Спосіб визначення орієнтовної терапевтичної дози лікарського препарату рослинного походження

Спосіб визначення орієнтовної терапевтичної дози лікарського препарату рослинного походження, який полягає утому, що досліджуваний препарат приготовляють, використовують експеримен Винахід відноситься до фармакологи, зокрема, може використовуватись при визначенні терапевтичних доз нових лікарських препаратів рослинного походження Ліки З лікарських рослин завдяки складному біологічному вмісту відрізняються різнобічним впливом на більшість патогенетичних ланок захворювань та помірною дією, складають сприятливий метаболічний фон для уникнення побічних ефектів чи ускладнень при необхідності застосування ЛІКІВ потужної дії (Лікарські рослини Енциклопедичний довідник/ за ред A M Гродзінського К УРЕ -1991 -С 8-22, І С Чекман Фітотерапія в науковій і КЛІНІЧНІЙ медицині // Фітотерапія в Україні - 1999 - № 3-4 - С 5-9, RF Weiss, V Fmtelmann / Lehrbuch der Phytotherapie - Hyppokrates Verlad, Stuttgart -1999 -S 7-22) Такі ліки є майже незамінними для профілактичного і протирецидивного лікування, оскільки мають велику терапевтичну широту дії, низьку токсичність і високу безпечність застосування (V Schuiz, R Hansel Rationale Phytotherapie - Springer Verlad, Berlin, 1999 - S 18-27) Тому у розвинутих країнах, зокрема в Німеччині, велика увага надається вивченню та створенню ЛІКІВ З лікарських рослин (Rote Liste - Editio Cantor, Frankfurt/Mem - 1997 501 s) Загальноприйнятими у СВІТІ стандартами до слідницьких програм з вивчення нових ЛІКІВ Є ета тальну тварину, спостерігають за показником впливу препарату на тварину, значенням якого характеризують дію препарату, який відрізняється тим, що досліджуваний препарат приготовляють як його розведення, експериментальну тварину використовують у системі in vitro, а як показник впливу препарату застосовують ступінь гальмування препаратом швидкості аскорбатзалежного переокиснення ендогенних ЛІПІДІВ печінки експериментальної тварини, при цьому орієнтовну терапевтичну дозу препарату розраховують при такому значенні його розведення, яке викликає відсоток гальмування 28-32%, а розрахунок проводять шляхом множення цього значення розведення на коефіцієнт екстраполяції 6-Ю3 пи дослідження біологічного вмісту, фармакологічний, токсикологічний та КЛІНІЧНИЙ ПІСЛЯ першого етапу найбільш відповідальними є фармакологічні дослідження з визначенням лікувальної, а в окремих випадках, і профілактичної доз Згідно З вимогами фармакопеї останнього видання (Государственная фармакопея СССР М Медицина - 1990 - с 163-165) загальними принципами визначення лікувальних доз препаратів рослинного походження є біологічні методи Стандартними зразками слугують спиртові екстракти з рослин, виготовлені згідно з фармакопейними вимогами Вони випробовуються на різних біологічних об'єктах жабах, голубах, кішках, кроликах, білих мишах, мікроорганізмах Визначаються біологічні одиниці дм в одному мілілітрі досліджуваного препарату, які відраховуються від визначеної таким способом смертельної дози Зазначений ПІДХІД має ряд недоліків використовуються різні біологічні об'єкти (кішки, голуби, щури тощо), що утруднює стандартизацію визначеної біологічної дози та екстраполяцію отриманих результатів на людину, характеризується різними методологічними підходами (введення розчинів досліджуваних ЛІКІВ ПІД шкіру, в порожнину шлуночків серця, внутрішньовенно), великою трудоємністю, довготривалістю, проблемами утримання біологічних об'єктів і забезпечення їх необхідного фізіологічного стану, особливо за сучасних умов 00 42298 екологічної нестабільності довкілля та прогресуючого ослаблення біологічних об'єктів, дороговизною Відомий "Способ определения активности противоаллергического иммуноглобулина" (ас СРСР № 1388797, G01 N33/15, публ БИ №14, 1988), за яким внутрішньовенно сенсибілізують експериментальних тварин досліджуваним засобом, потім через деякий час підраховують КІЛЬКІСТЬ померлих тварин Якщо виживають усі тварини, то засіб вважають активним У додаткових групах тварин засіб вводять зменшеними дозами та також слідкують за тваринами Спосіб дає можливість виявити найбільш активні серії препарату, зменшити його лікувальні дози Однак відомий спосіб потребує велику КІЛЬКІСТЬ експериментальних тварин, що робить спосіб дуже коштовним та довготривалим За прототип обрано "Способ скрининга фитопрепаратов с протавосудорожной активностью" (ас СРСР № 1386898, G01 N33/15, публ БИ №13, 1988), згідно з яким препарат вводять експериментальним тваринам та спостерігають за ВІДПОВІДНИМ показником (антикоразоловим індексом), препарат вводять впродовж декількох діб За значенням цього показника визначають активність препарату Однак спосіб за прототипом потребує також використання великої КІЛЬКОСТІ експериментальних тварин, є довгостроковим та не дає можливості визначати терапевтичні дози препарату для людини В основу винаходу поставлено задачу створення такого способу, який дозволить визначити орієнтовні терапевтичні дози препарату, прискорити, спростити та здешевшити процес дослідження препарату Задача вирішується тим, що спосіб визначення орієнтовної терапевтичної дози лікарського препарату рослинного походження, який полягає у тому, що досліджуваний препарат приготовляють, використовують експериментальну тварину, спостерігають за показником впливу препарату на тварину, значенням якого характеризують дію препарату, згідно з винаходом, досліджуваний препарат приготовляють як його розведення, експериментальну тварину використовують у системі in vitro, а як показник впливу препарату застосовують відсоток гальмування препаратом швидкості аскорбатзалежного переокиснення ендогенних ЛІПІДІВ печінки експериментальної тварини, при цьому орієнтовну терапевтичну дозу препарату розраховують при такому значенні його розведення, яке викликає відсоток гальмування 28-32%, а розрахунок проводять шляхом множення цього значення розведення на коефіцієнт екстраполяції 6-Ю3 Відомо, ЩО В ОСНОВІ будь-якої патології лежать порушення структури і функції клітинних мембран активними формами кисню (В А Барабой, Д А Сутковой Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии / Под общ ред ЮА Зозули - К Чернобыльинтеринформ -1997 - Ч І -120 с ) Протидією активним формам кисню і продуктам їх взаємодії з ліпідами та бюполімерами (пероксидами) виступає антиоксидантна система клітини До складу останньої входять як специфічні ферменти, так і низькомолекулярні сполу ки (фенольні антиоксиданти, сірковмісні сполуки, вітаміни А, Е, С) Всі ці сполуки певним чином взаємодіють між собою, що дозволяє стверджувати про системну організацію антиоксидантної системи клітини Співвідношення прооксидантнихта антиоксидантних систем визначає так званий оксидантно-антиоксидантний статус організму Порушення цього статусу призводить до характерних змін - синдрому пероксидацм, який включає деструкцію клітинних мембран, інактивацію і трансформацію ферментів, порушення процесів поділу клітини тощо і є важливим патогенетичним фактором виникнення захворювань Майже у всіх лікарських рослинах та їх настоянках (екстрактах) містяться вітаміни, каротиноїди, флавоноїди, амінокислоти, ненасичені жирні кислоти, які проявляють антиоксидантні властивості і є "пастками" вільних радикалів кисню Тому для визначення орієнтовної терапевтичної дози лікарських препаратів рослинного походження і використовується така їх антиоксидантна властивість Антиоксидантні властивості лікарських засобів досліджують за відсотком гальмування швидкості аскорбатзалежного переокиснення ендогенних ЛІПІДІВ (ПОЛ) гомогенатів печінки