючої здатності біологічної рідини на основі порівняння характеристик спектрів ЕПР сполук заліза, що утворюються в результаті взаємодії проб біологічних рідин з реагентами, що додаються для аналізу [7]. Сутність способу полягає у розділенні досліджуваної проби на дві частини (контрольну та робочу), додаванні до отриманих зразків однакової надлишкової кількості гіпосульфіту натрію, сірчаснокислого заліза, аскорбату натрію та, у випадку робочого зразку, нітрату натрію. Аскорбат натрію в даних зразках відновлює нітрат-іон до оксиду азоту (II), що при взаємодії з сірчанокислим залізом зв’язується у мононітрозильно-сірчанокислий комплекс заліза (II), який є парамагнітним і має сигнал в спектрі ЕПР при g=2,03. При порівнянні інтенсивностей зареєстрованих сигналів в спектрах ЕПР визначається відносне збільшення оксиду NO в робочому зразку після додавання нітрату натрію у порівнянні з контрольним зразком. Головним недоліком прототипу є те, що точне відтворення характеристик спектрів ЕПР є практично неможливим через неможливість урахування усі х параметрів, що впливають на інтенсивність сигналів в спектрах ЕПР (наприклад, рівня заповнення ампули, рівня, на якому розміщуються ампули в резонаторі спектрометру ЕПР, тощо), хоча автори і відзначають необхідність однакових значень основних характеристик (потужності випромінювання, високочастотної модуляції, постійної часу) прибору при реєстрації спектрів ЕПР обох зразків. Точне відтворення характеристик є критично важливим для проведення точного аналізу, оскільки висновок про кількість аналіту робиться саме на основі зміни характеристик спектру ЕПР. Іншим недоліком прототипу є досить складна методика проведення визначення, що включає додавання трьох або чотирьох різних реагентів при приготуванні кожної проби. Дана корисна модель полягає у розробці способу детектування та визначення кількості аналітів, що базується на зменшенні значення інтенсивності (подвійного інтегралу) сигналу радикалу (чутливої речовини) у порівнянні з інтенсивністю сигналу стандарту в спектрі ЕПР потрійного композиту (радикал - інертний носій - внутрішній стандарт) при його взаємодії з аналітами. Перевагами такого способу якісного та кількісного аналізу у порівнянні з прототипом є наявність внутрішнього стандарту, що повністю усуває залежність визначуваних концентрацій аналіту від способів приготування сенсорів на основі таких потрійних композитів та умов проведення запису спектрів ЕПР, а також відсутність потреби у додаванні декількох різних речовин до проб. Поставлена мета по розробці способу детектування та кількісного визначення аналітів досягається шляхом приготування подвійного композиту (інертний носій-внутрішній стандарт), іммобілізації чутливої речовини (стабільного органічного радикалу) на його поверхні (у випадку пористих носіїв термін "поверхня" включає внутрішню поверхню 5 25750 пор), обробці отриманого потрійного композиту серією розчинів з відомими концентраціями аналітів, визначенні відносного зменшення інтенсивностей (значень подвійних інтегралів) сигналів радикалу в спектрах ЕПР кожного зразка композиту, обробленого одним з таких розчинів, по відношенню до інтенсивностей сигналів стандарту в ци х же спектрах ЕПР, побудові калібрувальної кривої, визначенні відносного зменшення інтенсивності сигналу радикалу в спектрі ЕПР композиту, обробленого досліджуваним розчином, по відношенню до інтенсивності сигналу стандарту в цьому же спектрі ЕПР, та визначенні невідомої концентрації аналіту