Імунобіологічний засіб у формі пінного аерозолю для лікування дерматологічних захворювань інфекційної етіології

1. Імунобіологічний засіб у формі пінного аерозолю для лікування дерматологічних захворювань інфекційної етіології, що містить водний розчин комплексу бактеріофагів та консервант, який відрізняється тим, що водний розчин комплексу бактеріофагів має літичну активність по відношенню до Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgapis. не менше 10-5; для Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae не менше 10-4 за Аппельманом, а засіб містить додатково олію рослинну, емульгатори першого і другого роду та пропелент при наступному співвідношенні компонентів (мас. %): U 2 (19) 1 3 механізми резистентності, а висока селективність дії не порушує балансу нормальної мікрофлори. Відомі комплекси бактеріофагів рідких [1], які представляють собою стерильні фільтрати фаголізатів штамів стафілококів, стрептококів, протея, клебсієл, синьогнійної та кишкової паличок, які є найчастішими збудниками гнійно-запальної патології; консервант - хінозол. Недоліками існуючої рідкої форми є те, що вона при використанні на рановій поверхні швидко розтікається, висихає та інактивується, не зручна при місцевому використанні. Також розчин комплексу бактеріофагів має невеликий термін зберігання 1 рік при температурі 5±2°С. Відома також гелева лікарська форма медичного імунобіологічного препарату з водним розчином стафілококового бактеріофагу [2], яка містить в якості активних агентів один вид бактеріофагу, розподіленого у полімері або полімерах (гідрофільна високомолекулярна сполука, що розбухає у воді) та консервант. Препарат призначений для лікування зовнішніх і внутрішніх гнійно-запальних захворювань, викликаних патогенними стафілококами. Відомий лікарський засіб не має широкого спектру дії по відношенню до патогенної мікрофлори, оскільки містить лише бактеріофаги одного виду стафілококові, тому використовується лише при інфекціях, викликаних стафілококами. Завданням корисної моделі є створення нового імунобіологічного засобу у формі пінного аерозолю для лікування дерматологічних захворювань інфекційної етіології, який шляхом використання одного розчину комплексу бактеріофагів, активних у відношенні широкого спектру патогенних мікроорганізмів, та завдяки розробці складу емульсійної системи пінного аерозольного препарату у заданій якісній та кількісній сукупності компонентів забезпечує високу пролонговану, пенітраційну дію піни та її виражену ефективність при лікуванні дерматологічних захворювань, викликаних змішаною інфекційною мікрофлорою. Поставлене завдання вирішується таким чином, що імунобіологічний засіб у формі пінного аерозолю для лікування дерматологічних захворювань інфекційної етіології, що містить водний розчин комплексу бактеріофагів та консервант, у відповідності з корисною моделлю вміщує водний розчин комплексу бактеріофагів, який має літичну активність по відношення до Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgapis. не менше 10-5; для Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae не менше 10-4 за Аппельманом, крім того, засіб містить додатково олію рослинну, емульгатори першого і другого роду та пропелент при наступному співвідношенні компонентів (мас. %): Водний розчин комплексу бактеріофагів 82,5-94,9 Олія рослинна 3,0-7,0 Емульгатор першого роду 1,0-5,0 Емульгатор другого роду 1,0-5,0 Консервант 0,1-0,5 Пропелент 10,0-30,0 58815 4 Корисною моделлю також передбачено, що заявлений засіб