експериментальних тварин Тому дослідження проводяться на експериментальній тварині, а саме, на її печінці, яка максимально відображає біологічні процеси у людини, з використанням універсального неспецифічного явища патологічних процесів - порушення антиоксидантного захисту Печінка обрана об'єктом дослідження у зв'язку з и особливою роллю в існуванні живих організмів В ній, як в головній "лабораторії" здійснюється синтез необхідних організму речовин, знешкодження ендогенних метаболітів, які утворюються в нормі і патології (в даному випадку - вільних радикалів і активних форм кисню), та метаболічне перетворення компонентів з'їденої їжі, прийнятих ЛІКІВ тощо В печінці утворюються основні, і в найбільшій КІЛЬКОСТІ, речовини з антиоксидантними властивостями (наприклад, глутатюн, білірубін) Такий показник як вміст малонового альдегіду (кінцевий продукт ПОЛ) характеризує швидкість аскорбатзалежного ПОЛ Щоб його визначити достатньо приготувати необхідне розведення (концентрацію) препарату, приготувати гомогенат печінки експериментальної тварини та провести дослідження реакції (тобто дослідження провести в системі in vitro) Численні експерименти з співставлення відсотку гальмування ПОЛ з затвердженими МОЗ України інструкціями до досліджуваних препаратів щодо дозового їх застосування показали, що діапазон відсотку гальмування ПОЛ коливається в межах 28-32% Спроби призначити досліджувані рослинні препарати людям в дозах, що відображали вищий відсоток гальмування ПОЛ ніж 32% давали небажані побічні ефекти, не давали можливості реалізувати процес лікування, а призначення доз, що відображали нижчий, ніж 28% гальмування ПОЛ не дозволяли досягти необхідного терапевтичного ефекту Тобто визначення терапевтичної дози досліджуваного препарату необхідно проводити при досягненні відсотку гальмування ПОЛ значень 28-32% Оскільки визначення орієнтовної терапевтичної дози препарату для людини проводять на пе 42298 ЧІНЦІ експериментальної тварини, то необхідно співставляти печінку тварини та печінку дорослої людини, тобто провести екстраполяцію Це досягається шляхом множення значення розведення досліджуваного препарату, при якому спостерігається відсоток гальмування ПОЛ 28-32%, на коефіцієнт екстраполяції 6-Ю3, що також підтверджено численними експериментами Таким чином, перелічені суттєві ознаки та зв'язки між ними дозволяють здійснити запропонований спосіб та просто, швидко, дешево і точно визначити орієнтовну терапевтичну дозу досліджуваного препарату Спосіб здійснюють так Експериментальних тварин (щурів) забивають декапітацією під легким ефірним наркозом, швидко відбирають печінку, заморожують і на льоду готують 5%-ний гомогенат, використовуючи 50мМ трис-НСІ-буфер (рН 7,4), що містить 12 мкмоль солі Мора В центрифужну пробірку вносять 0,7 мл буфера, 0,1 мл аскорбінової кислоти (20 мг/10 мл буферу), 0,2 мл препарату відомої концентрації, 1 мл 5%-го гомогенату печінки та шкубують в термостаті ЗО хвилин при 37°С У контрольні проби замість розчину препарату додають 0,2 мл буферу Реакцію зупиняють додаванням 2 мл 10%-оі трихлороцтовоі кислоти Для визначення початкового рівня малонового альдегіду реакцію зупиняють одразу ж до інкубації Проби центрифугують (1500 об/хв, 10 хвилин) і в надосадовій рідині визначають вміст малонового альдегіду - одного з кінцевих продуктів пероксидного окиснення ЛІПІДІВ Для цього в хімічну пробірку вносять 2 мл центрифугату, 2 мл 0,8%-го розчину тюбарбітурової кислоти і 10 хвилин нагрівають в киплячій водяній бані Оптичну густину рожевого хромогену, що утворився, визначають спектрофотометрично при довжині хвилі 532 нм і розраховують КІЛЬКІСТЬ малонового альдегіду з використанням його коефіцієнту молярної екстинцм 1,56x105 М 1 хсм 1 Про швидкість процесів ПОЛ судять за різницею оптичної густини