в досліджуваній системі шляхом співставлення отриманого значення відносного зменшення інтенсивності сигналу ЕПР з калібрувальною кривою. Введення внутрішнього стандарту дозволяє усун ути залежність характеристики, яка є критерієм наявності та вмісту аналіту (в даному випадку співвідношення інтенсивності сигналу радикалу до інтенсивності сигналу внутрішнього стандарту), від способу підготування досліджуваних проб, умов запису спектрів ЕПР, як це спостерігається для прототипу. В якості внутрішнього стандарту використовується стійка сполука парамагнітного іону металу, що дає сигнал в спектрі ЕПР, який не змінюється при взаємодії з субстратом. До таких сполук відносяться, наприклад, солі чи оксиди марганцю (ІІ), міді(ІІ), хрому(ІІІ), тощо. Введення внутрішнього стандарту в інертній носій досягається шляхом отримання частинок оксиду парамагнітного іону металу (розміром від декількох атомів і більше) при розкладі солі даного металу, інкорпорованої в носій, при нагріванні; або шляхом обробки інертного носія розчином солі парамагнітного іону металу в інертному розчиннику і подальшим осадженням парамагнітного іону металу у вигляді нерозчинної сполуки. Приготовлений таким чином подвійний композит може містити до 10% по масі внутрішнього стандарту. Вміст стандарту визначається можливістю детектування його чіткого сигналу в спектрі ЕПР. Введення внутрішнього стандарту в інертний носій було реалізовано на двох прикладах - отриманні композиту на основі пористого молекулярного сита МСМ-41 та оксиду марганцю (II) чи оксалату марганцю (II) в якості внутрішнього стандарту. Перший композит було отримано шляхом розкладу при 300°С ацетату марганцю (II), нанесеного на МСМ-41, на повітрі, відновленням воднем при 400°С з подальшим ре-окисненням на повітрі за кімнатної температури протягом 2 діб. В спектрі ЕПР отриманого композиту (Фіг.1) присутні 6 ліній, що виникають за рахунок взаємодії неспареного електрону з ядром Мn2+, магнітний момент якого дорівнює 5/2. Композит на основі оксалату марганцю (ІІ) був отриманий осадженням даної солі в порах МС М-41 шляхом обробки МСМ-41, просоченого розчином хлориду марганцю (ІІ) в воді, розчином оксалату натрію в воді. Даний композит також має 6 ліній в спектрі ЕПР, характерних для сполук марганцю (ІІ) (Фіг.2). 6 Введення активної речовини (радикалу) в інертний носій, що містить внутрішній стандарт, відбувається шляхом просочування такого подвійного композиту розчином радикалу певної концентрації та подальшим висушуванням. Вибір органічного радикалу, як активної речовини чутливого елементу, обумовлюється наступними чинниками: даний радикал має бути стабільним, не взаємодіяти з внутрішнім стандартом і давати чіткий вузький сигнал в спектрі ЕПР, що не змінюється з часом. Варіювання класу радикалу дає можливість отримати сенсори з різними сферами застосування, що визначається хімічними властивостями такого радикалу: у випадку, коли необхідно детектувати лише окисники, можна використовувати нітроксильні радикали, якщо ж необхідно визначати як відновники, так і окисники та кислоти, у якості активної речовини пропонується вердазильний радикал. Вміст радикалу в такому потрійному композиті визначається інтервалом значень концентрацій аналітів, які необхідно визначати. Отримання потрійного композиту було реалізоване на прикладі 4піридилвердазильного радикалу, введеного в МС М-41, що містив оксалат марганцю (ІІ). Вміст 4піридилвердазилу, розрахований по даним CHNаналізу, дорівнює 3,2%. Спектр ЕПР даного