Штам фосфатмобілізуючих бактерій enterobacter nimipressuralis 32-3, що сприяє ефективному засвоєнню важкорозчинних фосфатів сільськогосподарськими рослинами та підвищенню їх врожайності

Штам фосфатмобілізуючих бактерій Enterobacter nimipressuralis 32-3 що сприяє ефективному засвоєнню важкорозчинних фосфатів сільськогосподарськими рослинами та підвищенню їх врожайності, Ф-116 Інститут сільськогосподарської мікробіологи УААН Корисна модель стосується сільськогосподарської мікробіологи, зокрема бактерій які використовують для покращення живлення та підвищення врожайності сільськогосподарських культур В основу корисної моделі поставлена задача одержання штаму ґрунтових бактерій, спроможного ефективно трансформувати важкорозчинні сполуки фосфору в легкозасвійні для рослин форми, що покращує їх мінеральне живлення та підвищує продуктивність, штаму, який є високотехнолопчним для виробництва бактеріальних препаратів Поставлена задача розв язана шляхом виділення з чорнозему південного нового ефективного штаму Enterobacter nimipressuralis 32-3, одержаного в Південному філіалі Інституту сільськогосподарської мікробіологи Української академії аграрних наук (ПФ ІСГМ УААН) Виділений з чорнозему південного ефективний штам Enterobacter nimipressuralis 32-3 використовують для виготовлення бактеріального біопрепарату що підвищує врожайність сільськогосподарських рослин Новий штам Enterobacter nimipressuraiis 32-3 одержано мікробіологічним виділенням фосфатмобілізуючих Містерій з чорнозему південного за загальноприйнятими методиками (Методические указания по выделению микроорганизмов растворяющих труднодоступные минеральные и органи ческие соединения фосфора Под ред Г С Муромцева -Ленинград, ВНИИСХМ-1981 -20с) Характеристика штаму фосфатмобілізуючих бактерій Ehterobacter mmipressurafis 32-3 Номенклатурні дані рід - Enterobacter-, вид - Entearobacter nimpressurahs 32-3 депонований в колекції Інституту сільськогосподарської мікробіологи УААН під реєстраційним номером Ф-116 в групі фосформобілізуючих мікроорганізмів Походження штаму Штам Enterobacter nimipressuralis 32-3 виділено в Південному філіалі ІСГМ УААН в 1995 році мікробіологічним методом Чайковською Л О і Мельничук Т М з чорнозему південного Ними ж штам ідентифікований за визначниками Берп (1984, 1997) Бютехнолопчна характеристика Штам Enterobacter nimpressurahs 32-3 трансформує вуглеводи з утворенням органічних кислот, при культивуванні на середовищах з нейтральною або слаболужною реакцією рН (м'ясопептонний бульйон - МПБ) продукує лужну фосфатазу Відмічені властивості штаму свідчать про можливість трансформувати як мінеральні так і органічні важкорозчинні сполуки фосфору Крім того штам Enterobacter mmtpressuralis 32-3 має здатність до продукування індолілоцтової кислоти (ЮК) Культурально-морфологічні ознаки Клітини трьохдобової культури штаму Enterobactier CO о CM го 3203 nimipressuralis 32-3 мають паличкоподібну форму, розмір клітин - 1,6хО,9мш, рухомі (перітрих) Грамнеагативні, спори не утворює, пілі, капсули та мікрокапсупи не виявлені. При вивченні ультратонкоі структури клітин (метод ультратонких зрізів) встановлено, що вони мають будову, характерну для грамнегативних бактерій. За даними скануючої електронної мікроскопи на поверхні колоній виявлено потужну поверхневу плівку, через яку ледве проглядають контури бактеріальних клітин. Розміщення клітин в колоніях хаотичне. Факультативний анаероб. Ріст бактерій при