переважно містить олію оливкову, в якості емульгаторів першого і другого роду - полісорбат-80 та віск емульсійний відповідно, а як пропелент - хладон-134а та/або хладон-12. Оптимальний варіант заявленого засобу містить компоненти при співвідношенні (мас. %): Водний розчин комплексу бактеріофагів 84,8 Олія оливкова 5,0 Полісорбат-80 2,0 Емульсійний віск 3,0 Ніпагін та/або ніпазол 0,2 Хладон-134а та/або хладон-12 20,0 Використання комплексу бактеріофагів у формі водного розчину у складі заявленого засобу дозволяє отримати препарат з активністю відносно Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgapis. не менше 10-5; а для Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae не менше 10-4 за Аппельманом, без попереднього отримання концентрату бактеріофагів, що є економічно більш доцільним та обумовлює зменшення баластних речовин, які накопичуються внаслідок концентрування бактеріофагів і можуть спричиняти алергічні реакції. У процесі виготовлення пінного аерозолю важливу роль відіграє утворення стабільної емульсійної системи. Дослідним шляхом було визначено, що для заявленого засобу емульсійна система має складатися з олії рослинної та емульгаторів першого і другого роду, взятих у заданому співвідношенні. У оптимальному варіанті бажано використовувати олію оливкову, полісорбат-80 та віск емульсійний у кількості 5,0 мас.%, 2,0 мас.%, та 3,0 мас.% відповідно. Заявлений якісний та кількісний склад емульсійної системи забезпечує її стабільність і утворення стійкої піни, необхідної для підвищення лікувальної дії заявленого засобу шляхом утримування на уражених ділянках шкіри водного розчину комплексу бактеріофагів. Підбір певного типу та кількості пропеленту дозволив отримати пінній аерозоль з високими споживчими характеристиками, а також поліпшити умови та збільшити термін зберігання засобу. Бажано використовувати в якості пропеленту для заявленого засобу хладон-134а та/або хладон-12. Експериментальним шляхом було доведено, що оптимальними консервантами для заявленого засобу, як і для прототипу, є ніпагін та/або ніпазол. Кількісний вміст всіх компонентів заявленого засобу визначений експериментальним шляхом і є найбільш прийнятним для досягнення ефективної фармакологічної дії, а також забезпечення високих властивостей пінного аерозолю як лікарської форми. Корисну модель здійснюють наступним чином. Для приготування заявленого засобу використовують розчин комплексу бактеріофагів з титром для Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris. не менше 10-5; а для Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae не менше 10-4 за Аппельманом. Зважену кількість емульгатору першого роду (полісорбат-80) та консерванту гомогенізують при 5 температурі 45±2°С, додають розплав олії оливкової та емульгатора другого роду (емульсійний віск), гомогенізують при температурі 55±2°С. Отриману однорідну суміш стерилізують та охолоджують до температури 55-60°С. Окремо підігрівають розчин комплексу бактеріофагів до температури 55±2°С. При постійному перемішуванні та температурі не вище 55±2°С розчин комплексу бактеріофагів змішують з розплавом олії оливкової, консерванту та емульгаторів, емульгують при 250 об/хв. протягом 15 хв. Потім ємність з емульсією вміщують у баню з холодною водою та продовжують емульгувати з тією ж швидкістю протягом 10 хв. до охолодження емульсії до 25±1°С. Після отримання емульсії мішалку вимикають. Отриману емульсію контролюють візуально на однорідність та за показниками якості емульсії. Контроль здійснюють