Стабілізатор базофільних гранулоцитів крові у пацієнтів з алергічними захворюваннями реагінового типу

М. Кл. G. 01 № 33/49 ЗАСТОСЗШАННЯ ЛЕГІШІІШІТЩЩ0ГО МІТОГЕННОГО ФАКТОРУ Винахід стосується медицини, зокрема алергології та клінічної імунології. Тканинні базофіли та Оазофільні гранулоцити крові є найважливішими структурними елементами системи секреторних клітин організму, які регулюють мікроциркуляцію та трофіку тканин. Стан цих клітин, що містять основні медіатори запалення, багато в чому визначає особливості формування запалення, в тому числі при найбільш поширених алергічних захворюваннях реагінового тилу. У теперешній час у клінічній практиці широко використовуються такі стабілізатори базофілів, як інтал та кетотіфен. Найбільш близьким за механізмом дії до пропонованого стабілізатора базофілів є спосіб стабілізації базофілів крові при алергічних захворюваннях реагінового типу за допомогою тимічного препарату вілозену (Е. В. Гюллінг, Т. Ю. Гоц, В. А. Гремяков "Доклады АН УССР" серія Б №6). Однак, свою постійну та виражену дію вілозен спричиняє тільки при концентрації 10%, що передбачає його ефективне використання лише при місцевому застосуванні. Зменшення концентрації препарату значно знижує його активність щодо стабілізації базофілів. Метою пропонованого винаходу є віднайдення засобів, що стабілізували б базофіли крові, забезпечували зменшення вивільнення гістаміну з цих клітин і, тим самим спричиняли б протизапальний вплив. Поставлена мета досягається застосуванням неполіпептидного мітогенного фактору (НМФ), який отримують з тимуса шляхом діалізу гомогенату проти 2 - 4 об'ємів дистильованої води, осадженням баластних речовин солями двовалентної ртуті та обробкою газоподібним азотом (авторське свідоцтво № 662103 від 22 січня 1979 р. "Спосіб отримання препарату тимуса, що пригнічує синтез реагінів", автори: І. А. Безвершенко, Е. В. Гюллінг) у якості стабілізатора базофілів. Неполіпептидний мітогенний фактор представляє собою діючу речовину вілозену та володіє наступними властивостями: пригнічує синтез IgE-антитіл, не містить пептидного зв'язку, який руйнується дією трипсину та пронази, прискорює включення 14-С-тимидіну у ДНК тимоцитів мишей СВА, викликає збільшення маси тимусу при введенні in vivo, стимулює продукцію IgG та ІдМ-антитіл спленоцитами у ВІДПОВІДЬ на одноразову імунізацію еритроцитами барана. І Оцінку дії неполіпептидного мітогенного фактора на базофільні гранулоцити крові проводили наступним чином: у пластикову пробірку, що містить 0,5 щ 0,2М розчину ЕДТА рН 2 — 7,0 брали 10 мл венозної крові у хворих алергічними захворюваннями реагінового типу. Кров розводили у 22,5 мл 0,9% розчину NaCl, нашаровували на градієнт щільності фікколу та верографіну 1, 080 при 20 °С, потім центрифугували у режимі 400д протягом 40 хвилин при кімнатній температурі. Інтерфазу еритроцитів відбирали та двічі відмивали у 15 та 10 мл розчину трис-А при режимі центрифугування відповідно 101 д та 60д протягом Юхвилин при 4 °С. Надосадову рідину зливали, а осад ресуспендирували в 10 мл розчину трис-АМС. Вивільнювачі гістаміну використовували в наступних концентраціях: водно-сольовий екстракт тимофіївки та алергени домашнього пилу серії № 18, 38, 47 у 100-кратних розведеннях від 0,1 до 1000 Р/мл. Неполіпептидний мітогенний фактор у концентраціях 1%; 0,1%; 0,01%. Вказані речовини розчиняли у буфері трис-АМС. Остаточний об'єм суміші 500 мкл. Зразки проб дублювали. Клітини інкубували при 37 °С протягом 1 години. Реакцію припиняли додаванням до порції клітин 2 мл охолодженого розчину трис-А, центрифугували при 2000 об/хв протягом 10 хвилин при 4 °С. Надосадову рідину зливали та в осадових порціях визначали вміст гістаміну мікроспектрофлюорометричним методом. Вивільнення гістаміну виражали у % до загального