Спосіб експрес-визначення змін фізико-хімічних властивостей мембран тромбоцитів у хворих з судинною патологією головного мозку

Спосіб експрес-визначення змін фізикохімічних властивостей мембран тромбоцитів у хворих з судинною патологією головного мозку, що включає введення в досліджувані мембрани набору флуоресцентних зондів, реєстрацію спектрів їх флуоресценції, проведення математичної обробки спектральних даних, який відрізняється тим, що в мембрани вводять набір мультипараметричних флуоресцентних зондів з різною локалізацією в ліпідному бішарі мембран, який включає 2-феніл9,10-фенантр-1,3-оксазол і ряд ортогідроксипохідних 2,5-діарил-1,3,4-оксазолу і 2,5діарил-1,3,4-оксадіазолу, на спектрофлуориметрі 3 використанню цього способу дослідження ліпідного складу тромбоцитів в діагностичних цілях. Крім того, обговорюваний спосіб не дозволяє зробити висновок про локалізацію патологічних змін у різних областях мембран тромбоцитів. Відомі способи оцінки ліпідного складу тромбоцитів, що ґрунтуються на оцінці активації в них перекисного окиснення ліпідів [7]. Спосіб полягає в тому, що збільшення вмісту холестеролу в мембранах тромбоцитів призводить до зростання числа місць зв'язування для ендопероксидів [8]. Стан вільнорадикального окиснення ліпідів в мембранах тромбоцитів оцінюється за вмістом у них малонового діальдегіду [9], дієнових кон'югатів (ДК) [10] і шифових основ [11]. Недоліками цього способу є: - значні затрати часу, обумовлені специфікою біохімічного аналізу, і порівняно висока трудомісткість біохімічного аналізу; - спосіб не дозволяє робити висновок про локалізацію патологічних змін у різних областях мембран тромбоцитів. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб визначення змін фізико-хімічних властивостей ліпопротеїнів крові й мембран різних клітин методом флуоресцентних зондів [11, 12], що включає введення в досліджувані мембрани набору флуоресцентних зондів, реєстрацію спектрів їх флуоресценції, проведення математичної обробки спектральних даних і знаходження залежності виміряних спектральних параметрів від патології гіпертонічного або атеросклеротичного ґенезу. Положення й інтенсивність смуг флуоресценції цих зондів залежать від параметрів навколишнього середовища молекул зондів: від його полярності, в'язкості, здатності до утворення міжмолекулярних водневих зв'язків. Спосіб включає введення в досліджувані мембрани мультипараметричних флуоресцентних зондів АНС і ДМХ, реєстрацію спектрів їх флуоресценції, проведення математичної обробки спектральних даних, яка полягає в тому, що за спектрами визначають інтенсивності флуоресценції (F) зондів на довжинах хвиль: 470 нм для АНС і 500 нм для ДМХ, за зменшенням F470 для АНС і за збільшенням F500 для ДМХ порівняно з аналогічними параметрами, виміряними для контрольних мембран даного виду з низьким вмістом холестеролу, роблять висновок про зміну вмісту холестеролу в мембранах. Основним недоліком застосування ДМХ для моніторингу мембран тромбоцитів є те, що цей зонд слабо й повільно проникає в мембрани тромбоцитів, у зв'язку з чим спостерігається дуже низький рівень інтенсивності флуоресценції, що не дозволяє використовувати цей зонд у масових медико-біологічних дослідженнях мембран тромбоцитів; Також, у ході застосування АНС для моніторингу мембран тромбоцитів не виявлено чутливості флуоресцентних параметрів зонда до специфічних змін цих мембран при гіпертонічній хворобі й атеросклерозі; Крім того, зонди АНС і ДМХ локалізуються в області полярних голівок фосфоліпідів ліпідного 65766 4 бішару, отже, застосування цих зондів не дозволяє проводити моніторинг змін в інших, більш гідрофобних, областях ліпідних мембран: в області гліцеринових залишків фосфоліпідів, в області метиленових ланцюжків фосфоліпідів і в центрі ліпідного бішару. В основу корисної моделі поставлено задачу створення такого способу визначення змін фізикохімічних властивостей