Спосіб моделювання пошкодження геному епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота

Реферат: UA 69928 U UA 69928 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до стоматології, і може бути використана для експериментального вивчення процесів, що відбуваються при пошкодженні геному епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота, розробки і визначенні найбільш ефективних способів запобігання запаленню слизової оболонки порожнини рота при наявності пошкодження геному епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота. Зі всіх видів покривного епітелію клітини слизової оболонки порожнини рота (СОПР) значною мірою схильні до дії постійних пошкоджувальних факторів - механічних, термічних, токсичних, бактеріальних. Фізіологічний стан та протизапальний захист СОПР підтримується швидким постійнім відновленням шару епітелію та продукцією місцевих захисних антимікробних та антитоксичних протеїнів. Темп розмноження росткового шару епітелію СОПР достатньо високий (тривалість клітинного циклу - до 24 годин. Для 80 % популяції епітеліоцитів СОПР, що діляться, тривалість життя - 44-50 годин [Hamilton A.I., Blackwood H. // J. Anat.-1974. - V. 117. - № 2. - P. 313-327]. Постійне злущування пошкоджених та колонізованих мікробами епітеліоцитів - основа збереження фізіологічного стану СОПР. Тільки при зриву клітинного циклу та синтезу захисних протеїнів розкриваються процеси "другої лінії захисту" - запалення. Таким чином, порушення функції геному епітеліоцитів (клітинного циклу та синтезу білків) становлять саме ранні передумови до розвитку запальних захворювань пародонта та СОПР. В останній час в навколишньому середовищі значно підвищилась кількість екотоксикантів, зокрема пестицидів, що викликають патогенний вплив на організм людини. У ряді таких сполук була встановлена генотоксична активність, до яких належать поліхлоровані ароматичні вуглеводні. Дані сполуки інгібують апоптоз клітин, визначають мутагенну активність. Найбільш розповсюдженим є ДДТ 4,4-дихлордифеніл-трихлорметилметан. Основним його метаболітом, що вказує вплив, є ДДЕ (2,2-біс(4-дихлорфеніл)-2-дихлоретилен). Раніше в наших роботах при дослідженні епітеліотропних ефектів генотоксикантів було показано, що ароматичні вуглеводні (поліхлорбіфеніли та фенобарбітал) викликають підвищення рівня патологічних мітозів, пошкодження хромосом [Моисеев И.Н., Воскресенский О.Н., … Ткаченко Е.К./ Досягнення біології та медицини.-2003. - № 2. - с. 48-53]. Регуляція мітотичної активності в органах та тканинах тварин в процесі життєдіяльності досягається присутністю та взаємодією регуляторів та інгібіторів мітозів. В тканинах суттєву роль відіграє баланс апоптозу та проліферації, внаслідок чого відбувається їх відновлення. Якщо має місце дисбаланс у протіканні цих процесів - відбувається накопичення пошкоджених клітин, які викликають розвиток запалення або пухлинної трансформації. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб моделювання пошкодження геному епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота шляхом перорального введення генотоксиканту, за рахунок чого стає можливим підвищення рівня патологічних мітозів, створюються умови для пошкодження епітеліоцитів СОПР: накопичення і виникнення запалення або пухлинної трансформації, що дозволяє отримати модель пошкодження геному епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота, максимально наближену до реальної, для розробки способів профілактики і лікування стоматологічної патології. Поставлена задача вирішується тим, що у способі моделювання пошкодження геному епітеліоцитів слизової оболонки порожнини рота, згідно з корисною моделлю, тваринам перорально вводять розчин ДДЕ (2,2-біс(4-дихлорфеніл)-2-дихлоретилен) у персиковій олії, фірми Acros organics, USA в дозі 3,5 мг/кг маси тіла щурів 5 разів на тиждень у продовженні 35 діб. Введення розчину ДДЕ створює умови пошкодження епітеліоцитів СОПР порушує баланс процесів апоптозу та проліферації у тканинах слизової оболонки порожнини рота. Експерименти проведені на 15 білих щурах-самцях 1-міс. віку, маса тварин на початку експерименту була 62±3,3 г. Всі тварини отримували стандартний раціон віварію: 1 група інтактна (7 щурів); 2-й групі щурів (8 особин) перорально вводили розчин ДДЕ - основного метаболіту ДДТ 4,4-дихлордифеніл-трихлорметилметан фірми Acros organics, USA (розчин ДДЕ у персиковій олії) в дозі 3,5 мг/кг маси тіла щурів 5 разів на тиждень у продовженні 35 діб. Після виведення тварин з дослідів в них відсікали шматочки слизової оболонки щоки, фіксували у формаліні й містили в парафін. Зрізи товщиною близько 10 мкм фарбували гематоксиліном і еозином, а також обробляли по Эйнарсону [Меркулов Г.А. Курс патологической техники.-1969. - Л.-423 с.]. Отримані препарати використовували для оглядових морфологічних та морфометричних досліджень. При малому збільшенні мікроскопа визначали коефіцієнт ерозії епітелію (КЕЕ). Для цього при малому збільшенні мікроскопа вимірювали за допомогою окулярного мікрометра довжину ділянок зовнішнього ушкодження епітеліального 1 UA 69928 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 шару й визначали, яку частку становить зона ушкодження стосовно довжини всього епітелію (в ум. од.). Це дозволяло оцінювати стан епітелію в цілому. Використовуючи стереометричний метод "полів", визначали процентне співвідношення зон, що включають шари епітелію й складаються із клітин (ЗКШ) і зони його рогового шару (ЗРШ) [Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина.-1990.-384 с.]. Ці показники дозволяли глибше оцінити зміни, що проходили в процесі експерименту усередині епітелію. Продовжуючи заглиблюватися в оцінку стану епітелію, при великому збільшенні мікроскопа визначали ще два показники. У його паростковій зоні підраховували кількість клітин з фігурами мітозу в базальному й шипуватому шарах епітелію й обчислювали мітотичний індекс (МІ), як процентне співвідношення кількості клітин, що діляться, до загальної кількості врахованих клітин паросткової зони епітелію в полі зору при мікроскопії. Подібним способом визначали також і процентний вміст двоядерних епітеліоцитів (ДЕ) у складі шару шипуватих клітин епітелію слизової оболонки. Для оцінки реакції сполучної тканини власної пластинки слизової оболонки, використовуючи стереометричні підходи, розраховували коефіцієнт стенозу судин (КСС). Для цього визначали яку частину (в ум. од.) становила площа стінки судини мікроциркуляторного русла до площі його просвіту. Цей показник об'єктивно характеризував спрямованість судинної реакції й ступінь її виразності. Слизова оболонка щоки інтактних щурів має чітко виражену двошарову будову. Зовні її покриває багатошаровий плоский роговіючий епітелій, у якому добре видні окремі шари клітин. Базальний шар епітелію складається з високих призматичних клітин, частина з яких перебуває в стані розподілу. Ядра клітин базального шару мали чітко виражений рисунок хроматину, були добре видні ядерця. Цитоплазма відносно однорідна, характеризується помірною базофілією. Шипуватий шар містить клітини полігональної форми, які мають великі й відносно світлі ядра. Зустрічалися поліплоїдні клітини, що містять звичайно по два ядра, приблизно, однакового розміру й внутрішньої будови. Цитоплазма клітин здебільшого однорідна й слабкобазофільна. При відділенні від базального шару, розмір клітин шипуватого шару зменшувався, вони усе більше витягалися