вмісту у порції клітин. і Приклади конкретного застосування: > Приклад 1. Хворий Сосновський М. В., 18 років, № історії хвороби 6115/337 надійшов у 2 алергологічне відділення ЦРКЛ Мінського району м. Києва для проходження передсезонної специфічної гіпосенсибілізаціі. З анамнезу; у весняно-літній період з1ЯВЛЯЮТЬСЯ рінорея, сльозотеча, утруднене дихання, сверблячі висипи по всьому тілу, набряклість обличчя. У подальшому зудячі висипи за типом кропивниці розповсюджуються по всьому тілу. Приймає антигістамінні препарати, які мають слабкий ефект. Хворіє протягом 10 років. Шкірні скарифікаційні проби позитивні: тимофіївка, вівсяниця, ежа, м'ятлик, райграс, кукурудза ++++; береза, пирій, соняшник +++; вільха, костер, кульбаба, ясень ++. Діагноз: Поліноз: ріно-кон'юнктивальна та бронхообструктивна форми, хронічна рецидивуюча кропивниця, фаза ремісії. Для визначення стабілізуючої дії НМФ у хворого брали з вени кров, визначали дегрануляцію базофілів під впливом специфічного алергену та досліджували вплив різних концентрацій НМФ на реактивність базофілів. Реактивність базофілів оцінювали за вивільненням гістаміну з клітин, індукованого комплексом реагін-алерген та у присутності різних концентрацій НМФ. Дані представлені на мал. 1. Мал. 1 Мал.2 Мал ,3 Умовні позначення: Р — зміна вмісту гістаміну у базофілах (%) С — концентрація алергену (Р Ш/мл) 0 — вихідний рівень вмісту гістаміну у базофілах (контроль) А — вивільнення гістаміну з базофілів під впливом специфічного алергену (%) В — зміни вмісту гістаміну в базофілах під впливом специфічного алергену при додаванні 1% розчину неполілептидного мітогенного фактора 4 Було встановлено, що вивільнення гістаміну під впливом специфічного алергену склало при концентрації алергену 0,1 Р NU/мл -23,8%, при концентрації 10 Р Ш/мл -61,9% при концентрації аллергена 1000 Р NU/мл -81%. Після додавання до проб 1% розчину НМФ дегрануляція значно зменшилась і склала всього -4,8% при концентрації алергену при концентрації алергену 10 та 1000 Р NU/мл. При використанні концентрації алергену 0,1 Р NU/мл дегрануляція клітин не тільки була відсутня, але й збільшився вміст гістаміну у клітинах у порівнянні з контролем. Неполіпептиднии мітогенний фактор у концентраціях 0,1% та 0,01% суттєвих змін дергануляції не викликав. і Приклад 2. Хворий Ченко А. В. , 21 рік, № історії хвороби 6106/335 надійшов до 2 алергологічного відділення ЦРКБ Мінського району м, Києва для проходження передсезонноі специфічної гіпосенсибілізації. В даний час пред'являє скарги на утруднене дихання , періодичний сухий кашель, загальну слабкість. З анамнезу: у весняно-літній період з(являються рінорея, кон'юнктивіт, набряклість обличчя. Приймає антигістамінні препарати, які малоефективні. Хворіє з дитинства. Шкірні скарифікаційні проби позитивні: тимофіївка, жито, райграс, костер ++++; вільха, береза, кульбаба, соняшник +++; вівсяниця, єжа, м1 ятлик ++; циклонен, ліщина, ясень +. Діагноз: хронічний астматичний бронхіт в стадії нестійкої ремісії, поліноз: ріно-кон'юнктивальна та бронхообструктивна форми в стадії ремісії. Реактивність базофілів визначається за вивільненням з клітин гістаміну індукованого комплексом реагін-антитіло та у присутності різних концентрацій НМФ. Дані представлені на мал. 2. Встановлено, що алерген-специфічне вивільнення гістаміну з базофілів при концентрації алергену пилку тимофіївки 0,1; 10; 1000 Р NU/мл склало відповідно -23,1%; 53,8%; -69,2%. При додаванні 1% розчину НМФ дегрануляція базофілів при всіх концентраціях алергену була відсутня. Вміст гістаміну у базофілах у порівнянні з контроле]^ збільшився відповідно на 41%; 35%; 27,8%. Приклад. З. І Хвора Воробей Т.