мембран тромбоцитів у хворих з судинною патологією головного мозку різного генезу, який, за рахунок використання набору інших мембранних зондів, дозволить проводити експрес-моніторинг змін у всіх областях ліпідного бішару мембрани тромбоцита, точніше встановити локалізацію змін у ліпідному бішарі, підвищити достовірність визначення змін у мембранах тромбоцитів за рахунок зіставлення даних для зондів з різною локалізацією в ліпідному бішарі мембран. Для вирішення поставленої задачі в способі, прийнятому за найближчий аналог, який включає введення в досліджувані мембрани набору зондів з різною локалізацією в ліпідному бішарі мембран, реєстрацію спектрів флуоресценції, проведення математичної обробки спектральних даних і знаходження залежності виміряних спектральних параметрів від патології гіпертонічного або атеросклеротичного ґенезу, згідно з корисною моделлю, в мембрани вводять набір мультипараметричних флуоресцентних зондів з різною локалізацією в ліпідному бішарі мембран, який включає 2-феніл9,10-фенантр-1,3-оксазол і ряд ортогідроксипохідних 2,5-діарил-1,3,4-оксазолу і 2,5діарил-1,3,4-оксадіазолу, на спектрофлуориметрі реєструють спектри їх флуоресценції, після чого проводять математичну обробку спектральних даних, яка полягає в тому, що за даними спектрів визначають інтенсивності флуоресценції Fλ, для 2феніл-9,10-фенантр-1,3-оксазолу та 2-(2'-гідроксифеніл)-5-(4'-диметиламіно-феніл)-1,3,4оксадіазолу на довжині хвилі λ в діапазоні 375-450 нм, а також значення інтенсивності флуоресценції FB та FA інших зондів набору, відповідно, на довжинах хвиль А і Б діапазонів, де діапазон А знаходиться в межах 370-425 нм, а діапазон Б - в межах 450-600 нм, обчислюють відношення значень інтенсивності флуоресценції зондів FB/FА і за зміною інтенсивності флуоресценції Fλ, і відношень FB/FA у разі патології у хворого порівняно з аналогічними параметрами, виміряними для даного виду мембран за умов відсутності патологічних змін, роблять висновок про наявність судинної патології, її характер і стадію. Положення й інтенсивність смуг флуоресценції 2-феніл-9,10-фенантр-1,3-оксазолу залежить від полярності й в'язкості мікрооточення цього зонда. Орто-гідроксипохідні 2,5-діарил-1,3,4-оксазолу і 2,5-діарил-1,3,4-оксадіазолу здатні до ізомеризації у збудженому електронному стані з утворенням нормальної (N*) і таутомерної (Т*) форм [14]. Положення й інтенсивність смуг флуоресценції кожної з форм залежать від параметрів оточення їх молекул, таких, як в'язкість, полярність, і від здатності утворювати міжмолекулярні водневі зв'язки [15]. 5 У мембранах орто-гідроксипохідні 2,5-діарил1,3,4-оксазолу і 2,5-діарил-1,3,4-оксадіазолу локалізуються відповідно до ліпофільності зондів [16]: 2-(2'-ОН-феніл)-5-(4'-N(СН3)2-феніл)-1,3,4оксадіазол (зонд D7) - в області полярних голівок фосфоліпідів і в області гліцеринових залишків фосфоліпідів; 2-(2'-ОН-феніл)-5-феніл-1,3,4оксадіазол (зонд D1) - в області гліцеринових залишків фосфоліпідів; 2-(2'-ОН-феніл)-5-феніл-1,3оксазол (зонд О1О) - в області гліцеринових залишків фосфоліпідів і в області карбонільних груп фосфоліпідів; 2-(2'-ОН-феніл)-5-(4'-феніл-феніл)1,3-оксазол (зонд О6О) - в області карбонільних груп фосфоліпідів і в області метиленових ланцюжків фосфоліпідів; 2-(2'-ОН-феніл)-9,10-фенантр1,3-оксазол (зонд РН7) - в області метиленових ланцюжків фосфоліпідів і в центрі ліпідного бішару мембран; 2-феніл-9,10-фенантр-1,3-оксазол (зонд РН1) - у центрі ліпідного бішару мембран. Використання набору флуоресцентних зондів з різною локалізацією в ліпідному бішарі мембран для визначення змін фізико-хімічних властивостей мембран тромбоцитів у хворих з судинною патологією головного мозку дозволяє: - здійснювати моніторинг змін у всіх областях ліпідного бішару мембран; - точніше встановити локалізацію змін у ліпідному бішарі мембран; - підвищити достовірність визначення змін в мембранах за рахунок