уздовж епітеліального шару. Ядра таких клітин також здобували витягнуту форму. Ближче до рогового шару цитоплазма клітин ставала зернистою: виявлялися базофільні гранули кератогіаліну. Зернистий шар мав невелику товщину й переходив у роговий шар, що був представлений чисельними, щільно спресованими роговими пластинками. Роговий шар, помірний по товщині, звичайно чітко фіксувався в клітинних шарах епітелію. Місцями в роговому шарі зустрічалися ділянки невеликих розшарувань, зрідка попадалися невеликі зони руйнування зовнішньої поверхні цього шару. Однак, такі прояви не були характерними для загальної структури епітелію, про що свідчить досить невелике значення коефіцієнта ерозії епітелію (табл. 1). Власна пластинка слизової оболонки представлена пухкою волокнистою сполучною тканиною, що містить велику кількість дрібних кровоносних судин, серед яких переважали капіляри. Кровоносні судини були помірковано розширені, клітини в їхній стінці не мали видимих ознак набрякання. Периваскулярний набряк не виражений. Клітини сполучної тканини різноманітних видів розташовані відносно рівномірно. Серед них переважали фібробласти й фіброцити. Волокна міжклітинної речовини розташовані рівномірно, приблизно однакової товщини. У щурів контрольної групи, яким на тлі дієти віварію вводили токсикант ДДЕ, були відзначені особливості морфологічної картини слизової оболонки щоки. Так, виявлялася неоднорідність структури епітелію в різних його ділянках. В одних місцях уздовж шару епітелію картина окремих його шарів зовні відповідала описаним раніше у тварин інтактної групи, а в інших відзначалися зміни. Частіше зустрічались ділянки розшарування й часткової відсутності рогового шару. Глибина ерозій епітелію також змінювалась в різних місцях. На цьому тлі природним виглядав ріст значення коефіцієнта ерозії епітелію (табл. 1). Співвідношення ушкодженого епітелію до дослідженого (в ум. од.) збільшилося в 4,5 разу (р=0,009) (табл. 1). Таблиця 1 Коефіцієнт ерозії епітелію (КЕЕ) слизової оболонки щоки щурів (М±m; p) Групи тварин Інтактна Контрольна (ДДЕ) Епітелій ушкоджений / Епітелій досліджений (ум. од.) 0,06±0,01 0,27±0,05 / р=0,009 2 UA 69928 U 5 10 У базальному шарі структурні компоненти клітинних ядер і цитоплазми виглядали трохи розмитими й більше поліморфними, ніж у інтактних тварин. Частина клітин базального шару мали набряклі ядра й ознаки початкової дистрофії в цитоплазмі. Як і раніше зустрічалися клітини, що діляться як у базальному шарі, так і в сусідньому - шипуватому. В останньому клітини виглядали зміненими. Це проявлялося в розходженні їхніх розмірів на одному рівні з базальною мембраною. Зустрічалися скупчення укрупнених клітин із проясненої й частково вакуолізованою цитоплазмою. Ядра таких клітин були збільшені, внутрішня картина ядра виглядала розмитою. Постійно зустрічалися клітини із двома ядрами. Були ділянки, де клітини були трохи розсунуті, імовірно, за рахунок перицелюлярного набряку. Ці морфологічні зміни дозволяють констатувати появу в епітелії яскравих проявів вакуолярної дистрофії, як результат дії, що ушкоджує, препарату ДДЕ. Морфометричне дослідження показали, що в епітелії зона клітинного шару (ЗКШ) істотно не змінювалася в порівнянні з інтактною групою (табл. 2). Зона рогового шару (ЗРШ) значно зменшувалася (в 1,3 разу; р=0,02) (табл. 2). 15 Таблиця 2 Морфометрія епітеліального шару слизової оболонки щоки. Об'ємні частки клітинних і рогових шарів (%) (М±m; р) Інтактна Групи тварин Контрольна (ДДЕ) 20 ЗКС (%) 39,3±1,4 41,2±1,6 ЗРС (%) 17,6±0,8 13,2±1,1 р=0,02 Більш істотно виглядали зміни кількості, що діляться, й двоядерних клітин. Дослідження показали, що мітотичний індекс (МІ) під дією токсиканту знижувався в 1,6 разу (р