Спосіб скринінгу рослинних екстрактів на предмет виявлення їх здатності модифікувати резистентність мікроорганізмів до антибіотиків

Спосіб скринінгу рослинних екстрактів на предмет виявлення їх здатності модифікувати резистентність мікроорганізмів до антибіотиків, який відрізняється тим, що досліджувані препарати наносять на пластинки із силікагелем для тонкошарової хроматографії «Sorbfil», висушують, покривають попередньо засіяним 3 27939 дію антибіотиків на полірезистентні штами мікроорганізмів. Поставлене завдання вирішується тим, що досліджувані препарати наносять на пластинки із силікагелем для тонкошарової хроматографії «Sorbfil», висушують, покривають попередньо засіяним антибіотикорезистентною тест-культурою агаром, який додатково містить антибіотик в концентрації 1/4 МПК (мінімальної пригнічуючої концентрації) для даного штаму. Після інкубації впродовж 24 год. при 37°С виявляють зони пригнічення росту мікроорганізмів шляхом обприскування агару 1% розчином 1,3,5трифенілтетра-золію хлориду з додатковою інкубацією 2 год. при 37°С. Отримують цифрові зображення зон пригнічення росту, метричний аналіз яких здійснюють за допомогою спеціалізованої комп'ютерної програми UTHSCSA ImageToo1 2.0. Винахідницький рівень полягає у неочевидності якісного і кількісного співвідношення компонентів та застосуванні комп'ютерного аналізу, що забезпечує високу продуктивність тестування, а також дозволяє надійно диференціювати препарати з антибіотикопотенціюючими властивостями. Спосіб здійснюється наступним чином. Виняткове значення для забезпечення максимальної інформативності дослідження має адекватний вибір тест-штаму мікроорганізмів. З цією метою нами використано ізольований у 2002р. від пацієнта з хронічним остеомієлітом авторський штам метіцилінрезистентного S. aureus «Кунда», [депонований у Музеї патогенних для людини мікроорганізмів Інституту епідеміології иа інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України, м. Київ -колекційний №049056, та у колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, м. Харків - №16587]. Вказаний штам володіє фенотипом резистентності OXARGENRERYRTETRClPR. Для нього встановлено ефективні діючі концентрації вказаних антибіотиків і охарактеризовано основні детермінанти резистентності. Методом латексаглютинації [Slidex® MRSA Detection, bioMerieux, Франція] підтверджено класичний механізм метіцилінорезистетності цього штаму - продукцію кодованого геном тесА пеніцилін-зв'язуючого білка РВР2'. Високий рівень його резистентності до ципрофлоксацину, еритроміцину та тетрацикліну забезпечується ефлюксними механізмами мембранними протонними помпами NorA, MsrA, TetK. Ефлюксний механізм резистентності до фтор хінолонів - помпу NorA ідентифіковано на основі зниження протимікробної концентрацій ципрофлоксацину в присутності її специфічних інгібіторів: 30мкг/мл резерпіну (в 16 разів) і 20мкМ верапамілу (в 2 рази). MsrA-е флюксний механізм резистетності до макролідів доведено збільшенням чутливості штаму до еритроміцину в присутності специфічного інгібітора даної помпи 0,5мкМ арсенату натрію (64-128 разів) і неспецифічного інгібітора резерпіну 20 мкг/мл (у 2 рази) при негативному результаті дводискового тесту на індуцибельну рРНК-метилазу. 4 Функціювання протонної помпи TetK встановлено за 4-кратним підвищенням чутливості даного штаму до тетрацикліну в присутності її неспецифічного інгібітора резерпіну (30мкг/мл). Таким чином запропонований в якості тесткультури штам S. aureus «Кунда» дозволяє не лише виконати скринінг синергізму протимікробної дії рослинних екстрактів та їх компонентів з класичними антибіотиками, але й виявити інгібітори пеніци-лін-зв'язуючого білка РВР2' та ефлюксних механізмів резистентності стафілококів до фтор хінолонів, макролідів, тетрациклінів. Різні об'єми досліджуваних екстрактів (20, 10 і 5мкл) попередньо наносять на пластинки із силікагелем для тонкошарової хроматографії «Sorbfil» таким чином, щоб діаметр утворених плям не перевищував 1,0см. Після підсушування при кімнатній температурі для видалення розчинника