зіставлення даних для зондів із різною локалізацією у ліпідному бішарі мембран; - дозволяє скоротити час дослідження (час вимірювання кожного із зондів близько 2 хв.) і понизити трудомісткість аналізу за рахунок спрощення процедури підготовки зразка порівняно з існуючими біохімічними методами. Спосіб здійснюють таким чином. Кожний із флуоресцентних зондів набору (2феніл-9,10-фенантр-1,3-оксазол і ряд ортогідроксипохідних 2,5-діарил-1,3,4-оксазолу і 2,5діарил-1,3,4-оксадіазолу) додають у кількості 10 мкл до 2 мл суспензії мембран тромбоцитів за наявності судинної патології у вигляді ацетонітриль-4 ного розчину з початковою концентрацією 2×10 М. Кінцева концентрація зонда в суспензії дослі-6 джуваних мембран складе 1×10 М (молярне відношення ліпід/зонд складає 1000:1). Після 60хвилинної інкубації зразка із зондом вимірюють його спектр флуоресценції, вибираючи довжину хвилі збудження в області 330 нм. За отриманими спектрами флуоресценції визначають інтенсивності флуоресценції Fλ для 2феніл-9,10-фенантр-1,3-оксазолу та 2-(2'-гідроксифеніл)-5-(4'-диметиламіно-феніл)-1,3,4оксадіазолу на довжині хвилі λ в діапазоні 375-450 нм, а також значення інтенсивності флуоресценції FB та FA інших зондів набору, відповідно, на довжинах хвиль А і Б діапазонів, де діапазон А знаходиться в межах 370-425 нм, а діапазон Б - в межах 450-600 нм, обчислюють відношення значень інтенсивності флуоресценції зондів FB/FA і за зміною 65766 6 інтенсивності флуоресценції Fλ, і відношень FB/FA у разі патології у хворого порівняно з аналогічними параметрами, виміряними для даного виду мембран за умов відсутності патологічних змін, роблять висновок про наявність судинної патології, її характер і стадію. Приклад 1. Флуоресцентні зонди (2-феніл-9,10-фенантр1,3-оксазол і ряд орто-гідроксипохідних 2,5-діарил1,3,4-оксазолу і 2,5-діарил-1,3,4-оксадіазолу) розчиняли в ацетонітрилі до початкової концентрації -4 кожного із зондів 2×10 М. 10 мкл ацетонітрильного розчину зонда додавали до 2,0 мл суспензії тромбоцитів хворих на церебральний атеросклероз. Флуоресцентні зонди інкубували з тромбоцитами протягом 60 хв. і реєстрували спектри флуоресценції зондів в області 340-600 нм на спектрофлуориметрі Hitachi F4010 (Японія) за ширини щілин монохроматорів збудження і флуоресценції 5 нм і 5 нм, відповідно, та довжині хвилі збудження 330 нм. Після цього з отриманих спектрів флуоресценції знаходили значення інтенсивності флуоресценції зонда D7 на довжині хвилі 435 нм, значення інтенсивності флуоресценції зонда РН1 на довжині хвилі 385 нм і значення інтенсивностей флуоресценції інших зондів (D1, О1О, О6О, РН7) на довжинах хвиль А і Б, які вибирали при 410 і 500 нм відповідно. Для зондів D1, 010, 060, РН7 обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції F500/F410. Аналогічні вимірювання виконували для зразків мембран тромбоцитів у людей без судинної патології, знаходили значення інтенсивності флуоресценції для D7 на 435 нм, значення інтенсивності флуоресценції для РН1 на 385 нм, значення інтенсивностей флуоресценції інших зондів (D1, O1O, О6О, РН7) при 410 і 500 нм й обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції F500/F410. За різницею відповідних величин інтенсивностей флуоресценції D7, РН1 і відповідних величин відношень F500/F410 зондів D1, О1О, О6О, РН7 для контрольних мембран і для мембран хворих на церебральний атеросклероз оцінювали порушення структури мембран тромбоцитів і локалізацію цих змін у ліпідному бішарі мембран. Отримані результати фіксували в табл. 1 і табл. 2. Обстежено 16 хворих на церебральний атеросклероз: жінок - 9, чоловіків - 7, віком від 60 до 74 років. У хворих спостерігалися стабільно підвищені показники холестеролу (понад 5,2 ммоль/л) і ліпопротєїнів (рівень ЛПНП - понад 4,0 ммоль/л). Як контроль досліджувалися тромбоцити 8 людей (чоловіків - 5, жінок - 3, віком від 18 до 35 років) без судинної патології. Тромбоцити отримували з цитратної плазми (1:9) центрифугуванням при 1000 об/мін протягом 5 хв. з подальшим відмиванням фізіологічним розчином і повторним центрифугуванням за тих самих умов і диспергуванням у 0,15 М фосфатному буфері до кінцевої концентрації суспензії тромбоцитів, що має поглинання при довжині хвилі 405 нм, яке дорівнює 0,24-0,25. 