посіві штрихом на м'ясопептонному агарі (МЛА) значний, колір штриха світло-бежевий. На гліцерино-пептонному агарі утворює дрібні, круглі, випуклі, непрозорі колони жовтувато-білого кольору з рівними краями. При рості в МПБ утворюється слабка муть і незначний осад. На картопляному косяку відмічено помірний ріст з утворенням незначної кількості слизу, колір штриха - білуватий, косяк злегка буріє. Відноситься до швидкоростучих бактерій. Фізюлого-бюхімічні властивості На середовищі Кінга пігментів не утворює На середовищі з органічним джерелом азоту (МЛА) ріст добрий, на синтетичному середовищі з мінеральним джерелом азоту (середовище Козера) ріст менш інтенсивний. Протеолітичні ферменти утворює - желатин розріджує Амілолітичні ферменти не виділяє крохмаль не гщролізує. Каталаза в клітинах присутня; синтез уреази, відсутній. Органічні кислоти як єдине джерело вуглецю не використовує: на середовищі Козера з цитратом натрію не відмічено прояву ознаки Нітрати відновлює до нітритів яскрава проява ознаки; реакція з реактивом Гріса позитивна, газоутворення не відмічено. При використанні вуглеводів (глюкоза, сахароза, рамноза, лактоза) — середовище підкислюється з утворенням бульбашок газу При рості на середовищі Ендо індол не утворюється, колір колоній -світло-бежевий. Відмін МІЖ ростом при 22° та 37°С не виявлено. Ріст бактерій спостерігається в діапазоні рН5-8, оптимум РН-77,5. Ознаки штаму стійкі. Він не є патогенним. Культуру зберігають на МПА з додаванням кукурудзяного екстракту або на гороховому агарі з додаванням сахарози при температурі 4-5°С, пересів один раз в 6 місяців. Штам Enterobacter nimipressuralis 32-3 використовують для виготовлення рідкого біопрепарату для передпосівної" інокуляції насіння злакових, зернобобових та овочевих культур. Готують біопрепарат на рідкому поживному середовищі наступного складу: кукурудзяний екстракт 1% меляса 2% крейда 1% Титр рідкої культури повинен бути не нижче 78млрд клітин в 1мл суспензії. Зберігають препарат при температурі 10-15°С до двох тижнів, в холодильнику (без заморожування) 4 місяці. Обробку насіння зернових та зернобобових культур проводять в день посіву, а ще краще невеликими партіями безпосередньо перед висівом. Передпосівну обробку насіння біопрепаратом здійснюють вручну (на брезенті) або в чистій машині для протравлення зерна. Результати вивчення впливу штаму Enterobacter nimipressuralis 32-3 на ріст, продуктивність та засвоєння важкорозчинних органічних та мінеральних фосфатів сільськогосподарськими рослинами в умовах вегетаційних ДОСЛІДІВ подані в таблицях Позитивна дія передпосівної інокуляції відмічена як на фоні органічних (фітин), так і мінеральних важкорозчинних фосфатів (ортофосфат кальцію) Аналіз одержаних даних свідчить про те, що передпосівна інокуляція насіння сої сорту Кріпиш суспензією Enterobacter nimipressuralis 32-3 (розрахункова доза інокулюму 1,6x104 бактерій/насінину) позитивно вплинула на ріст і продуктивність рослин Так, їх висота зростала до 1617%; нагромадження сухої біомаси - на 14-30%; число бобів, що зав'язалися на одній рослині зросло на 70% (табл.1). При постановці окисно-відновлювального тесту Х'ю-Лейфсона виявлено бродильний характер використання глюкози — бактерії розвиваються і підкислюють середовище як в аеробних, так і в анаеробних умовах В анаеробних умовах виявлено розрив стовпчика агару. Таблиця 1 Вплив передпосівної інокуляції насіння на ріст і продуктивність сої сорту