періодично через кожні 15 хв. ведення процесу. Одержану емульсію білого з жовтуватим відтінком кольору (колір спричинений забарвленням розчину комплексу бактеріофагів), без запаху, рідкої консистенції фасують у скляні медичні аерозольні балони, вкриті шаром захисного покриття на основі полімеру, місткістю 30 та/або 60 мл, герметизовані клапанами безперервної дії та насадкою натискного типу, додають пропелент. Корисна модель ілюструється прикладами: Приклад 1 2,0 г емульгатору першого роду - полісорбату80 та 0,2 г консерванту - ніпазолу змішували при температурі 45°С до отримання однорідної маси. Окремо 5,0 г олії оливкової та 3,0 емульгатору другого роду емульсійного воску розплавляли до однорідної маси при температурі 55°С і при постійному перемішуванні ввели суміш полісорбату80 та ніпазолу до отримання однорідної маси. До отриманої суміші додавали при постійній гомогенізації підігрітий до 55°С розчин комплексу бактеріофагів (84,8 г). Отриману суміш гомогенізували зі швидкістю 250 об/хв. протягом 15 хв. до отримання однорідної маси. Таким чином одержу 58815 6 вали емульсію з комплексом бактеріофагів наступного складу (г): Водний розчин комплексу бактеріофагів 84,8 Олія оливкова 5,0 Полісорбат-80 2,0 Емульсійний віск 3,0 Ніпазол 0,2 Одержану емульсію білого з жовтуватим відтінком кольору (колір спричинений розчином комплексу бактеріофагів), без запаху, рідкої консистенції розфасовували у скляні медичні аерозольні балони, вкриті шаром захисного покриття на основі полімеру, місткістю 30 мл, герметизували клапанами безперервної дії та насадкою натискного типу. У балони додавали під тиском хладон-134а. Приклад 2 Антимікробну активність заявленого засобу у формі пінного аерозолю вивчали у дослідах in vitro за стандартними методиками: методом Аппельмана та методом «колодязів». Метод Аппельмана полягає у вивченні ступеня десятикратного розведення, що викликає лізис тест-культур. Метод «колодязів» полягає у дифузії лікарського засобу крізь товщу агара, що викликає зони затримки росту тест-культур, в якості яких були обрані: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619, Proteus vulgaris ATCC 6896, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae TK 11B. В якості препарату порівняння був використаний водний розчин комплексу бактеріофагів «Секстафаг» [3]. Піну білого кольору для досліджень одержували з аерозольного балону, який містить емульсію типу олія/вода (О/В) з комплексом бактеріофагів та пропелент. Перед використанням аерозольний балон енергійно струшували, забезпечуючи тим самим диспергування гідрофобного пропелента у концентраті - емульсії О/В. Отриману піну руйнували за допомогою центрифуги лабораторної ОПМ-8 при 1500 об/хв. протягом 5 хв. Рідину, отриману після центрифугування, використовували при вивченні антимікробної активності. Результати дослідів наведено в таблиці 1. Таблиця 1 Вивчення антимікробної активності заявленого засобу у порівнянні з «Секстафагом» Метод визначення активності Аппельмана Staphylococcus aureus Метод дифузії в агар, (АТСС 25923) мм Аппельмана Streptococcus pneumoniae (АТСС Метод дифузії в агар, 49619) мм Аппельмана Proteus vulgaris Метод дифузії в агар, (ATCC6896) мм Аппельмана Escherichia coli (ATCC Метод дифузії в агар, 25922) мм Тест-культура Антимікробна активність Заявлений засіб «Секстафаг» 10-(5.8±0.8) 10-(5.8±0.6) 19,3±0,7 19,2±0,6 -(5.3±0.8) 10 10-(5.5±0.4) 17,8±0,6 17,8±0,9 -(5.2±0.6) 10 10-(5.0±0.5) 17,2±0,3 17,0±0,7 -(5.2±0.6) 10 10-(5.2±0.3) 17,5±0,4 17,5±0,8 7 