композиту наведено на Фіг.3. В даному спектрі ЕПР спостерігається суперпозиція двох сигналів: сигналу іону Мn2+ та вузького сигналу 4-піридилвердазилу. Для побудови калібрувальної кривої однакові за масою зразки потрійного композиту (інертний носій - внутрішній стандарт - радикал) обробляються розчинами аналітів з відомими концентраціями та визначаються значення подвійних інтегралів інтенсивностей сигналів радикалів в спектрах ЕПР даних систем, віднесені до подвійних інтегралів інтенсивностей сигналів стандарту в ци х же спектрах ЕПР. Побудова калібрувальної кривої була реалізована на прикладі обробки зразків композиту на основі 4-піридилвердазилу, іммобілізованого на поверхні МС М-41, що містить оксалат марганцю (II), розчинами сульфату міді (ІІ) (солі міді (ІІ) окислюють вердазильні радикали до відповідних катіонів вердазилію, які не дають сигналу в спектрах ЕПР). Зразки даного потрійного композиту були оброблені трьома розчинами сульфату міді (ІІ) з концентраціями 7,8×10-3М, 11,8×10-3М, 16×10-3М відповідно безпосередньо в ампулі для запису спектру ЕПР, який реєстрували через хвилину після обробки. В усіх випадках інтенсивність сигналу ЕПР 4-піридилвердазилу зменшувалась, в той час як інтенсивність сигналів оксалату марганцю (II) залишалась незмінною (Фіг.4-6). Подвійний інтеграл інтенсивності сигналу радикалу в спектрі ЕПР кожного обробленого розчином сульфату міді (ІІ) потрійного композиту було віднесено до значення подвійного інтегралу інтенсивності сигналу оксалату марганцю (II) в цьому ж спектрі ЕПР біля g=2,073, оскільки даний пік не перекривається в спектрах ЕПР з сигналами, що відповідають 4піридилвердазилу. Отримана калібрувальна крива наведена на Фіг.7. Визначення невідомої концентрації проводиться шляхом обробки потрійного композиту досліджуваним розчином, реєстрації спектру ЕПР 7 25750 отриманої системи, визначення значення інтенсивності сигналу радикалу, віднесеного до інтенсивності сигналу стандарту в цьому спектрі ЕПР, та знаходження невідомої концентрації при співставленні отриманого значення з калібрувальною кривою. Описаний тут спосіб якісного та кількісного визначення також можна використовувати для визначення речовин, що вступають в хімічні реакції з субстратами. Принцип детектування у такому випадку полягає у визначенні кількості субстрату, що залишилась в досліджуваному середовищі після його взаємодії з речовиною, що аналізується. Різниця між відомою початковою кількістю субстрату та кількістю, визначеною за допомогою способу детектування, що патентується, буде дорівнювати кількості речовини, яка визначається. Перелік фігур та креслень: На Фіг.1 зображено спектр ЕПР подвійного композиту на основі МСМ-41 та МnО. На Фіг.2 зображено спектр ЕПР подвійного композиту на основі МСМ-41 та МnС2О 4. На Фіг.3 зображено спектр ЕПР потрійного композиту на основі МСМ-41, 4-піридилвердазилу та МnС2О4. На Фіг.4-6 зображено спектри ЕПР потрійного композиту на основі МСМ-41, 4-піридилвердазилу та МnС2О4 , обробленого розчинами сульфату міді (ІІ) з концентрацією солі, рівною 7,8×10-3М (4), 11,8×10-3М (5), 16×10-3М (6). На Фіг.7 зображено калібрувальну криву. Дана корисна модель підтверджується, але не обмежується наведеними нижче прикладами. Мезопористе високовпорядковане молекулярне сито МС М-41 синтезоване за методикою, наведеною в [8]. Для приготування внутрішнього стандарту використовувались ацетат марганцю (II), хлорид марганцю (II) та оксалат натрію марки "х.ч." та "чда". 