Кріпиш, середнє за 1996-1998 роки Варіант Висота CM /о Суха маса 1 рослини г /о Число бобів, що зав'язалися на одній рослині штук % Фон: фітин Без інокуляції (контроль) Enterobacter nimipressuralis 32-3 Найменша істотна різниця НІР05 Без інокуляції (контроль) Enterobacter nimipressuralis 32-3 Найменша істотна різниця НІР05 43,8 100 2,0 100 50,6 16 2,6 зо 3,5 0,15 Фон о ртофосфат кальцію 45,9 100 100 2,1 53,7 17 2,4 14 2,4 0,10 2,5 4,1 0,8 100 64 2.7 100 70 4,6 0,5 3203 Свідченням більш енергійного засвоєння фосфору важкорозчинних сполук є зростання вмісту Р2О5 в біомасі рослин у варіантах, де застосовували передпосівну інокуляцію насіння (табл.2). Таблиця 2 Вплив передпосівної Інокуляції насіння на нагромадження основних елементів живлення рослинами сої сорту Кріпиш, середнє за 1996-1998 роки Варіант Без інокуляції (контроль) Enterobacter ntmipressuralis 32-3 Найменша істотна різниця НІР05 Без інокуляції (контроль) Enterobacter nimipressuralis 32-3 Найменша істотна різниця НІР05 мг/г Вміст Р 2 О 5 приріст, % Фон: cj)ІТИН 4,6 5,9 0,25 Фон: ортофосфат кальцію 3,6 5,1 0,36 Подібні результати одержані і при передпосівній інокуляції суспензією Enterobacter nimipressuralis 32-3 насіння ячменю ярого сорту Одеський 100 (розрахункова доза інокулюму 2,0х103 бактерій/насінину). Висота рослин ячменю, що вирощені на фоні фітину, зростала на 25%, нагромадження наземної біомаси - на 6%, біомаси коренів - на 13%, загальної біомаси — на 8% в порівнянні з контрольним варіантом. За умов вирощування ячменю на фоні ортофосфату кальцію одержані такі показники: висота рослин % Вміст N.% приріст, % 1,5бП 28 12 1,75 0,09 46 1,67 1,90 0,11 14 зростала на 6%, нагромадження сухої надземної маси — на 9% сухої маси коренів - на 4%, загальної" сухої" маси - на 9% (табл.З), Таким чином, передпосівна інокуляція насіння суспензією шт.32-3, при вирощуванні ячменю ярого на фоні важкорозчинних фосфатів, сприяє зростанню висоти рослин на 6-25%, нагромадженню сухо"! надземної маси на 6-9%, сухої маси коренів - на 4-13%, сухої" загальної маси рослин на 8-9% в порівнянні з контрольними рослинами. Таблиця З Вплив передпосівної інокуляції насіння на ріст і продуктивність ячменю ярого сорту Одеський 100, середнє за 1996-1998 роки Висота Варіант Без інокуляції (контроль) Enterobacter nimipressuraiis 32-3 Найменша істотна різниця НІР05 Без інокуляції (контроль) Enterobacter nimipressuralis 32-3 Найменша істотна різниця HIPos CM % Фон: фітин 70,1 100 88,0 125 4,0 Фон: ортофосфат кальцію 73,9 100 78,3 106 6,1 Передпосівна Інокуляція насіння позитивно вплинула також і на нагромадження основних елементів живлення в біомасі рослин ячменю. Так, при вирощуванні на фоні фітину вона сприяла зростанню вмісту Р2О5 на 24%, вмісту N - на 8%; на фоні ортофосфату кальцію відмічено дещо менші показники - нагромадження Р2О5 в біомасі інокульованих рослин зросло на 15%, вміст N в біомасі рослин практично не змінився при порівнянні з контрольним варіантом (табл.4). Таким чином, аналіз результатів вегетаційних дослідів показав, що застосування передпосівної Суха маса п'яти рослин корені загальна надземна г г % % г % 8,1 816 0,4 100 106 2,2 2.5 0,25 100 113 10,3 11,1 7,3 8,0 0,5 100 109 2.1 2,2 0,2 100 104 9 4 Г 100 10,2 109 100 108 інокуляції насіння суспензією Enterobacter nimipressuraiis 32-3 сприяє достовірному зростанню висоти і сухої біомаси рослин сої та ячменю ярого при вирощуванні їх на фоні важкорозчинних органічних t мінеральних фосфатів. Одержані результати свідчать про те, що відбувається більш енергійне засвоєння фосфору важкорозчинних сполук інокульованими рослинами: нагромадження P2Os в залежності від виду рослин зростає на 24-28% на фоні фітину та на 15-46% на фоні ортофосфату кальцію. 