пластинки заливають розплавленим і остудженим поживним агаром з антибіотиком в концентрації 1/4 МПК (100мкг/мл оксациліну), попередньо засіяним свіжою тест-культурою в кінцевій концентрації 107 КУО/мл. Контрольні дослідження виконуються з використанням поживного середовища без антибіотика. Для виявлення життєздатних бактерій і контрастування зон відсутності або пригнічення росту після інкубуації в термостаті при 37°С впродовж доби агар оприскують 1% водним розчином 1,3,5трифенілтетразолію хлориду. Посіви повторно інкубують в термостаті впродовж 2год. При цьому ділянки інтенсивного росту культури добре контрастуються формазаном (рис. 1,2). Оцінку розмірів зон пригнічення росту бактерій виконують за допомогою комп'ютерного аналізу. Для кожного посіву одержують його цифрове зображення за допомогою близькофокусної 5,0мегапіксельної цифрової фотокамери. Метричний аналіз цифрових зображень здійснюють за допомогою спеціалізованої комп'ютерної програми UTHSCSA ImageTool 2.0 [The University of Te xas Health Science Center in San Antonio, ® 1995-1996 // http://ddsdx.uthscsa.edu/]. Програма дозволяє виконувати метричний аналіз об'єктів за їх лінійними розмірами і площею з одночасною статистичною обробкою даних. Для масштабування зображення при цьому використовуються відрізки точно відомої довжини. Зони повної відсутності росту мікроорганізмів в агарі над плямами екстрактів на хроматографічній пластинці добре візуалізуються формазаном, що дозволяє легко виконати метричний аналіз 32бітного кольорового зображення. Такі зони свідчать про бактерицидний ефект біологічно активних сполук екстрактів (в контрольних посівах) або їх комбінації з присутніми в поживному середовищі антибіотиками (в дослідних посівах). Додаткові можливості контрастування зображення використовуються для виявлення зон часткового росту мікроорганізмів (які свідчать про бактеріостатичну дію). За допомогою команд програмного меню (Processing - Color to Grayscale) отримується копія зображення у відтінках сірого кольору, а за допомогою панелі інструментів Contrast / Brightness Control змінюється його 5 27939 яскравість і контрастність. Це дозволяє досягнути рівня чіткості зон часткового пригнічення росту культури, прийнятного для проведення їх метричного аналізу. У кожному конкретному випадку отримують 6 числових значень діаметра зони повного або часткового пригнічення росту мікроорганізмів. Висновок про антибіотикопотенціюючу дію препаратів роблять на основі порівняння характеру отриманих зон (повне чи часткове пригнічення росту) та середніх значень їх метричних даних у контролі (на середовищі без антибіотика) і в дослідному посіві (на середовищі з антибіотиком в суббакте-ріостатичній концентрації). Визначають величину відносного збільшення діаметра зони затримки росту тестштаму за формулою: D ´ 100 %= - 100, D0 де: D - діаметр зони затримки росту тестштаму під впливом екстракту на середовищі із суббактеріостатичною концентрацією антибіотика; D0 - діаметр зони затримки росту тест-штаму під впливом екстракту на середовищі без антибіотика. На основі цього показника оцінюють антибіотикопотенціюючу активність кожної дози препарату. У ти х випадках, коли екстракти не володіють прямою протимікробною активністю, визначається відсоткове співвідношення між величинами зони затримки росту на середовищі з оксациліном і діаметром плями на пластинці силікагелю. Приклад 1 Протестовано на синергічну взаємодію з оксациліном (100мкг/мл) 10 водно-етанольних екстрактів лікарських рослин. На рис. 9.1а (середовище з оксациліном) видно різке збільшення зон повної затримки росту МесА+ S. aureus «Кунда» над плямами з екстрактами суцвіть (6) і трави (85) гринделії розчепіреної Grindelia squarrosa (Pursh) Dun. в усіх тестованих дозах (20, 10 і 5мкл), порівняно з контрольним посівом на середовище без оксациліну (рис. 9.1b). Якщо прийняти до уваги, що вміст нелетких екстрагованих речовин у відповідних екстрактах гринделії становить 12 і 10мг/мл, то їх оксацилінпотенціююча активність в умовах виконаного експерименту проявляється в дозах