7 65766 8 Таблиця 1 Інтенсивності флуоресценції Fλ зондів D7 і РН1, зв'язаних з мембранами тромбоцитів, у хворих з судинною патологією атеросклеротичного генезу і в контрольній групі Зонд D7 РН1 λ, нм контроль 382 275 435 385 Fλ, умовні одиниці атеросклероз 647 857 Таблиця 2 Відношення F500/F410 зондів D1, 010, О6О, РН7, зв'язаних з мембранами тромбоцитів, у хворих з судинною патологією атеросклеротичного генезу і в контрольній групі F500/F410 Зонд контроль 17,7 7,8 9,1 3,2 D1 О1О О6О РН7 Збільшення величин інтенсивностей флуоресценції зондів D7 і РН1 і збільшення величин відношень F500/F410 зондів D1, О1О, О6О, РН7 для мембран тромбоцитів хворих на церебральний атеросклероз порівняно з відповідними параметрами для контрольних мембран свідчить про зменшення протоноакцепторної здатності і/або полярності мікрооточення зондів в мембранах тромбоцитів хворих на церебральний атеросклероз унаслідок збільшення вмісту в них холестеролу в усіх областях локалізації зондів у ліпідному бішарі мембран. Приклад 2 Флуоресцентні зонди (2-феніл-9,10-фенантр1,3-оксазол і ряд орто-гідроксипохідних 2,5діарил-1,3,4-оксазолу [2,5-діарил-1,3,4оксадіазолу) розчиняли в ацетонітрилі до почат-4 кової концентрації кожного із зондів 2×10 М. 10 мкл ацетонітрильного розчину зонда додавали до 2,0 мл суспензії тромбоцитів хворих на гіпертонічну хворобу, інкубували 60 хв. і реєстрували спектри флуоресценції зондів, як описано в прикладі 1. З отриманих спектрів флуоресценції знаходили значення інтенсивності флуоресценції зонда D7 на довжині хвилі 435 нм, значення інтенсивності флуоресценції зонда РН1 на довжині хвилі 385 нм і значення інтенсивностей флуоресценції інших зондів (D1, O1O, О6О, РН7) на довжинах атеросклероз 52,9 17,2 11,7 7,7 хвиль А і Б, які вибирали при 410 і 500 нм відповідно. Для зондів D1, O1O, О6О, РН7 обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції F500/F410. Аналогічні вимірювання виконували для зразків мембран тромбоцитів у людей без судинної патології, знаходили значення інтенсивності флуоресценції для D7 на 435 нм, значення інтенсивності флуоресценції для РН1 на 385 нм, для інших зондів (D1, 010, 060, РН7) обчислювали відношення інтенсивностей флуоресценції F500/F410. За різницею відповідних величин інтенсивностей флуоресценції D7, РН1 і відповідних величин відношень F500/F410 зондів D1, О1О, О6О, РН7 для контрольних мембран і для мембран хворих на гіпертонічну хворобу оцінювали порушення структури мембран тромбоцитів і локалізацію цих змін у ліпідному бішарі мембран. Отримані результати фіксували в табл. 3 і табл. 4. Обстежено 14 хворих на гіпертонічну хворобу II стадії: жінок - 9, чоловіків - 5, віком від 60 до 74 років, цифри артеріального тиску складали від 165/95 мм.рт.ст. до 200/110 мм.рт.ст. в період кризових станів. Як контроль досліджувалися тромбоцити 8 людей (чоловіків - 5, жінок - 3, віком від 18 до 35 років) без судинної патології. Зразки тромбоцитів готували до вимірювань, як описано в прикладі 1. Таблиця 3 Інтенсивності флуоресценції Fλ зондів D7 і РН1, зв'язаних з мембранами тромбоцитів, у хворих з судинною патологією гіпертонічного генезу і в контрольній групі Зонд D7 РН1 Fλ, нм 435 385 Fλ, умовні одиниці контроль 382 275 гіпертонія 84 120 9 65766 10 Таблиця 4 Відношення F500/F410 зондів D1, О1О, О6О, РН7, зв'язаних з мембранами тромбоцитів, у хворих з судинною патологією гіпертонічного генезу і в контрольній групі Зонд D1 O1O О6О РН7 F500/F410 контроль 17,7 7,8 9,1 3,2 Зменшення величин інтенсивностей флуоресценції зондів D7 і РН1 і зменшення