Д., 34 роки, № історії хвороби 5078/26' надійшла у 2 алергологічне відділення ЦРКЛ Мінського районм. Києва зі скаргами на утруднене дихання, відчутт стискання в грудях, кашель. Вважає себе хворою протягом останніх трьох місяців після того, як у січні перенесла гострий бронхіт, Шкірн скарифікаційні проби з побутовими алергенами позитивні домашній пил серія №18 +++, серія №38 +++, серія №46 -м пір1 я подушки серія №193 ++, бібліотечний пил серія №1! Діагноз: Хронічний дифузний обструктивний бронхіт з астматичним компонентом, фаза загострення. Сенсибілізація до побутових алергенів, Реактивність базофілів оцінювали за вивільненням гістаміну з клітин, індукованого комплексом реагін-алерген присутності різних концентрацій НМФ. Дані подані на мал.З. Встановлено, що алерген-специфічне вивільнення гістаміну з базофілів при концентрації алергенну домашнього пилу 0,1; 10; 1000 Р Ш/мл склало відповідно -7,7%; -23,1%; -53, 8%. При додаванні 1% розчину НМФ дегрануляція базофілів при всіх концентрац іях алергену була відсу тня. Спостерігалось збільшення вмісту гістаміну у базофілах у порівнянні з контролем від 27 - 41%. НМФ у концентраціях 0,1 та 0,01% не викликав зменшення дегрануляції базофілів у порівнянні з антиген-індукованою. Також проводилось дослідження впливу різних концентрацій НМФ та вілозену на реактивність базофілів периферичної крові in vitro у 24 хворих алергічними захворюваннями реагінового типу у віці від17 до 55 років. У всіх хворих спостерігалася підвищена чутливість до алергенів трав та дерев, підтверджена шкірними скарифікаційними пробами. Під час дослідження хворі не отримували лікарські препарати. Контролем слугувала група з 12 практично здорових людеР з не обтяженим алергологічним анамнезом- У контрольної груп* вивільнення гістаміну з базофілів під впливом специфічним алергенів in vitro не спостерігалось. У дослідній груп: мало місце алерген-індуковане вивільнення гістаміну базофілів, для відновлення вмісту якого використовувалис однакові концентрації НМФ та вілозену — 1 та НМФ концентраціях 0,1% та 0,01%. ; Отримані дані подані у таблиці. Розведення алергену Р Ш/мл Вивільнення гістаміну з базофілів під впливом специфічного алергену у% у присутності 1% розчину вілозену ,і 10 1000 -18,0+3,8 -5,4+12,2 -37 ,6 +6 ,9 -15,0+ 17,6 -47,8+7,8 -24,2±12/6 у присут- у присут- у прису ності 1% ності 0, 1% ності О 01 Sрозчину розчину НМФ НМФ розчиь НМФ +24,6+6,2 -18,3+8,4 -20, 4 + ' +22,3+7,7 -21,2+6,8 -30,6+1 +19,5+7,9 -37,8+7,9 -38,2±1 Таким чином, НМФ спричиняє дозозалежну стабілізуючу на базофіли крові хворих алергічними захворювань реагінового типу, що забезпечує зменшення вивільни гістаміну з цих клітин. Перевага неполіпептидного мітогенного фактору у порівнянні з вілозеном проявляється у більш високому ступеню стабілізації базофілів, що дозволяє не тільки зменшувати дегрануляцію клітин, але й відновлювати більш високий відсоток вмісту клітин з неушкодженими гранулами ніж у контролі. Стандартний відсоток стабілізації гранул базофілів досягається меншими концентраціями НМФ у порівнянні з вілозеном. Окрім того, допустимі у клініці концентрації кетотіфену та інталу викликають значно меншу стабілізацію базофілів, ніж вілозен та НМФ. До того ж застосування більш високих концентрацій кетотіфену та інталу призводить до побічних явищ, вже описаних у літературі. Можливо, що клінічний ефект цих преп аратів не пов'язаний зі стабілізацією базофілів, а обумовлений іншими механізмами. В такому випадку є доцільним сумісне застосування інталу та кетотіфену з НМФ. Виявлена властивість неполіпептидного мітогенного фактору стабілізувати базофіли крові спрямована на пригнічення зап ального п р оцесу, що да є підстав и рекомендувати його для використання у комплексній терапії при запальних, у тому числі алергічних, захворювань, що дасть змогу підвищити ефективність лікування і скоротити строки перебування хворих у стаціонарі.