проб дота після інкубації Після ЦЬОГО, ВИХОДЯЧИ З відсотку гальмування ПОЛ та відповідної концентрації препарату, розраховують його дози (у мл та краплях) Терапевтичною дозою препарату буде та, яка відповідає відсотку гальмування 28-32% Спосіб підтверджується такими експериментальними прикладами Приклад 1 Визначались дози відомого і достатньо апробованого КЛІНІЧНОГО препарату - ноотропілу - за дослідженням його антиоксидантних властивостей Ноотропіл (Piracetam) (за інструкцією) призначають при ІНВОЛЮЦІЙНИХ синдромах, пов'язаних з віком, мозкових ударах і недостатності мозкового кровообігу, хронічному алкоголізмі та привиканні до медикаментів, пост травматичних синдромах, важких комах травматичного або токсичного походження, педіатричному лікуванні Препарат вибірково діє на довгастий мозок, покращує асоціаційні функції Він підвищує енергетичний обмін клітин головного мозку, розширює їх потенційні нейрофізіологічні можливості Ноотропіл практично нетоксичний, він не має ні збудливих, ні заспокійливих властивостей і не впливає на нейровегетативні функції Встановлено, що ноотропіл проявляє виражені антиоксидантні властивості В системі in vitro препарат гальмує швидкість аскорбатзалежного ПОЛ печінки щурів у широких межах - від 10 8 М до 10 1 М (284-10 2-284-104 г ноотропілу в інкубаційному середовищі) (табл 1) Максимальний відсоток гальмування ПОЛ (31,4%) спостерігався при концентрації препарат у Ю 4 М, що відповідала 284х10 7 г ноотропілу в пробі (з врахуванням молекулярної маси речовини) Така КІЛЬКІСТЬ препарату проявляла антиоксидантну дію в системі in vitro, в якій знаходилося (за методикою описаною вище) 50 мг печінки Організм дорослої людини має печінку масою в середньому 1,5 кг (1500000 мг) У перерахунку на таку масу печінки дорослій людині необхідно (284x10 7х х1500000 50=852x10 3 г =852 мг) 852 мг ноотропілу У інструкції до препарату, затвердженого МОЗ України, рекомендовано для лікування 2 капсули по 400 мг тричі на день, що відповідає розрахованій за способом КІЛЬКОСТІ препарату Отже, використаний спосіб визначення in vitro антиоксидантних властивостей ноотропілу та екстраполяції отриманих результатів для визначення його ефективних доз відповідає разовій терапевтичній дозі, що рекомендується за інструкцією Приклад 2 Екстракт родіоли рідкий містить р-сітостерин, флавоноїди (кверцетин, кемпферол, пперозид), фенольний глікозид, салідрозид, антраглікозиди, дубильні речовини, ефірні олії, органічні кислоти, марганцю, цинку, кадмію, хрому та інших кофакторів ферментних систем, попередників простагландинів (Лікарські рослини Енциклопедичний довідник / за ред А М Гродзинського - К УРЕ, 1991 с 377-378) Гальмування ПОЛ фармакопейним екстрактом родіоли рожевої спостерігали вже при розведенні 10 (22,6%) (табл 2) За методикою досліджень 0,2 мл екстракту у розведенні 10 5 гальмує ПОЛ 50 мг печінки (додається в пробу) Для організму дорослої людини (у перерахунку на середню масу печінки дорослої людини 1,5 кг = 1500000 мг) за розрахунками необхідно 0,06 мл екстракту родіоли (0,2x10 5х1500000) 50=6000x5x10 5=0,06 мл екстракту Тобто у загальному вигляді значення розведення препарату, помножене на коефіцієнт екстраполяції дози антиоксидантних властивостей рідкого препарату in vitro на разову дозу дорослого організму, який дорівнює 6-Ю3, дасть КІЛЬКІСТЬ рідкого препарату (у мл) За запропонованим способом розрахунку антиоксидантних властивостей in vitro на разову дозу для цілого організму розрахована і представлена в табл 2 КІЛЬКІСТЬ препарату для кожного випадку (відсотку гальмування ПОЛ) Відзначено, що 30% гальмування ПОЛ in vitro (0,3 мл або 10 крапель чистого екстракту родіоли рожевої) відповідають офіційним рекомендаціям разової дози препарату За інструкцією до екстракту (реєстраційний номер РП 96/372/14 