58815 8 Продовження таблиці 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Klebsiella pneumoniae (TK 11B) Аппельмана Метод дифузії в агар, мм Аппельмана Метод дифузії в агар, мм 10-(4.8±0.3) 10-(4.7±0.4) 15,2±0,7 15,2±0,9 -(4.2±0.3) 10 10-(4.2±0.3) 14,7±0,8 14,8±0,6 Примітки: n=6; Р=95; М±m - довірчий інтервал. Дані експериментальних досліджень свідчать, що заявлений пінний засіб на основі комплексу бактеріофагів має високий титр та дифузійну активність відносно лабораторних штамів мікроорганізмів. Активність за методом Аппельмана для заявленого засобу та препарату порівняння - розчину комплексу бактеріофагів є практично однаковою, що свідчить про високий титр бактеріофагів всіх видів. Антимікробна активність, виміряна методом дифузії в агар, для заявленого засобу, також не поступається розчину комплексу бактеріофагів, що свідчить про збереження активності віріонів бактеріофагів після введення до складу заявленого засобу. Таким чином, можна зробити висновок, що розроблений засіб за активністю не поступається препарату порівняння - розчину комплексу бактеріофагів. Це свідчить про перспективність застосування заявленого засобу для лікування гнійних захворювань, спричинених відповідними штамами мікроорганізмів. Приклад 3 Дослідження з вивчення лікувальної антимікробної дії заявленого засобу проводили у дослідах in vivo на моделі змішаної гнійної інфекції у білих мишей, викликаної штамами стафілококу золотавого (Staphylococcus aureus) та синьогнійної палички (Pseudomonas aeruginosa), що є найчастішими збудниками гнійно-запальних інфекцій. В якості препаратів порівняння використовували пінний препарат «Олазоль» [4] (виробник «Стома», Україна) та за прототипом розчин комплексу бактеріофагів «Секстафаг» [3] (виробник «Мікроген», Росія), які використовували як аналоги за фармакологічною дією. Для відтворення гнійної рани на депільовану ділянку шкіри дослідних мишей підшкірно вводили стандартизовану суміш добових агарових культур золотавого стафілококу та синьогнійної палички у співвідношенні 1:2. Через 48 годин після зараження на ділянці введення культур розвивались гнійно-некротичні рани. Дослідних тварин було поділено на 4 групи по 8 тварин: група інтактного контролю (нелаковані тварини), група тварин, які одержували відповідно заявлений засіб та препарати порівняння. Препа рати наносили на рани два рази на добу, щодня, протягом усього курсу лікування до повного загоєння. В якості критеріїв оцінки ефективності лікування та активності досліджуваних засобів було обрано мікробіологічний показник ранового вмісту (КУО) та площу рани (мм2). Результати проведеного дослідження наведені у табл. 2. Проведене дослідження показало, що у групі тварин інтактного контролю протягом експерименту відмічалась затримка зменшення титру мікробної контамінації ран і прогресування гнійнонекротичного процесу, про що свідчить висока летальність тварин біля 50% (табл. 2). У групі тварин, яких лікували заявленим засобом, вихідний вміст мікроорганізмів ранового ексудату був дуже високим: 1,2·106-3,5·106 КУО для S. aureus, та 0,5·106-1·106 КУО для P. aeruginosa. Після 3-ої доби лікування вміст КУО обох культур знизився на 4 порядки та складав: 1,3·102-2,1·102 3 3 КУО для культури S. aureus та 1,1·10 -2·10 КУО для культури Р. aeruginosa. На 6-ту добу від початку лікування у висівах ранового вмісту спостерігалась відсутність культур мікроорганізмів S. aureus та P. aeruginosa і повне загоєння рани. Лікування розробленим заявленим засобом та пінним препаратом «Олазоль» дали практично однакові результати. Але, із табл. 2 видно, що в групі лікування «Олазолем» зменшення титру КУО у гнійному ексудаті було дещо меншим у порівнянні з групою тварин, лікування яких відбувалося заявленим засобом. При лікуванні розчином комплексу бактеріофагів очищення та загоєння гнійної рани відбувалося дещо пізніше, про що свідчать показники бактеріологічного вмісту ранового ексудату та летальності тварин (табл. 2). Це пов'язано з розтіканням розчину та його інактивації внаслідок висихання. Спираючись на проведені дослідження, можна зробити висновок, що заявлений засіб виявив виражену лікувальну дію на моделі гнійної рани змішаної етіології, яка не поступається існуючому пінному препарату «Олазоль» та дещо перевищує лікувальну ефективність розчину комплексу бактеріофагів. 9 58815 10 Таблиця 2 Результати вивчення протимікробної дії заявленого засобу на моделі гнійної інфекції у мишей, викликаної Staphylococcus aureus і Pseudomonas aeruginosa КУО в 1 мл гнійного ексудату Кількість Кількість Умови досліду День лікуванПлоща рани, тварин, загиблих Staphylococcus Pseudomonas 2 (групи тварин) ня мм шт тварин, шт aureus aeruginosa 1 2 3 4 5 6 7 Вихідні дані 8 – – м.о. 1·109/мл м.о. 1·109/мл 1-й 8 – 3,66±0,16 1,5·107-3,3·107 2·107-3,5·107 2-й 8 – 5,56±0,19 3-й 6 2 6,48±0,26 3·106-6,5·106 0,1·107-0,5·107 4-й 6 – 6,76±0,14 5-й 5 1 6,12±0,13 1,9·106-4,5·106 1,5·106-2·106 6-й 5 – 6,44±0,29 Інтактний контроль 7-й 4 1 7,16±0,11 0,2·106-1,0·106 2,5·105-4·105 8-й 4 – 6,58±0,20 9-й 3 1 6,04±0,17 0,9·105-2,5·105 1·104-2·104 10-й 3 – 5,15±0,15 11-й 3 – 4,57±0,40 Дослідження не про- Дослідження не про12-й 3 – 4,23±0,14 водилися водилися 13-й 3 – 4,08±0,14 9 Вихідні дані 8 – – м.о. 1·10 /мл м.о. 1·109/мл 1-й 8 – 3,14±0,29 1,2·106-3,5·106 0,5·106-1·106 Заявлений 2-й 8 – 2,74±0,19 засіб 3-й 8 – 2,19±0,19 1,3·102-2,1·102 1,1·102-2·102 4-й 8 – 1,58±0,21 5-й 7 1 0,59±0,18 6-й 7 – – Вихідні дані 8 – – м.о. 1·109/мл м.о. 1·109/мл 1-й 8 – 3,67±0,30 1,1·106-2·106 0,5·106-1·106 2-й 8 – 2,72±0,20 Олазоль 3-й 8 – 2,10±0,23 3,5·104-5·104 1,5·104-2·104 4-й 8 – 1,62±0,22 5-й 8 – 1,00±0,11 120 – 6-й 7 1 – 9 Вихідні дані 8 – – м.о. 1·10 /мл м.о. 1·109/мл 1-й 8 – 3,50±0,17 1,7·106-2·106 1·106-1,5·106 2-й 8 – 3,08±0,21 3-й 8 – 4,12±0,14 2,1·105-4,5·105 5,5·104-6·104 4-й 8 – 4,80±0,21 Розчин комплексу бакте5-й 7 1 5,69±0,19 0,8·103-2·103 0,2·103-0,8·103 ріофагів 6-й 7 – 4,17±0,10 7-й 7 – 3,38±0,14 120-500 50-230 8-й 7 – 1,83±0,14 9-й 6 1 1,06±0,05 – – 10-й 6 – – Примітка. n=8, Р=90 Таким чином, заявлено імунобіологічний засіб у формі пінного аерозолю на основі водного розчину комплексу бактеріофагів, який є високоактивним у відношенні широкого переліку штамів патогенних мікроорганізмів. Заявлений засіб відрізняється збільшенням термінів зберігання до 2 років та розширенням температурного діапазону зберігання. Джерела інформації: 1. Компендиум Лекарственные препараты 2006. Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова, Киев, "Морион", 2006, т.1, с. 165. 2. Патент 46446, Україна, МПК 2009 А61К 9/06, А61К 35/66, А61Р 17/0, заявл. 09.06.2009, опубл. 25.12.2009, Бюл. №24. 11 58815 3. Инструкция по применению «Секстафага». №01-11/186-05 от 27.10.2005г. Производитель ФГУП «НПО «Микроген», Россия. Комп’ютерна верстка М. Ломалова 12 4. Компендиум Лекарственные препараты 2006. Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова, Киев, "Морион", 2006, т.ІІ, с. 1034. Підписне Тираж 23 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601