величин відношень F500/F410 зондів О6О, РН7 для мембран тромбоцитів хворих на гіпертонічну хворобу в порівняно з відповідними параметрами для контрольних мембран свідчить про збільшення протоноакцепторної здатності і полярності оточення молекул зондів у мембранах тромбоцитів хворих на гіпертонічну хворобу в результаті змін у зовнішніх шарах мембран (в області гліцеринових залишків фосфоліпідів), які призводять до збільшення їх полярності (наприклад, унаслідок збільшення гідратації), що створює перешкоди для проникнення зондів усередину мембран. Збільшення величин відношень F500/F410, що спостерігається для зондів D1, O1O, було віднесено до можливого накопичення холестеролу в області гліцеринових залишків фосфоліпідів і в області карбонільних груп жирнокислотних ланцюгів фосфоліпідів. Як випливає з прикладів, запропонований набір зондів є чутливим до змін фізико-хімічних властивостей мембран тромбоцитів, викликаних цереброваскулярними порушеннями гіпертонічного і атеросклеротичного генезу. Джерела інформації: 1. Ильинский Б.В. Профилактика, ранняя диагностика и лечение атеросклероза. - М.: Медицина, 1977. - 166 с. 2. Replacement of renal function by dialysis. th 5 Ed. - Edited by Walter H. Horl, Kluwer Academic Publishers. - 2004-1606 P. 3. Реминяк И.В., Бойко Т.П. Изменение липидного состава мембран тромбоцитов у больных с сосудистой патологией гипертонического и атеросклеротического генеза // Український вісник психоневрологи - 1999. - Т. 7, вип. 4 (22). - c. 1416. 4. Vercaemst R., Union A., Rosseneu M. Biomedical Sciences and Applications. Separation and quantitation of free cholesterol and cholesteryl esters in a macrophage cell line by highperformance liquid chromatography // J Chromatography B: - 1989. - Vol. 494. - P. 43-52. 5. Bartlett G.R. Phosphorus Assay in Column Chromatography // J Biol Chem.-1959. - Vol. 234. P. 466-469. 6. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) // Под ред. гіпертонія 50,8 15,1 6,3 2,4 М.И.Прохоровой. - Л. - Изд-во ЛГУ.-1982. - С. 5480. 7. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Полякова В.А. К механизму связи перекисного окисления липидов и гемостаза // Научный вестник ТГМА. 1999. - 1. c. 10-14. 8. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Дементьева И.А. Тромбоциты (состав, функции биомедицинское значение). - Тюмень, 1996. - 144 с. 9. Стальная И.Д., Горишвили Т.Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - М: Медицина - 1977. - c. 6668. 10. Стальная И.Д. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных кислот // Современные методы в биохимии - М: Медицина 1977. - c. 63-64. 11. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Canadian Journal of Biochemitry and Physiology. - 1959. - Vol. 37. - P. 911-912. 12. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. - М.: Наука, 1980. - 320 с. 13. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. - М.: Наука, 1989. - 263 с. 14. Дорошенко А.О., Посохов Е.А., Шершуков В.М., Митина В.Г., Пономарев О.А. Реакция внутримолекулярного переноса протона в возбужденном состоянии в ряду ортогидроксипроизводных 2,5-диарилоксазола // Химия высоких энергий. - 1997. - Т.31, № 6. - c. 395402. 15. Doroshenko A.O., Posokhov E.A., Verezubova A.A., Ptyagina L.M., Skripkina V.T., Shershukov V.M. Radiationless deactivation of the excited phototautomer form and molecular structure of ESIPT-compounds // Photochemical and. Photobiological Sciences. - 2002. - Vol. 1. - P. 9299. 16. Посохов Е.А., Бойко Т.П., Абманова Н.А., Бойко Т.П., Дорошенко А.О. Орто-гидрокси производные 2,5-дифенил-1,3-оксазола и 2,5дифенил-1,3,4-оксадиазола в качестве флуоресцентных зондов для медико-биологических исследований // Вестник Харьковского университета. Химия. - 2001. - Вып. 7 (30), № 532. - c. 192-194. 11 Комп’ютерна верстка В. Мацело 65766 Підписне 12 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601