від ЗО 05 1996) рекомендується для застосування з лікувальною метою по 5-10 крапель 2-3 рази на день за 15-30 хвилин до вживання їжі Курс лікування 10-20 днів 42298 Приклад 3 Визначення орієнтовних доз настоянки арніки гірської за результатами дослідження її антиоксидантних властивостей Арніка гірська використовується в акушерській та гінекологічній практиці як кровоспинний та протизапальний, у гастроентерології - як жовчогінний, тонізуючий при атонічних запорах засіб, у неврологи - як засіб, що розширює мозкові судини Відновлено промислове виробництво спиртової настоянки з суцвіть арніки, проводиться розробка нових лікарських препаратів на основі екстрактивних речовин з цієї рослини (З П Костенникова, Г А Панова Оценка качества настойки арники горной по биологически активным веществам // Фармация -1984 -Т 33, №1 -С 72-74) Основними діючими речовинами арніки є специфічні псевдогваяноліди, сесквітерпенові лактони азуленового ряду геленалінацетат, арніколіди А та С, арніфолін, дитерпенові сполуки, ефірні олії, дубильні речовини, мінеральні солі та ІНШІ біологічно активні чинники Найбільше вивченим серед них є арніфолін, вміст якого обрано за одиницю концентрації настоянки Фармакопейна настоянка арніки, яку використовували для досліджень, містила 521 мг арніфоліну на 100 мл настоянки Дослідження антиоксидантних властивостей настоянки арніки показало, що цей препарат володіє вираженими антиоксидантними властивостями навіть при порівнянно невисоких концентраціях (табл 3) Так, гальмування індукованого ПОЛ в системі in vitro спостерігалося вже при розведенні препарату в 106 разів Розведення настоянки 10 4 призводило до гальмування ферментативного ПОЛ на 31,1%, що у перерахунку на 1,5 кг печінки (у дорослої людини) відповідало 0,6 мл чистої настоянки (22 краплі) За інструкцією до препарату (реєстраційний номер П/98/16/12 від 26 06 1998) для застосування з лікувальною метою призначають по 30-40 крапель 2-3 рази на день, що перевищує розраховану запропонованим способом разову дозу препарату на 38% Отже, дослідження антиоксидантних властивостей настоянки арніки гірської в системі in vitro виявило широкий діапазон її антиоксидантних властивостей На відміну від ноотропілу препарати складного біологічного вмісту з підвищенням концентрації проявляли СИЛЬНІШІ антиоксидантні властивості - чисті препарати викликали повне гальмування ПОЛ Приклад 4 Екстракт елеутерококу рідкий Кореневище і корені містять елеутерозиди А, В, С, Д, Е, ПОХІДНІ кумаринів, мікроелементи, флавоноїди, рослинний віск, глюкозу, пектини тощо (Лікарські рослини Енциклопедичний довідник / за ред А М Гродзинського - К УРЕ, 1991 - С 377-378, Справочник по лекарственным растениям / Соколов С Я , Замотаев И П - М Медицина, 1985 - С 39-40) Відсоток гальмування ПОЛ екстрактом елеутерококу 28,9% спостерігали при розведенні 1,5х10 4 (табл 4) За перерахунками на масу печінки дорослої людини (1,5 кг) необхідно 0,9 мл чистого екстракту (ЗО крапель) Згідно з інструкцією (реєстраційний номер 96 44 7/74331 72 від 26 10 1995) рекомендовано для застосування по 20-30 крапель 2-3 рази на день за ЗО хв до вживання їжі Курс лікування 25-30 днів Отже, розраховані дози препаратів відповідають офіційним рекомендаціям МОЗ України, що свідчить про надійність та достовірність запропонованого способу визначення орієнтовної терапевтичної дози препарату рослинного походження Таблиця 1 Вплив ноотропілу на швидкість аскорбатзалежного ПОЛ (M±m, n=7) Розведення препарату, г 0 284x10 и 284x10 " 284x10 Іи 284x10 У 284x10 й 284x10' 284x10 b 284x10 D 284x10 4 Малоновий альдегід (мкмоль/1 г тканини за ЗО хв) 68,0±3,2 64,39±1,9 62,2±2,1* 58,3±2,3* 52,6±2,4* 50,3±2,0* 46,6±2,6* 51,2±1,7* 58,3±1,8* 64,42±2,1 Примітка * - вірогідні зміни у порівнянні з контролем (без препарату), р