4-піридилвердазил було отримано за методикою, наведеною в [9]. Вміст органічного радикалу в композиті визначався методом CHN-аналізу. Приклади ілюструють отримання подвійного композиту на основі МСМ-41, що містить оксалат марганцю (II) у якості внутрішнього стандарту (приклад 1), метод отримання подвійного композиту на основі МСМ-41, що містить оксид марганцю (ІІ) у якості внутрішнього стандарту (приклад 2), метод отримання потрійного композиту на основі МС М-41, що містить оксалат марганцю (ІІ), та 4піридилвердазилу (приклад 3), зменшення інтенсивності сигналу ЕПР 4-піридилвердазилу при взаємодії отриманого потрійного композиту з 7,8×10-3М розчином сульфату міді (ІІ) (приклад 4), зменшення інтенсивності сигналу ЕПР 4піридилвердазилу при взаємодії отриманого потрійного композиту з 11,8×10-3М розчином сульфату міді (ІІ) (приклад 5), зменшення інтенсивності сигналу ЕПР 4-піридилвердазилу при взаємодії отриманого потрійного композиту з 16×10-3М розчином сульфату міді (ІІ) (приклад 6). 8 Приклад 1 160мг МСМ-41 обробляють розчином 14мг МnС12×6Н2О, після чого додають 8мг Na2C2O4. Через 2 години осад відфільтровують, висушують на повітрі. 70мг висушеного осаду обробляють розчином 10мг 4-піридилвердазилу в 4мл толуолу. На наступний день композит відфільтровують, промивають толуолом та висушують на повітрі. Приклад 2 1г МС М-41 просочують розчином 2мг ацетату марганцю (II) в мінімальній кількості метанолу, висушують на повітрі. Через 1 день отриманий матеріал нагрівають протягом 5 годин при 300°С, після чого зразок відновлюють воднем при 400°С та реокиснюють на повітрі протягом 2 діб. Приклад 3 390мг МС М-41, що містить оксалат марганцю II, просочують розчином 33мг 4піридилвердазильного радикалу в 4мл толуолу. На наступний день осад відфільтровують, промивають толуолом та висушують на повітрі. Приклад 4 35мг потрійного композиту на основі МСМ-41, що містить оксалат марганцю (II), та 4піридилвердазилу обробляється 0,2мл 7,8×10-3М розчину сульфату міді (ІІ) у воді. Через 1 хвилину реєструється спектр ЕПР отриманої суміші. Приклад 5 35мг потрійного композиту на основі МСМ-41, що містить оксалат марганцю (II), та 4піридилвердазилу обробляється 0,2мл 11,8×10-3М розчину сульфату міді (ІІ) у воді. Через 1 хвилину реєструється спектр ЕПР отриманої суміші. Приклад 6 35мг потрійного композиту на основі МСМ-41, що містить оксалат марганцю(II), та 4піридилвердазилу обробляється 0,2мл 16.10-3М розчину сульфату міді(ІІ) у воді. Через 1 хвилину реєструється спектр ЕПР отриманої суміші. Література [1]. Н.К. Зенков, Е.Б. Меньшиков, В.П. Реутов// Вестник Рос. АМН - 2000 - №4. - С.30. [2]. НМ. Swartz, Т. Walczak// Res. Chem. Intermed - 1996 - V. 22 - P.511. [3]. B. Gallez, С. Baydelet, B.F. Jordan// NMR Biomed. - 2004 - V. 17 - P.240. [4]. S. Fujii, T. Yoshimura// Coord. Chem. Rev. 2000 - V. 198 - P.89. [5]. E. van Faassen, A.Vanin// Nitric Oxide - 2006 - V.I5 - P.233. [6]. J. Chappell, B. Chiswell, A. Canning// Talanta - 1998 - V.46 - P.23. [7]. Сайфутдінов Р.Г., С уханов А.В.// RU 94017143 Al (1996). [8]. J.S. Beck, J.C. Vartuli, WJ. Roth, M. E. Leonovicz, C.T. Kresge, K.D. Schmitt, C.T.-W. Chu, D.H. Olson, E.W. Sheppard, J.B. McCullen, J.B. Higgins, J.L. Schienker// J. Am. Chem. Soc. - 1992 V. 114 - P. 10834. [9]. K. Mucai, M. Matsubara, H. Hisaton, Y. Hosokoshi, K. Inoue, N. Azuma// J. Ph ys. Chem. В 2002 - V. 106 - P.8632. 9 25750 10 11 Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 25750 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601