3203 Таблиця 4 Нагромадження основних елементів живлення рослинами ячменю ярого сорту Одеський 100, середнє за 1996-1998 роки Варіант Без інокуляції (контроль) Enterobacter mmipressuraiis 32-3 Найменша істотна різниця НІРоз Без інокуляції (контроль) Enterobacter nimipressuralis 32-3 Найменша істотна різниця HIPos % Вміст N,% приріст, % Фон: фітин 1,28 1,39 0,05 Фон. ортофосфат кальцію 1,47 1,46 Дослідження, що були проведені з метою розкриття механізму дії бактерії Enterobacter nimipressuralis 32-3, показали її спроможність в процесі метаболізму продукувати органічні кислоти або лужну фосфатазу (в залежності від середовища культивування). Дослідження штаму бактерій у заявленій корисній моделі проілюстровано графічним матеріалом. На фіг. 1 показана динаміка рН культурального середовища, у якому присутні вуглеводи (глюкозо-аспарагінове), при культивуванні Enterobacter nimipressuralis 32-3 з утворенням органічних кислот і підкислення середовища, де І - контроль; II - інокуляція. В перші дні культивування (третя шоста доба) - значення рН культуральної рідини мало відрізнялось від рН стерильного поживного середовища (контроль), на дев'яту добу воно знизилось до 5,3, а на дванадцяту і п'ятнадцяту до 5,0. Дослідження, що були проведені по визначенню якісного складу кислот, які утворюються при культивуванні Enterobacter nimipressuralis 32-3, виявили в культуральній рідині (середовище Козера) янтарну кислоту. Таким чином, одним з аспектів механізму дії бактерії Enterobacter mmipressuraiis 32-3 є її здатність до продукування органічних кислот при утилізації вуглеводів. Утворені кислоти сприяють розчиненню малорозчинних неорганічних фосфатів і перетворенню "їх в доступні для рослин форми. % Вміст РгО5 приріст, % 8 0,42 0,52 0,04 24 -1 0,38 0,44 0,05 15 На фіг.2 показана динаміка активності лужної фосфатази, яку продукує бактерія Enterobacter nimipressuralis 32-3, де І - без субстрату, II - з додаванням субстрату. В лабораторних дослідах було вивчено здатність Enterobacter nimipressuralis 32-3 продукувати ферменти, що беруть участь в розкладі важкорозчинних органофосфатів, а саме, лужної фосфатази при культивуванні бактерії на МПБ з додаванням субстрату (фітат Са-Мд) та без субстрату. Аналіз одержаних результатів свідчить про те, що Enterobacter nimipressuralis 32-3 має здатність до продукування лужної фосфатази. Вже на третю добу культивування в культуральній рідині виявлена невелика кількість лужної фосфатази - 3-4 одиниць активності U/1. Активність зростала повільно при культивуванні на середовищі без субстрату і досягала 13 LJ/1 на дванадцяту добу культивування. Внесення субстрату (фітат СаМд) в поживне середовище ініціювало активність лужної фосфатази, що продукує Enterobacter nimipressuralis 32-3. Таким чином, одним з аспектів механізму дії ефективного штаму Enterobacter nimipressuralis 32-3 є його здатність продукувати лужну фосфатазу. Саме завдяки цьому явищу пояснюється можливість засвоювати важкорозчинні органічні фосфати інокульованими рослинами. 3203 10 Фіг. 2 Комп'ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 37 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601